Abrégé du cours d'enzymologie (Master II- Biochimie appliquée) Introduction générale ctivité enzymatique a été remarquée tres tOt nota nment grdce aux phénomenes de fermentation. Les premiers physiologistes expliquent que les réactions chimiques seffectuant dans les cellules étaient dues & une force vitale. Toutefois, les travaux scientifiques ne furent véritablement entrepris qu’a partir du XVIle siecle. Autrefois appelés diastases ou ferments, les premigres enzymes furent identifiées a ce siécle: -Pepsine du sue gastrique par Schwan en 1836 ~Trypsine du suc paneréatique par Kuhne en 1848 -Lipase par Claude Bernard en 1849. Chapitre I: Propriétés des enzymes et notions d’enzymologie Introduction Les enzymes ont été premizrement nommeées ferment ou diastases, d'oit V'origine gree du mot enzyme «EN » a I'intérieur et « ZUME » ferment, levain. Les enzymes sont des protéines douées d'activité catalytique spécifique du métabolisme de Yétre vivant qui la produit, mais elle peut également agir en dehors de cet organisme (conditions favorables). Elles permettent aux réactions chimiques nécessaires & la vie et & la multiplication cellulaire de sieffectuer & vitesse tres élevée et avec une spécificité qui élimine la formation de sous produits “’ “ Comparées aux catalyseurs chimiques, les enzymes sont capables d'amener plus rapidement une réaction a sa position d’équilibre © 1- Les enzymes sont des catalyseurs Is respectent les lois de la catalyse :~ ils augmentent la vitesse de la réaction en abai nt énergie d'activation sans modifier Véquilibre de la réaction. - Ils se retrouvent intactes & la fin de la ré: ction et agissent & fa le concentration par rapport aux concentrations en réactants. Mais ils se caractérisent de catalyseurs chimiques par: -L’équimolarité : mole d'enzyme : mole de substrat (pendant la réaction) -Ils travaillent dans des conditions physiologiqui de pression, température, pH. 2- Rappels sur la structure des enzymes Nature protéique Les enzymes sont des protéines ayant des structures Iaire, Iaire, Maire, voire IVaire (c'est le cas dominant puisque les protéines ont l'aptitude caractéristique de former des édifices polymériques définis). Cette partie protéique, appelée Apo-enzyme, n'est pas toujours suffisante pour action ailytique et necessite 1a présence d'un Cofacteur (composé non protéinique essentiel & activité catalytique d'une enzyme). Les Ribozymes, de petites molécules d'ARN douées d'activité catalytique, constituent une exception pour la nature protéinique des enzymes. Structure monomérique, oligomérique et polymérique Certaines enzymes sont constituées d'une seule chaine peptidique (monomériques). D'autres, plus nombreux, sont constituées de plusieurs chaines ou sous-unités, on parle alors de protoméres ou monomeres formant un oligomére (2- 12 protoméres). Ces protoméres peuvent tre identiques dont chacune porte un site actif, ou différentes dont chaque type de sous unités porte une fonction enzymatique distinete et souvent complémentaires,La iructure [Vaire s'établit spontanément. La dissociation d'une enzyme polymérique en ses protoméres nécessite 1a rupture des liaisons inter-protomérique qui sont généralement non covalentes (liaison hydrogéne, ioniques et trés souvent des contactes hydrophobes), mais il mest pas rare que des ponts covalents se forment entre les S/U, Le plus souvent ; la dissociation about ala perte de lactivité enzymatique. Iso-enzymes différentes formes physiquement distinctes de la méme Les isoenzymes sont | enzyme dont la composition des sous unités est voisine mais non identique “= mirine en ‘quelques acides amin) FH1e< sont produites par le méme organisme et catalysent la méme réaction sur le méme substrat mais avec des caractéristiques cinétiques différentes (Km et Vmax) et séparables sur électrophorése sid pics anes porta me nm) Complexe multienzymatique Les E catalysant une suite de réaction d'une méme voie métabolique peuvent s'associer au sein d'un complexe appelé complexe multi-enzymatique dont la proximité des centres actifs permet au produit du ler stade d'accéder rapidement au suivant et évite sa dispersion dans d'autres vois métaboliques. La protéine vectrice n'est pas disponible pour un nouveau cycle qu’aprés ach@vement du premier cycle. Le poids moléculaire (P.M) de tel complexe est tes élevé, 3 Site actif des enzymes Petite séquence de la structure de Yenzyme qui intervient dans la fixation de substrat (pour former le complexe enzyme substrat) et dans la catalyse de la réaction enzymatique. IL posséde une structure complémentaire a celle du substrat (Cette structure doit avoir plusieurs, groupements fonctionnels correspondants & ceux du substrat dans l'espace). Les repliements de la chaine peptidique fait rapprocher dans l'espace les acides aminés (A.A) du site actif qui est généralement situé dans la partie interne hydrophobe de la structure spatiale, La isons de la structure spatiale affectant le s e actif provoque la perte de Vactivité catalytique.En fait, le site actif est formé de deux sites voisins - Site de fixation (de reconna Gtape de la catalyse). ‘ance ou de positionnement) du substrat sur 'enzyme (premiére - Site catalytique : Ses acides aminés participent & I'activité catalytique. Les plus rencontrés sont His, Ser, Cys, Lys, Tyr (A.A polaires possédants doublets électroniques libres). Les autres A.A. de enzyme sont nécessaire soit : -au maintien de la conformation tridimensionnelle de IE. -faire partie de sites allostériques impliqués dans la régulation de lactivité enzymatique. -Essentiels au po multienzymatique). jonnement correct de I'E A T'intérieur de la cellule (complexe -nécessaire & l'association des E 4 une membrane. Modéles Deux modeles ont été proposés pour expliquer la complémentarité Site actif-Substrat : |ODE E-SERRURE : de Fischer donnant un caractére rigide & 'enzyme. -MODELE D'AJUSTEMENT INDUIT : Proposé par Koshland donnant-un caractére tres flexible au centre actif. La fixation du substrat au site actif induit un changement de structure tridimensionnelle de celui-ci, ce qui permet une meilleure adaptation avec la conformation du substrat (maximum de liaisons entre Substrat- A.A. de fixation et de catalyse). 4-Spécificité des enzymes « Spécificté lige ata réaction : » Une E donnée ne peut catalyser qu'un seul type chimique de réactions : oxydoréduetion, hydrolyse, transfert, isomérisation, lyse, synthése. Done de différentes enzymes peuvent fixer le méme substrat sur lequel elles ont des actions différentes.Exemple : (CH3-CH(NH2)-COOH (Alanine) > CH3-CH2-NH2 (Amine) El=Alanine décarboxylase CH3-CH(NH2)-COOH (Alanine-> CH3-CO-COOH (Pyruvate) E2= Alanine désaminase (désamination oxydative) « Spécificité liée au substrat : » Une E donnée catalyse un seul type de réaction sur "Un type chimique donné de substrat (S)". Cette spécificité est due & la partie des A.A. de reconnaissance au niveau du site actif. Cette spécificité peut etre large (I'E agit sur une grande variété de S avec cinétique particulitre pour chacune, ou étroite (VE n’agit sur qu'un seul S). Expl : Différents $ avec 2 le méme type de réaction done 2 E différents (CH3-CH-(NH2)-COOH (Alanine) > (CH3-CH2-NH2 (éthanamine) —_ E1=Alanine déearboxylase NH2-CH2-COOH (Glycine) > CH3-NH2 (méthanamine) E2=Glycine décarboxylase Exp2 : Large spécificité Hexokinase a une affinité 10 fois plus grande pour le Glucose que pour le Fructose « Stériospécificité Beaucoup d'E sont capables de distinguer 2 isomeres optiques et de n'agir que sur l'un deux (isoméres de séries D et L ; isoméres a et B, isoméres cis et Trans. Exp: Méme type de réaction, méme substrat avec 2 structures spatiales différentes ; donc 2 E différentes ; L-Lactate + NAD+ — Pyruvate + NADHLH + (El=L-Lactate déshydrogénase) D-Lactate + NAD+ —» Pyruvate + NADH,H + (E2=D-Lactate déshydrogénase) Remarque : Si le substrat possde un C asymétrique, le produits va conserver lasymétrie préexistante sans racémisation,5-Co-facteurs: Le cofacteur peut étre un « ion métallique »(exp : Ca¥ , Mg#2 , Fe+2, Zn#2 , Cu+2) ou bien une petite molécule organique appelée « Co-enzyme »dont ensemble (E+ Co-F= holo- enzyme= Enzyme active). Certaines enzymes nécessitent les deux & Ja fois (on métallique + Co-E Ions métalliques : Les métallo-enzymes (exp : carboxypeptidase, phosphatase alcaline..etc.) ont besoin de cation métallique. Cet oligo-élément fortement lié & l'apoenzyme et fourni par l'alimentation peut participer a fois 2 la reconnaissance du substrat et & la catalyse mais peut aussi jouer un role de structuration en stabilisant la structure spatiale du site actif. Coenzymes : « Groupements prothétiques : » 1 fait partie intégrant de Tenzyme (lié 8 Apo-E par liaison covalente). On Te retrouve done, que Tillustre te schéma suivant montrant le transfert d'un groupement X d'un substrat & l'autre : comme lenzyme, régénéré a la fin de la réaction ai AX +E-CoE > A+E-CoE-X (1) E-CoE-X +B > E-CoE +B-X (2) Les réactions 1 et 2 sont les deux étapes du processus enzymatique dans lequel X n'est jamais, libéré puisque le Co-E reste attaché au site actif de Vapo-E. « Cosubstrats (coenzymes mobiles) »: Liés par liaison non covalente (done moins forte) et ne s'associent au site actif de l'apo-E que pendant la réaction, Ils ont des sites de fixation comme ceux assurant la fixation de substrat usuels et p: conséquent devraient étre considérés comme substrats normaux. Exemple : AH2 + NAD+ — A +NADH + H+ (1) NADH + H+ + B > NAD+ BH? (2) Contrairement au schéma précédent, les deux étapes 1 et 2 peuvent étre catalysées par 2 E différentes (présentent dans la méme cellule), le Co-E étant $ de la premigre sous sa forme oxydée (réceptrice de H+ et d’é) et de l'autre sous sa forme réduite (donneuse de H+ et d’é).Propriétés générales des Co-E Petite molécule organique de nature non protéique donc thermostable. -Réagit molécule & molécule avec le substrat. -Les co-E ne sont pas responsable de la spécificité enzymatique( c'est l'apo-E qui en est le responsable). Les co-E ont des fonctions d'accepteurs et de transporteurs de radicaux libérés au cours de la catalyse (H, é, gpts). -La plupart possédent 1 ou plusieurs noyaux cycliques ou hétérocycliques le plus souvent non synthétisables par lorganisme (apporter sous forme de vitamines par Palimentation). Le co-E Ja forme active du vit famine. -Contrairement au substrat, ils sont régénérés aprés un ou plusieurs réactions, & lopposé, le substrat se transforme et ne trouve jamais son état initial. Classification: En plus de la classification selon le mode de liaison & l’apoenzyme (covalent ou non), ‘on peut classer les Co-Enzymes en fonction de la réaction a laquelle ils participent, et dans ce cas on distingue Les Co-E d'oxydoréduction : Transfert d’é ou d’H ou fixation d'oxygéne. Les Co-E de transfert de groupements : Radicaux monocarbonés, radicaux & 2 ou plusieurs carbones. Relation Vitamine-Coenzyme : Les vitamines, substances azotées nécessaires & la ie, sont des composés organiques que certains organismes sont incapables de synthétiser et qui doivent done leur etre fourni par Valimentation réguligrement mais en faible quantité Un bon nombre de vitamines, notamment les hydrosolubles appartenant aux groupe B, sont des précurseurs de coenzymes. Chez 'homme et les animaux supérieurs, une carence alimentaire prolongé en vitamines ou avitaminose se traduit par un ensemble de symptomes pathologiques dus & limpossibilité pour Vorganismge de catalyser certains réactions (a cause de l'absence de Co-E correspondant). 1faut noter que les mems composés servent de Co-E & tous les organismes vivants, mais ne sont des vitamines que pour certains dentre eux. (Veuillez consulter la fiche de principaux co-E (groupement prosthétique et cosubstrat)). 6- Nomenclature et classification systématique des enzymes Nomenclature Les E sont dénommeés de différentes maniérs + -Certai ies ont gardé leurs noms primitif’s : pepsine, trypsine... -Pour d'autre on ajoute le suffixe “ase” au nom u substrat ou au radical de ce nom : maltase, amylase....ete -Une dénomination plus correcte comporte le nom du § transformer et la désignation de la réaction effectuée : alcool déshydrogénase... La nomenclateur Ia plus rigoureuse est la nomenclateur codifiée proposée par 'union international de la biochimie en 1964 : deux lettres E.C (Enzyme commission) suivie de 4 chiffres désignant le numéro de la classe d'E, le numéro de sous-classe d'E (le types de réaction), S/S-classe (type de molécule sur laquelle elle a lieu Ia réaction’ ; et le numéro ordre. Oxydo-réductases ou déshydrogénase : Responsable de processus d’oxydo-réd\ agissent sur les liaisons suivantes : CH-OH CH-CH c=0 CH-NH2 CH-NH‘Transférases : Catalysent le transfert des radicaux tels + -groupement aminé -gpt aldghyde ou cétone -gpt acyl -gpt phosphate -gpt soutré Hysdrolases : Entrainent la coupure de duvers liens (C-O, C-N, C-C...) via l'intervention d'une molécule d'eau, Exp : les estérases, les osidases ; amidases.. Lyases : Catalysent les réactions d'élimination de certains gpt (C-O, C-N, C-C...) sans intervention de molécule d'eau, Isomérases ; Catalysent les réarrangements structuraux de la molécule exp : épimérases, récamases... Ligases : Ctalysent la liaison de 2 molécules A et B grice au couplage d'une réaction hydrolyse d'une molécule énergétique (ATP) engendrant la synthése de liaisons (C-C, C-N, C0,CS...) (Veuillez consulter le complément de classification des enzymes) Chapitre 2 : Les bases de la cinétique enzymatique (Veuillez consulter la suite de votre cours) KEBILI Zohra (MAA en Biochimie et Analyse des Bioproduits) (Université de Ghardaia)