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Fundamentos Bsicos para la Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Presentacin participantes

LIC. KELIM VANO H.

NOMBRE Empresa Experiencia en CG o UV-Vis Algun problema en esas tcnicas que quisiera resolver?
MESSEN, C.A.

JULIO, 2007

ALFREDO AVILA DAVILA


Licenciado en Qumica , ULA M Sc Ingeniera Industrial , UC
26 aos experiencia industrial
Ayudante Docente Anlisis Instrumental , ULA Jefe Anlisis Especiales INDESCA Jefe Anlisis Instrumental, RESIMON Jefe Calidad, BF GOODRICH Jefe Operaciones, IQC Qumico Desarrollo, DUPONT

REGLAS DEL CURSO

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Todas las ideas son importantes


Escuchar con atencin a los dems Participar con energa Todos enseamos-todos aprendemos No quedarse con dudas Otra regla?

LIC. KELIM VANO H. MESSEN, C.A. JULIO, 2007

HORARIOS
8:00

10:00
12:00 13:00

15:00
17:00

Inicio Refrigerio Almuerzo Sesiones de la tarde Refrigerio Salida

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

MENSAJE INICIAL

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Objetivo general
Adquirir los fundamentos bsicos que permitan la ejecucin de la calibracin en los espectrofotmetros UV-VIS y los Cromatgrafos.

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OBJETIVOS ESPECIFICOS
Reconocer los sistemas de medicin .

Seleccionar el material de referencia.


Reconocer el principio de calibracin. Identificar las fuentes de incertidumbre en la calibracin.

EN UV-VISIBLE Y CROMATOGRAFIA
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EJERCICIO INICIAL

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Identificar los elementos numerados 6

2 3 4 5

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CONCEPTOS LENGUAJE TECNICAS

HERRAMIENTAS

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Calibracin Verificacin Ajuste

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CALIBRACIN
Segn VIM

Conjuntos de operaciones que establecen, bajo condiciones especificadas, la relacin entre los valores de magnitudes indicados por un instrumento o sistema de medicin, o

valores representados por una medida


materializada o un material de referencia y los correspondiente valores realizados por

patrones

Verificacin
Segn Fund. y Vocb. SGC

Confirmacin mediante la

aportacin de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados

Ajuste
Segn VIM

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Operacin destinada a

poner un instrumento de medicin en estado de funcionamiento adecuado para su uso


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Fuente: Introduccion a la quimica analitica JULIO, 2007

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Fuente: Introduccion a la quimica analitica


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Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

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CALIBRACIN
Segn VIM

Conjuntos de operaciones que establecen, bajo condiciones especificadas, la relacin entre los valores de magnitudes indicados por un instrumento o sistema de medicin, o

valores representados por una medida


materializada o un material de referencia y los correspondiente valores realizados por

patrones

Donde quiera que las decisiones se basen en resultados analiticos, es

importante tener alguna indicacin de la calidad de los resultados y saber cuanta confianza podemos tener en ellos para el proposito del analisis

Medidas de aseguramiento de la calidad


Utilizar mtodos de analisis validados Uso de procedimientos internos de control de calidad definidos Participar en esquemas de ensayos interlaboratorios Acreditacion basada en ISO 17025 Establecer la trazabilidad de los resultados de medicin
Fuente:EURACHEM / CITAC Guide CG 4, http://www.eurachem.org

PRINCIPIO DE CROMATOGRAFIA

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LOS COMPONENTES DE LA MUESTRA SON TRANSPORTADOS POR LA FASE MOVIL A TRAVES DE LA FASE ESTACIONARIA Y SE DETECTAN A LA SALIDA DE LA COLUMNA

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PREGUNTA DE CROMATOGRAFIA DE GASES


EXISTE UNA RELACION ENTRE EL PUNTO DE

EBULLICION Y EL TIEMPO DE RETENCION?

SOLVENTES INDUSTRIALES SOLVENTE


1 3 4 5 6 7 8 9 10 12 15 18 17 19 METANOL ETANOL ACETONA ISO-PROPANOL CLORURO METILENO N-PROPANOL METIL-ETIL-CETONA 2-BUTANOL ACETATO DE ETILO ACETATO DE ISOPROPILO TOLUENO M-XILENO DIACETONA ALCOHOL CICLOHEXANONA
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PUNTO EBULLICION, C
64,5 78 56 82 42 97 80 108 77 88 110 139 166 156
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Por qu CAMBIA EL ORDEN?


LOS COMPUESTOS INDIVIDUALES SON RETARDADOS POR LA FASE ESTACIONARIA BASADOS EN ADSORCION SUPERFICIAL SOLUBILIDAD RELATIVA CARGA IONICA

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ALCOHOLES
TIEMPO RETENCION 2,15 2,68 4,44 7,9 13,81 16,13 18,21 20,11 ALCOHOL METANOL ETANOL 1-PROPYL 1-BUTANOL 1-HEXANOL 1-HEPTANOL 1-OCTANOL 1-NONANOL PUNTO EBULLICION 64,5 78 97 118 156 176 194 214

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ALCOHOLES 25 20 15 10 5 0 0 50 100 150 200 250 PUNTO EBULLICION, C

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TIEMPO RETENCION EN DB1, MINUTOS

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ALCOHOLES LINEALES EN DB1


y = 0.0288x2 + 2.1738x - 1.1269 R = 0.9874

25 TIEMPO RETENCION 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

NUMERO DE CARBONOS

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Principio de espectrofotometria
Algunos compuestos absorben

radiacin de una fuente y esta seal se puede medir La seal puede relacionarse con la concentracin del compuesto

Diagrama bsico espectrofotometra


Io

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Fuente de Energia

Sistema En estudio Tramitancia = I / Io Absorbancia = - log T A=bC

Informacin Analitica

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Pregunta de espectrofotometra
Existe una relacin de Absorbancia y

concentracin que sea util para determinar un analito en un rango de inters?

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Pregunta de espectrofotometria
CONCENTRACION ABSORBANCIA 0 0 0,25 0,27 0,57 0,51 0,68 0,84

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Fuente: Hach, Linear regresion

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Hierro como ferrozina

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Fuente: Fundamentals of spectrophotometry


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3 MINUTOS
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Algunos elementos
1 2 3 4 5 6 7 8 Concentracin Respuesta instrumental Cm: Limite de deteccin LOQ: Limite de Cuantificacion Rango dinamico LOL: Limite de linealidad Curva de calibracion

Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

2 4 3

5
1

Fuente: skoog, West, Chapter 1


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Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

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ERRORES
AL AZAR
Variaciones no predecibles

SISTEMATICOS
Variaciones predecibles

GROSEROS ( Espurios)
Fallas humanas o del instrumento,

que invalidan las medidas

Valoracion de 10,0 mL de NaOH 0,1 M con HCl 0,1 M

estudiante A B C D 10,08 9,88 10,19 10,04 10,11 10,14 9,79 9,98 10,09 10,02 9,69 10,02 10,10 9,80 10,05 9,97 10,12 10,21 9,78 10,04 Preciso, Sesgado Impreciso, insesgado Impreciso, sesgado Preciso, insesgado

promedio 10,10 10,01 9,90 10,01

d.s. 0,02 0,17 0,21 0,03

d.s.r 0,16 1,72 2,13 0,33

Fuente: Estadistica y Quimiometria para Quimica Analitica

RAZONES PARA RESULTADOS ANALITICOS ERRONEOS


Incompetencia
Errores de transcripcin o clculo Mtodo no adecuado

Contaminacin
Interferencias Errores de calibracin

Errores de muestreo
Perdidas o degradacin
Fuente: Quality assurance in Analytical chemistry

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COMO MEJORAR como calibrador?


COMPRENSION DE TRMINOS Informacin

Tcnicas
Llevar al dia a dia , con las limitaciones Procedimientos especificos

Actitud y disposicin
Familiarizarse Interpretar estadisticamente los resultados

Dudas de los jefes

Como evaluar el desempeo como

evaluador?

CUAL ES EL OBJETIVO DE LA VALIDACION?

DE ACUERDO A ICH
El objetivo de la validacin de un procedimiento analtico es demostrar que el mismo es adecuado para el propsito previsto

Fuente; ICH, Q2, 2005


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Proceso de validacin de un mtodo de ensayo


DEFINIR EL REQUERIMIENTO ANALITICO DESARROLLAR / IDENTIFICAR METODO CANDIDATO PLANEAR EXPERIMENTO DE VALIDACIN

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NO

REALIZAR EXPERIMENTO

DEFINICION DE VALIDACION

SI

CUBRE REQUISITOS ANALITICOS ?

USAR LOS DATOS PARA DEFINIR AJUSTE AL PROPOSITO

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Fuente: Quality assurance in Analytical chemistry JULIO, 2007

Procedimiento general de calibracin


PREPARACION

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EXTRACCION Y LIMPIEZA

PREPARAR ESTANDARES DE CALIBRACION

DETERMINACIO N

CALIBRACION

RESULTADOS
FUENTE: The Estimation of Uncertainty by the Utilization of Validation and Quality Control Data MESSEN, C.A. JULIO, 2007

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CARACTERISTICAS A VALIDAR
ESPECIFICIDAD
____________________

EXACTITUD

PRECISION

______________________

___________________

LIMITE DE LIMITE DE CUANTIFICACION LINEALIDAD DETECCION ____________________ ______________________ ___________________


RANGO
____________________

ROBUSTEZ

______________________

___________________

Fuente; ICH, Q2, 2005 Traduccion libre: Alfredo Avila Dvila

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ESPECIFICIDAD
CAPACIDAD DE EVALUAR SIN EQUIVOCACION EL

ANALITO EN PRESENCIA DE COMPONENTES QUE SE ESPERA ESTEN PRESENTES EN LA MUESTRA


IDENTIFICACION

PRUEBA DE PUREZA
CONTENIDO

50

EXACTITUD
CERCANIA ENTRE EL

VALOR ACEPTADO Y EL VALOR OBTENIDO

9 determinaciones tres niveles de concentracin Cubriendo el rango 98-102 % recuperacin


51

PRECISION
CERCANIA ENTRE LOS VALORES OBTENIDOS DE

UNA SERIE DE MEDICIONES OBTENIDAS DE MULTIPLES MUESTRAS DE LA MISMA MUESTRA HOMOGENEA


REPETIBILIDAD
PRECISION INTERMEDIA REPRODUCIBILIDAD

52

REPETIBILIDAD Precisin, misma condiciones, corto plazo Tres determinaciones ,tres niveles Intra-ensayo PRECISION INTERMEDIA Diferentes dias, analistas, equipos Intra-laboratorio REPRODUCIBILIDAD Entre-laboratorios

Reportar DS, DSR, IC


53

LIMITE DE DETECCION
Cantidad mas pequea de analito , en una muestra,

que puede ser detectada


No necesariamente cuantificada con un valor exacto Puede evaluarse mediante

Relacin seal ruido 2:1 3:1 Curva de calibracin

3 LD P
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LIMITE DE CUANTIFICACION
Cantidad ms pequea de analito en una muestra que

puede ser determinada cuantitativamente con precisin y exactitud adecuadas


Particularmente impurezas

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Limite de cuantificacin
Segn Eurachem

Definir precisin esperada en LC Preparar muestras, diluir. 6 concentraciones decrecientes Inyectar 6 veces cada muestra Calcular %DSR Graficar precisin vs concentracin Concentracin a la precisin definida = limite de deteccin

Fuente: Huber, Validation and Analytical Methods review, www.labcompliance.com LIC. KELIM VANO H. MESSEN, C.A. JULIO, 2007 56

LINEALIDAD
Capacidad para obtener resultados que sean

directamente proporcionales a la concentracin del analito en la muestra


Dentro de un rango Min. 5 concentraciones r2 mayor que 0,997

Reportar: Coeficiente correlacion, Pendiente, intercepto, Suma cuadrados residuales

Fuente: Agilent, Documento 5989-7459en

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Ejemplo

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Ferguson, QUANTITATIVE HPLC ANALYSIS ANALGESIC CAFFEINE FORMULATION LIC. KELIM VANO H. MESSEN, C.A. JULIO, 2007 58

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The regression equation is espesor = - 8,261 + 1,282 presion S = 0,154413 R-Sq = 97,5% 97,3% R-Sq(adj) =

Analysis of Variance
Source DF SS MS F P Regression 1 16,4352 16,4352 689,30 0,000 Error 18 0,4292 0,0238 Total 19 16,8644

Datos simulados a partir de KUME, LIC. KELIM VANO H. MESSEN, C.A. JULIO, 2007 59

RANGO
Intervalo en el cual se ha demostrado que el

procedimiento tiene un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad

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ROBUSTEZ
Capacidad para no ser afectado por variaciones pequeas,

deliberadas en los parmetros del mtodo Por ejemplo Estabilidad soluciones Filtracin Tiempo extraccin Temperatura flujo

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EJEMPLO 1 ROBUSTEZ
105

ESTABILIDAD ESTANDAR Y MUESTRA

104 103 102 101 100 99 98 97 96 95 1 2 3 4

DIA 1 2 3 4

% MUESTRA INICIAL 100,2 100 99,9

ESTANDAR 99,8 99,8 100,2 99,5

Fuente: CHUNG CHOW CHAN (et al), Analytical Method validation and instrument performance verification LIC. KELIM VANO H. MESSEN, C.A. JULIO, 2007 62

METODO

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Cunta validacin es necesaria?


SI
INFORMACION COMPLETA?

NO

VALIDADO?

NO
COMPILAR INFORMACION
MEDICION CRITICA

SI SI NO

NO

REEVALUAR INFORMACION

SI
INFORMACION SATISFACTORIA

SI

USAR EL METODO CON CONFIANZA

REVALIDAR
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NO
MESSEN, C.A. Fuente: Quality assurance in Analytical chemistry JULIO, 2007

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ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS

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ESQUEMA
1.2.3.4.5.TEORA BSICA.

INSTRUMENTACIN.

CALIBRACIN, EQUIPOS Y MATERIALES.

ESTIMACIN DE LA INCERTIDUMBRE.

BUENAS PRCTICAS.

1.- TEORA BSICA DE LA ESPECTROFOTOMETRA UV-VISIBLE

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Regiones del espectro

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ENERGIA Interacta con MATERIA produciendo

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CAMBIO DE NIVEL DE ENERGIA


Al desactivarse

RETORNO AL NIVEL INICIAL


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Interaccin de radiacin con la materia


ENERGIA MATERIA CAMBIO DE NIVEL DE ENERGIA Estado excitado

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RETORNO AL NIVEL INICIAL

Trmica

E Luminosa h

ATOMOS MOLECULAS

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Estado base MESSEN, C.A.

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Tipos de espectroscopia
ESPECTROSCOPIA ATOMICA

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MOLECULAR

TRANSICIONES ENTRE NIVELES ELECTRONICOS

TRANSICIONES ENTRE NIVELES ROTACIONALES, VIBRACIONALES , SPIN

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ESPECTROSCOPIA ATOMICA
TECNICA EMISION ASBORCION FLUORESCENCIA RAYOS X EXCITACIN CALOR UV-VIS UV-VIS RAYOS X RELAJACION UV-VIS CALOR UV-VIS RAYOS X

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ESPECTROSCOPIA MOLECULAR
TECNICA RMN MICROONDAS INFRARROJO UV-VIS RADIACION ELECTROMAGNETICA RADIOFRECUENCIA MICROONDAS INFRARROJO UV-VIS

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ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN MOLECULAR UV-VIS

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LA ABSORCIN DE RADIACIN ULTRAVIOLETA Y VISIBLE (200800 nm)

SE RESTRINGE A UN NMERO LIMITADO DE GRUPOS FUNCIONALES, LLAMADOS CROMFOROS, QUE CONTIENEN ELECTRONES DE VALENCIA CON ENERGAS DE EXCITACIN RELATIVAMENTE BAJOS.
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ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN MOLECULAR UV-VIS

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LOS TIPOS DE TRANSICIONES ELECTRNICAS QUE PERMITEN EXPLICAR PORQU ALGUNAS ESPECIES PUEDEN ABSORBER ENERGA RADIANTE:

Compuestos con electrones , y

Compuestos con electrones d y f

Compuestos con Transferencia de Carga

cromforos, que contienen electrones de valencia con energas de excitacin relativamente bajos.

Los iones y complejos de los 18 elementos de las dos primeras series de Transicin

complejos inorgnicos,

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Fundamento terico

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La ley fundamental en la que se basan los mtodos espectrofotomtricos es la de Lambert y Beer. La relacin entre la intensidad de la luz transmitida o energa radiante I y la energa radiante incidente I0 es una funcin del espesor de la celda b a travs del medio absorbente, de acuerdo a donde: A= bC Donde: A = absorbancia = absortividad 78 b = espesor de la celda C = concentracin MESSEN, C.A. LIC. KELIM VANO H. JULIO, 2007

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ACTUALMENTE ES UNA DE LAS TCNICAS ANALTICAS MS USADAS EN LA INDUSTRIA, LABORATORIOS CLNICOS Y DE INVESTIGACIN.

TIENE UNA GRAN APLICABILIDAD EN LA IDENTIFICACIN Y DETERMINACIN DE UNA ENORME CANTIDAD DE COMPUESTOS ORGNICOS E INORGNICOS.
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EJEMPLOS
Ver internet

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2.- INSTRUMENTACIN EN
ESPECTROFOTOMETRA UV-VIS

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Instrumento de haz sencillo

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Instrumento de doble haz

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Espectro uv-visible

Fuente: Modern Instrumental analysis


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3.- CALIBRACIN, EQUIPOS Y MATERIALES


EN MEDICIONES ESPECTROFOTOMTRICAS

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EVALUACION DE ESPECTROFOTOMETROS
Calibracin trazable
CAPACIDAD para analisis de rutina

Trazabilidad
Uso de materiales de referencia

certificados
Mtodos especficos acordados por las

partes

Requerimientos de calibracin
Calibracin de Longitud de Onda
Calibracin de Absorbancia Absorcin de las celdas Radiacin dispersa

Calibracin de Longitud de Onda


Soluciones de Holmio en acido

perclrico Filtros de Holmio o didimio Lmparas de descarga de Mercurio, Cadmio o Zinc.

Filtro de xido de Holmio o de Didimio (en vidrio o solucin)

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Calibracin de Absorbancia
Visible Filtros neutros Soluciones de CuSO4
Ultravioleta Solucion de K2Cr2O7 Filtros metalizados

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Filtro de Densidad ptica Neutra.

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Absorcin de las celdas


Celdas con agua
Vidrio a 356 y 650 nm Cuarzo a 220 y 240 nm

Radiacin Dispersa
Filtros de corte
Soluciones NaI, KCl, NaNO2, Acetona

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Incertidumbres asociadas a varios mtodos Metodo Dicromato acido de potasio Filtros NIST 930D Filtros NIST 2031 metal cuarzo Incertidumbre (Abs) 1 0.004 (min) 2 0.0022 3 0.004

Fuente: Varian, Measuring Photometric accuracy using double aperuture method

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Calibracin de Espectrofotmetros UV-VIS y Cromatgrafos

Equipos y Materiales en la Calibracin de Espectrofotmetos UV-VIS Espectrofotmetro UV-VIS.

Balanza analtica, con una resolucin de 0,1 mg (slo si los materiales de referencia del analito deben ser pesados).
Solucin de Material de Referencia Certificado (MRC) conteniendo una concentracin conocida del analito en un medio apropiado. Distintas soluciones (siempre un nmero superior a 3 y ms conveniente 5) de una concentracin conocida del analito a determinar. Dicha concentracin abarcarn lo ms extensamente posible el rango lineal de determinacin del analito.
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