TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE MEDICALE (LICENCE 2 BIOLOGIE MEDICALE) Exercice n°1: dosage du glucose plasmatique par la méthode a la glucose oxydase. Extrait d’une fiche technique : Composition de Ia solution réactionnelle : Tampon phosphate :150,0 mmol/l Phénol :10,0 mmol/I 4-aminoantipyrine :0,4 mmol/l Peroxydase :2300U/I Glucose oxydase 7215000 U/I- Mode opératoire Echantillon ou étalon 210 wl Solution réactionnelle :iml Mélanger. Lire 'absorbance @ 505 nm aprés 10 minutes d’incubation @ 37°C ou 20 minutes a 20- Bs. Limite de linéarité :22,2 mmol/l e . Ecrire les équations des réactions et préciser s'il s’agit d’un dosage en « point final » ou d’une méthode cinétique. jiquer le réle de chaque constituant de la solution réactionnelle et donner les conditions opératoires (pH, température, durée, concentrations) a respecter. 3. La fiche technique indique l’absorbance peut étre lue aprés 10 minutes a 37°C ou aprés 20 minutes 4 20-25°C. Expliquer, en schématisant l’allure de la courbe A=f(t) a ces deux de températures, 4. Justifier le choix de la longueur d’onde utilisée pour cette méthode de dosage du glucose. 5. Proposer un mode opératoire pour préparer une gamme d’étalonnage a partir d’une gamme de glucose anhydre. 6. Exploiter les résultats ci-dessous et conclure. [Cuve n® o [4 2 3. [4 [5 Plasma | Contréle Glucose (mmol/!) Ot fare het [zen (sere 20 ‘Aa 505 nm 0 | 0,247 | 0,491 | 0,746 | 0,986 | 1,250| 0,708 | 0,334 Données : intervalle de validation pour le contréle : 4,48-6,08 mmol/I.Exercice n°2 : Dosage de la créatinine par la méthode de Jaffé: Le dosage manuel ou automatique de certains substrats est réalisé par méthode cinétique {méthode cinétique non linéaire a temps fixé). La créatinine peut ainsi étre dosée, soit en « point final », soit en méthode cinétique selon la méthode de Jaffé. Créatinine + soude + acide acétique > Picrate de sodium + picrate de créatinine (absorbe 3 520 nm). De nombreuses substances interférent dans regu dann ce dosage et augmentent l'intensité de lat réaction colorée, parmi lesquelles le glucose, «= V'acétoacétate. Le graphique suivant représente I’évolution de la réaction pendant 15 minutes. oe es tenes B : les concentrations en créatinine ne sont pas les mémes dans les trois échantillons. 1. Aprés analyse des courbes, expliquer pourquoi la méthode de dosage de la créatinine en « point final » est déconseillée sur le sérum mais peut étre utilisée sur la plupart des urines. 2. Indiquer dans quel(s) cas cette méthode ne peut pas étre utilisée pour le dosage de la créatinine urinaire. 3, Des mesures d’absorbance & 520 nm sont effectuées avec des solutions aqueuses de créatinine, a différentes concentrations, mises en présence de soude et d’acide picrique ; Jes conditions de volume d’échantillons et de réactifs sont les mémes dans les trois cas. Les absorbances lues au bout de 0,5 minute et 2,5 minutes sont les suivantes : i 2. 3 Concentrations en | 20 40 60 gil 0,5 min 0,046 0,093 0,140 2,5 min 0,130 0,260 0,390 Montrer que ces résultats permettent de réaliser un dosage cinétique de la créatinine. 2, gore HS 2 Ne . pk S awa a ee exert + dosage du glucose A.Equatron S day cond ons 3 eee cht ucose + ogi Sy pase quoeahe saa = eavoryee! 4.01) + grondeamino 4-orH! picine Ee quinone imtne + 4 Hed Cod une method, of gorat Sena oD Ce Ad) 2) texenpon ghutphate » Sale Condiivieng du mode ceertdocre eh sth Jaur ge a dh Sait oplimal Yorn perature © @ gout se mile ao BPC Quce’. @ gost que &a eachon vacive a la qin Cor o> Mok a porns Soar concentrators i s@ Jaut oj & aucose, Bit tohakemont cence ati! ef pour ala @ Jaut ang m evite Ja convo ntcctien on stucose oxydctse. s ea tonsomnme, 22,2 wok cle grutose om obtfent 22 > 1 wool de Hy Op) U faut (oupoctay eo f BY irs de concantralien Joniny Omi| edutron mece- Ao0 er 4 20 Xo AL 7 4 ° xe AE Al Ap Am 2 Anal A,2o 0/86 ope ON oe Yaormd + 070% Cotrrole : 0234: Courle A! dralonnage. ye ® l4e Ab Ww wasnt} plea: fe: opt =, smil centrale! A Dy ABY ESTES ode omtre LYE bios laconeoreubion Atovues ede te &(bi. ’ Garam 4; dosage te ab cose. plaamatique. par Lo mottos, ala glacose. obydase. Jn glaose + O24 Hy0 ae Acide ghucomque + HyO2_ Hed, + Pronel + amine yank pire OHSS oy utnone Wming + Y hyo a Saget d'une dosage an goith Sino a] “Tampen phosphate ematitenh lo. at covekant Cond fling, du mode epeatove. -pir= +> oe S90 0 i duced + sete 104 oar en des wymes a Xa _ once svat exe ouper four >) / on a choisr Sob nM ale doit fee Concentrakion dus substrats. cor UL correspond a la Lonepstr Fade moxrmal wy lout Xe glucose esr abwor bee. ration asta soukion mere OSS2. ou + a Sons, Uf Me que \'en | 5-/ preparation #4 se solute “en de glucose pure oF only \) ANS ONL | 2. J OUD, ACBln ee NA) eye een ets cd ei Z ly da Lo grote, yaugee pen boudkns. | ‘oxte eran i grole auec. a earagine eh on | qone! eg ron homoagervet’Se on compuke avec d Meow d&ohile juoqu'ay are a ge prepacaitor dy ja game Q bofalennage Caolation \e -Vet¥sn = Aoph+ Awd Jo pd + dove pe ~ Aolo pl yooof'l 4ooofl \ + f Awe Me | ch! x \agils \ ry - \ooe) Krgoio? |) a jaa Paee Me wy Lali) \sha! (> | ri SS eee \ oral A a \ = 4 ete Con oot du pr See ot Ad \Soo peur eee a vale doe Jarre Jo fl) roe J Ate ee po — A259 9 __smto% gor ayTO% = Mise ermal 12 es au plaeena < “A\ BHO 250 20 Aly BBY 2 —>ot ook S84 5) Ls ae cont ole ra = T Dee La mobhods bok Corvecke.: By ramet Wy ay | conkele 9A NOt vaabe. du plasma = 4d) 32 mmollL —S | ae poor edt Ov) |Tot Borie B , boSage do Ya CreatyMine gar Ra Mublrpele de Safge' Creatinine + Soude + aeiele. acchique ——yPerate da soduunt + ; picrate. do Crentt ve ( absor be OF S2otia) A] -tnaluge des courbes ae Courbe nil (Aasma) ag oe la Wurlee cron -di tga tus Qo Courbe Conkinwe clo Crottre. Sevne Se Gabi lr se” Kk Combe n°2€) pot ata io courbe. Cri ede kga bys & Courle. se Graletle se. kCourbe n° a(Cre) ~de teotalo urbe croit dels attys alle Cenk a Coit Coke method oot deamseittd aur Ue Serum car ce darnter presenbe Aeyor doo tuberances qua, Now augmenter yrinteadite de lo wactyen endorad droy we aug mentation do. Lbabbsorbane. que le opecriophctemetre re. pourra eas Quire ¢ 2°[- Cotte melhoda Mw peut pas dire Utrkreee pour Le sleseoe de da Crecdivine Ucinatre dane W Cas a ad tun pationt abeUywe eb Arun paltomr quya unc aceLo cede se. e S[-_AR - & x LeceodS Ax Q A hye fe *® ~Tereabrnine]Ns 9 ~ 010 - ue Ri . ©) Ade —0oke pte 21Ao = a 35-101 0 BE 93 A -> & 2 ose fA = 209% FAO Qe ps . 25-819 4 - = a,Abhe —% Re JOsso eRe ede = 2,08 AAC 25-19 ° Conclusion: Aaz R= Re orlvonmutle. « ta \nvartation Bee aleso (oan ok Pep Vartakton aot t data Crenkintvte « Dene Neus ten dans un edosage. en Cinehique , eam MSExercice n°3 Exercice : Détermination de la glyeémie par la méthode & la glucose déshydrogénase. 2 Riucose déshytrogénase catalyse I oxydation du f-D-glucose en D-gluconatactone, en présence d'un coenzyme pyridinique. "+ RI : Acide perchlorique (0,33 mol/l); A2: Tempon phosphate (0,12 mol/l): NaCI (9,75 mol): GOH (0.87 yikai/l): Amutarotase (1,80 Hay, NAD" (2,0 mrt ” ( 5 a) Techaque: \, ) a Iivouie epee dns un tube emir ea hy 4s x7 “rion remacon0m SP = +: — ae ; Mélanger. centrfuger, aus introduire & fa pipette dans une cuve de ae Sépsisseur Se (Vax Ry ) Suma 2 amet Meme ama ey 2 Miélanger et aprés 15 minutes lire absorbance a 340 am contre un blane réactif ; A=0,240." 1. _Dégager le principe de cette méthode (équations des réactions, type de méthode...) 2 Donner le réle de chaque constituant du mélange réactionnel. Indiquer sila mutarotase est indispensable ou non. SchématiserVallure de la courbe, 3, Indiquer la composition et fe rote du ban réacti ) 4 Galeuler ta glyeémie en mmol/ de plasma. Concure Iregsnase est a pO-gucose NAD* oxdorécuctoss \=!(t) en préserice et en absence de mutarotase. Le gco ‘Le mutarotase catalyse la mutarotation dy D-glucose. Coefcient dabsorption molaire du coonayme & 340 nm = 630 m¥/mot.pe Ae gquakion H-> -gule g-b- ge Ghtt on gin dc cencrion BLacidc. Prohlorique, (033m prorerso e comgen eee _ Hurarotase = Ngyme do. Lo ewaed s ep LEDs BYE que eatalyse Ws D-giaconobactone. i Hat Co eng AON UE yx la mutacort ot exh ray SON as’ so pourtar dee B-5- Na prank oralatice Le yt porber Les tone ne 2) eer pace 1 Aspe prallure de Ro cour] EA Tos sane cure’ 2 geese b H-guswne datrene s NADH YE wlype do vrathode cok un doo or 20 pornr Sinal cor \bobsorban@ est luc ol ik): eemde La defecation doo asergrem ot Vaneme re. on B @ssaitce & Vacrtte de, \o, oxdycation du p-d glucose en qua eager & Vac? de lo Git elo e_ haga. \ a) Mey B) cand qQuens la compost? or \e No plane. reacki{f. oot compose’ Lampe® phosphor cole tot de calibrer Ww devant Ae bruk de Sent) 9,Anl) do Vean’ et do Ra ( y Wack | GSH, Halk ‘ d epectrephoto mere. Ce av sdvtounec ee (inter cdle du blanc ne Ayo mt arota se, WADE )+ ec onecaltates Be rae Bet Lee Al= adm” L G= wo o memo * ya 20 2HO Se Gat tea asad sai — ty 4 ai €.) = 630 ost. nat X Ao =bsotld™ a mot on Conuert'S &O Ane enof Cc oe Aka Aan” GEORAS aes 630-40 FAo’din® A col Ao” tamoe 620+ Ao = Xl cam of Cs & 0, 240 rame\\ al Bot LO Cre? Ae ta 4, $e eont feo ZOcreUcs ¢ ai Acar (on 2K? ys tA GBOK AG * ad 5% mmol 4 oi cau Qe pari? ah prese ae Une a moogee Nboi ‘TRAVAUX DIRIGES DE BIOCHIMIE ANALYTIQUE (LICENCE 2 BIOLOGIE MEDICALE) Exercice 1: dosage de Vurée par la méthode enzymatique UV en point final. Réoctifs: -Réactif 1 étalon urée :8,33 mmol/l ou 0,5 g/l Concentrations dans le test: -Réactif2 TampontrispH83 ©: 20mmol/ 2oxo-glutarate 22,4 mmol/i -Réactif 3 NADH :20,35 mmol/l GLH 27000 U/l uréase £27000 U/l ADP :0,5 mmol/I Echantillons : ‘Sérum ou plasma recueilli sur héparine, EDTA, fluorure, héparine-iodoacétate ou citrate. Urine diluée au 1/508 dans I'eau distillée (tenir compte de la dilution pour le calcul). Mode opératoire : Solution de travail: reprendre le lacon de réactif 3 par 25 ml de réactif 2; lalsser 15 minutes 3 température ambiante. Longueur donde : 340 nm (Hg 334 nm), Décalage de l'origine :introduire la solution de travail dans le cuve et régler l'appareil de maniére & avoir une absorbance comprise entre 1,7 et 1,9. Noter ’absorbance correspondante Ao. Etalon Dosage Etalon (réactif 2) 1040 Echantillon 1041 Solution de travail (note) 2m 2m IMélanger, photométrer, sans modifier le réglage, aprés une incubation de S minutes a 37°C ou 10 minutes 8 20-25°C. Stabilité de absorbance : 1 heure. Linéarité :25 mmol/| (2,5 g/l) Calcul : (AO~ Adosage)X 9/(AO — Asan): avec n = valeur de I’étalon en mmol/l ou en g/!) Note : éviter toute contamination extérieure por aramonioc. Lorsque absorbance de fa solution est inférieure 6 1,9 (por rapport & eau distillée) & 340 nm, la limite de linéarité de la technique devient 2,2 9/1 41. _Ecrire les équations des réactions du dosage et donner la signification de expression « méthode en point final ». 2. Donner le réle de chacun des dférents composants des réactifs 1, 2 ot 3 (remarque : ADP est un activateur de la GLOH). 3. rine dot étre ciluée 50 fois. Comment faire cette dilution pour obtenir 30 ml diluée ? Justifer cette dilution.Mode opératoire ‘a. _Justifier Ie choix de la longueur d’onde. b. Décalage de Vorigine : sachant qu’ 340 nm, le NADH a pour coefficient ‘absorption molaire 6,3.102 m#/mol et que le trajet optique est de 10? m, calculer le valeur approximative de I'absorbance initiale de la solution de travail & 340 _ Indiquerle sens de variation de absorbance du milieu au cours du dosage. Justfier. Donner la signification de expression « linéarité : 25 mmol). fe. Expliquer la formule indiquée pour le calcul del'urémie. Exercice 2: dosage de alanine aminotransférase (ALT) sérique La concentration d’activité catalytique de I'alanine aminotransférase (E.C.2.6.1.2 ; L-alanine : ‘mesurée dans un sérum selon les données de la fiche technique suivante -oxoglutarate aminotransférase) est Reacts: =Réactif1 __Tempon tris pH 7,5, L-lanine, phosphate de pyridoxal, nicotinamide adénine dinucléotide réduit, lactate déshydrogénase. -Réactif2 -—-2-oxoglutarate Mode opératoire : Dans un tube & essai, introduire : crac peices cocci - Sérum a étudier +200 al Mélanger, pré incuber 8 30°C pendant 10 minutes, puis ajouter: - réactif2 #200 pl Homogénéiser et transférer rapidement dans la cuve UV (trajet optique 107 m) du spectrophotometre réglé @ 340 nm. Attendre une ‘minute puls noter absorbance a intervalles réguliers pendant 2 8 3 minutes. Résultats = | Temps (min) 1 as [2 25 3 35 | ‘Absorbance 8 340 nm 1,706 | 1,692 | 1,679 1,664 1,650 1,635 T. Donner Te principe de Ta méthode utllisée pour ce dosage. Ecrire les reactions du dosage. Prédser le réle de chaque constituant des réactfset ister les conditions & respecter los dela détermination de activité catalytique de ALT. 2. _Justifer le choix dela longueur d’onde de 340 nm. 3. Justfier le choix de Fincubation de « 10 minutes » 830°C. 4. Calculer a concentration d’activité catalytique de Falanine aminotransférase dans le sérum étudié (patient adulte, de sexe ‘masculin) en U/l et en pikat/l Conclure. Données: = Coefisert obsorption motive du coeneye réult 340 nm 630 m/e: = aleurs dereference: 1. Homme 0.10075 phat; Femme 008 ~ 0.58 phot /1 830°C AL Homme 0.1302 gov; Femme :012~0,78 phot fd37°C Exercice 3 : Dosage des aminotransférases sériques 1. Giter les aminotransférases habituellement dosées dans le sang. Ecrire les équations des réactions catalysées.2. Détermination de la concentration activité catalytique o’ une aminotransférase dans un sérum par spectrophotométrie UV. Réoctifs: Réactif 1 Solution tampon phosphate pH 7,4 : 80 mmol/| Lespartate 32mmol/ NADH 0,23 mmol/l MDH 122,3 U/ml DH 22,3 U/ml Réactif 2Solution de 2-oxoglutarate #100 mmol/| Mode opératoire : Dans une cuve spéciale UV de 10-2 m de trajet optique, introduire: = Réactif2 :2,3ml = Sérum a étudier 0,5 mi Homogeénéiser et préincuber au bain thermostaté 8 25°C pendant § minutes. Ajouter ~ _ Réactif 2 20,2ml Attendre une minute, puis noter Vabsorbance toutes les minutes pendant § minutes. Résultats : “Temps (min) ° r a 3 a 3 ‘Absorbance 8 340nm | 0,569 | 0463 0,359 0,256 0,153 0,049 ’, Donner es réactions successives intervenant dans ce dosage, b. Indiquer quelle est 'aminotransférase dosée, c.Expliquer le rdle des différents réact 4. Donner les conditions opératoires générales & respecter lors des déterminations des activités enzymatiques sériques. . _Précisersile technicien peut choisir une autre température pour la détermination. f. _Expliquer 'avantage d'une détermination faisant intervenir un coenzyme pyridinique. Caleuler la concentration d activité catalytique du sérum étudié en U/l. Pour les calculs en série, déterminer le facteur « k » ‘par lequel il faut multiplier la variation d’absorbance/minute « n » pour obtenir la concentration d activité aminotransférase du sérum en U/l. h. Commenter Ia valeur trouvée, Citer les principaux cas pathologiques présentant une augmentation de concentration d’activité catalytique de cette aminotransférase sérique. J. _Indiquer les dosages complémentaires & réaliser pour effectuer un gnostic différentiel, = Coefficient ’ebsortion moe du NADH ® 340 nm 630 mm, Voleurs de référence 25° :<12 Uf Exercice 4: Dosage de aspartate aminotransférase (AST) sérique La concentration «activité catalytique de l'aspartate aminotransférase (E.C.2.6.1.1 ; L-aspartate : 2-oxoglutarate a est mesurée dans un sérum selon les données de la fiche technique suivante. Mode opératoire : Dans une cuve de 10-2 m de trajet optique, thermastatée 8 300C, introduire = Solution d'enzyme et de coenzyme et substrat (1): 4,0 ml + Sérum 10,1 ml ‘Mélanger soigneusement et incuber 10 minutes & 30°C, puis sjouter : = Solution de substrat (2) AmiMélanger soigneusement. Enregistrer I'absorbance durant tout le temps de la manipulation 8 340 nm, Résultat 1. Donner le principe de la méthode utlisée pour ce dosage. 2. Ecrire es réactions du dosage. 3. Indiquer les conditions & respecter lors de la détermination d’une activité catalytique. 4. Donner la nature des solutions (1) et (2) et préciser les conditions de concentrations et d’activité auxquelles elles doivent satisfaire, 5. Justfier le choix d'une lecture 8 340 nm. Apsotance 12 “ip. 10. PS as. os. XN a ie a8; Saar me Tonos (in o 5 0 1% 2 2 3 — 6. Sachant que la concentration initiale en coenzyme réduite dans le milieu réactionnel est de 0,18 mmol/l, calculer la valeur théorique de absorbance a t=0. 7. Commenter précisément Mallure de la courbe, 8 Calculer la concentration dactivité catalytique du sérum en AST. Conclure. 9. expression della concentration d’acti catalytique 334 nm est bu 1942 x (AA/At) nina» Donner la valeur du coefficient absorption molaire du composé absorbant a cette longueur d’onde. Données. + Coefficient d‘absorption molaire du coenzyme réduit @ 340 nm : 630 m¥/mol ; + Valeurs de référence @ 30°C: i. Homme : 0,10~0,50 pkat/I ii, Femme : 0,10 0,42 pkat/|F on, recharelen ae CULT 5 DO AUT GS ote Oe g) - Car Vabsorbance de la Sumulere gar (e WdDIt co gro porhvonnalls. a Sa Conantration Cs3r ghie Ratt changer W ornge raear = 12 aut change © & temee alors que ta contt? ort w passer an S caiqures -) 4)" Carcus do ba Concentration d'ach ite’ eatalugic ie eee yur = peel L Re. Exe Me comes en cacg MAL K = a bBo mfoud MIO Ink g3h - eee maonad AAR A mol Ane pow Exh bro to” Up nos =0 jooAb nro Aimed IL amc K ir nz bhe= Bom Ay = 096% ~0,4o® aw? U Rept = 400% aypnan Te aeneel | he Ctenk 9 Vode” permate (A2 ULL) ) CaS patholo g aie on Cae ole dec Qonchronian a ee inMownel® wu Ree * tmnBiackun Os ree os Viele alg = 0,406 Ne 5) Yruosng anipe Dermean oun ‘ i prone ee Co bi Gruleme:1DsS to 3 oO ¢ ce pert & dosaget de amt Hotransgerawks sequs copariate amunctrangserase. Al - _ Moning amnindrrangyer ase. , gopeti AsLy exw + L- gutamel ¢ ae ganine + o.oo geurorate LdY y Lorrt& ace aspartate t 2 of ASHI» of oe acetate + Lalu ga rnak z prasoocetate YOR > to es peo? WS ik apetarmuiratien de te Concentration | d- Congere a%* quasen bi slagit a anpactare arnmotreamege cars Jnote y Stoleiatse Se tt de | . Feat 5 XTampor ehos % Laser bat x NADIE + (o€ indicat een aus tovervienh dans Veouotten Lrorolo oe - de WDE FENAYTAL que ake. on molore Lp LEN TyOne qui cabaly yee Voryctation ds ) au pyran e. coral Vowydari an Rackate ETA pals mK Q- } deo ed ceachions. orogretardte. reat! a\- Condtiten® operation® general x pt | ay Tempercthure we Laupereat xe Ken v\o ducecfae z Nig eB cbs0 ee Qe dom Kaz d\0b A,b9% bh = bam = 0,044 Mie Aloe. Ve 7 aM 5 : [mol alo Un =630 aol ‘Ae tan am aD 18.0 =O30™ ae bdo AL A mot AC ~ Ju. 5 we yor 284 prot (vi) (apr go jee o es Go gov! quorc 9. peal & he ek prea : = 0, YoRp ee (© 60Cs Vb. 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Incubver 5 minutes 8 37° ou 10 minutes & 20-25" pus lire "absorbance 8 500 nm contre le blanc réactif. Lngarité : 18 mmol (7g/l) Pour chee L ua des rSactions dy dosage, indiquer le Facteur limitant 2 Denneries conditions de concentration auxquelles doivent satisfaire les constituants du chromogéne, 3. _Justifier les concentrations ¢’activité catalytique élevées pour les enzymes utilisées. 4, Dans a réaction indicatrice catalysée par la peroxydase (E.C. 1.11.1.7 ou donneur : H:02 oxydoréductasel, le chromogéne Uiiise est le, chromogéne de Trinder ou P.A.P, (phénol + 4-amincantipyrine) qui permet d’éliminer au mieux les Interferences dues aux substances réductrices contenues dans le sang (par exemple glutathion, acide a:corbique). En effet, fa peroxydase a plus d/affinsin a. .r le PAP que pour ces composés, 4 Indiquer le paramatre sin! wie seraetlan? «estimer catte affinité et comment procécie : s+ expérimentalement, b. Si le patient absorbait une dose wes importante de vitamine C (acide ascorbique) peu de temps ever 18 Prélaverent de sang, le résultat du dosage risquerait d’étre modifié, Indiquer dans quel sens. Justifer 5. La peroxydase peut étre contaminée par la catalase (E.C.1. 11.1.6 ou H:0: oxydoréductase). a. Ecrire la réaction catalysée par la catalase. b. Indiquer effet de cette contamination surle résulta du dosage. Justifier. Je bkamrec + Celts Og£2: Dosage des différentes formes de cholestérol alyser les différents modes opératoires ci-dessous et indiquer dans chaque cas la forme de cholestérol dosée. Justifier, 1 Réactif: tampon, cholestérol estérase, cholestérol oxydase, peroxydase, chromogéne Réaction : sérum + réactif Incubation, lecture de I'absorbance contre un blanc-réactif. Réactif: tampon, cholestérol oxydase, peroxydase, chromogéne Réaction : sérum + réactif Incubation, lecture de ’2bsorbance contre un blanc-éactif. Réactif 1 : acide phosphotungstique et chlorure de magnésium (précipite les chylomicrons, VLDL et LOL) Réactif 2 : tampon, cholestérol estérase, cholestérol oxydase, peroxydase, chromogene. Premigre étape : sérum + réactif1 ; centrifugation Deuxiéme étape : sumageant + réactif 2. Incubation, lecture de 'absorbance contre un blanc réacti. Réacti 1 : réactif polyanionique (solubilise les chylomicrctis, VLDL et HDL). Reactif 2 : solution de NaCi et citrate trisodique. Réactif 3 : tampon, cholesterol estérase, cholestérol oxydase, peroxydase, chromogene. Premiére etape : sérum + réactif 1 ; centrifugation. Deuxiéme étape : reprise du culot par le réactif 2. Troisiéme étape : culot solubilisé + réactif 3 Incubation, lecture de I'absorbance contre un blanc-réactif. Réactif : tampon, cholestérol estérase, cholestérol oxydase, peroxydase, chromogéne, agent complexant (complexe les chylomicrons, VLOL et LDL). Réaction : sérum + réactif Incubation, lecture de l'absorbance contre un blanc-réactif. Réactif 1: tampon, cholestérol estérase, cholestérot oxydase, peroxydase, chromogéne incomplet, détergent 1 (solubilise {es chylomicrons, VLDL et HDL) Fi Réactif 2 : complément du chromogéne, détergent 2 (solubitise les LDL). Réaction : sérum + réactif1 : incubation ; ajout du séactif 2. Incubation, lecture de l'absorbence contre un blane-éactif. Exercice 3 : dosage enzymatique des triglycérides sériques Réactifs Concentrations dans le est: - Réactif1 Tampon triéthanolamine pl=7,2, 50,00 mmol/l Conservateurs = Réectit2—-Magnésium :3,00 mmol/l NADH 20,20 mmol/l aT 10,45 mmol/ Phosphoénolpyruvate (PEP) 2050 Lactate déshydrogénase (LOH) 11000 U/l Pyruvate kinase (PK) 131800 Uf Lipase #100000 U/l = Réactif3 —Glycérokinsse Gk) > 200 U/l Mode opératoire: nme Sea Blane : “Solution de travail (R1+R2) (ql) 1000 ‘sérum (i) ‘Mélanger, laisser 10 minutes 8 20-25°C (ou § minutes & 37°C).absorbance Aor Aas _actif3 (ul) Sau o _£2u distilée (pl) LOS HE bel eli aones Mélanger, laisser 10 minutes 2 20-25°C (ou 5 minutes a 37°C). Lire Fabsorbance fea [Ase Caleul : Concentration en triglycérides (mmol/l) : n x (AAo ~ AAs) Ata; xo = Act ~ An? et 3,13 pour la longueur d’onde retenve. 1. Eerire la séquence des réactions intervenant dans le dosage 2. Donner ia longueur donde utilisée pour les mesures et indiquer le sens de variation de absorbance. = 3. Expliquer le réle de chacun des temps d'incubation et indiquer si leur durée dott tre précise ou non. 4, Sachant que le coefficient d’absorbance moizire du NADH est de 630 m?/mol & la longueur donde utilisée pour les ‘mesures, calculer absorbance minimale de Is solution de travail ._Indiquer si ce mode opératoire permet de corriger V'erreur due au glycérol endoggne. Justifier. 6. Retrouver dans les conditions du dosage, la valeur n=8,13. 7. Les résultats sont les suivants : Apt = 0,978 ; Ass = 0,972 ; Aor Conclure. A645 Ae 968. Calculer la triglycéridémie du patient. 4; Purification et inhibition de la créatine kinase La exéatine phosphokinase (CK ; £.C.2.7.3.2 ; ATP : eréatine N-phosphotransférase) est une enzyme présente dans les cellules ‘musculaires, Cette enzyme catalyse la réaction suivante: Créatine + ATP _-€ Créatine phosphate + ADP 1. Préparation de la créatine kinase * Les différentes tapes de purification sont résumées dans le tableau “Bitealis | tapes T Masse de | Activité as i ie: eat protéines (mg) __ totale (U) T—~ Boyage ef Wamogdndalon de usc Seuelatiqu de (80000 "385 coo | lapin = unit ae ose 1 £2 Suimageant de centrifugation aprés précipitation par NH&CI | 9.050 ° 3) Summageait de centrifugation aprés préciptavion par | 2250 | Mgs08 itty | 4 | Précipitation par V’éthanol a froid. Dissolution du précipité:| 2970 et + dans une solution de citrate d’ammonium — =e £5 | Dialyse iat rab [2480 ES Gristalsation 340°C _ 12150 a. Calculer activité catalytique spécifique de chaque extrait. 6. Définir et calculer le taux de purification (encichissement) et le rendement & chaque étage. ©. Indiquer sila derni@re étape est indispensable, Justifier. 2. Cinétique de la eréatine kinase {2 vitesse initiale de la CK est mesurée en fonction de concentrations crolssantes en ATP, la concentration en créatine étant constante, Le tableau ci-dessous rassemble les résultats obtenus Concentration de ATP dans le milieu Vitesse initiale dans le: réactionnel S][mmol/)) _____(unités arbitraires) i 020 cepa 436 = oa7 170 oat haa 29 eer 079 2,42 2 2. Donner, sans la démontrer, 'équation de Michaelis et Menten. En déduire equation 1A = f(1/S)). b. Déterminer graphiquement la constante de Michaelis et la vitesse maximale de la réaction. Préciser leur signification, Sachant que la constante de Michaelis de enzyme pour la créatine est de 2,9.10-2 mol/l, conclure quant aux activités respectives de la CK pour les doux substrats, Les quantités d’ATP et de créatine par gramme de tissu musculaire sont respectivement : 4 umol/g et 25 umol/gATP est en fait le coenzyme de la CK. Indiquer de quel type de coenzyme il sagit. Donner la structure de FAT. fe. Préciser la classe de t'enzyme. f. LaCkest activée par les fons Mg. Justifier. 4B. Lavitesse intiale de la réaction catalysée par la Ck est mesurée dans les mémes conditions que précédemment, mais en ___ présence de Zn* a la concentration Ci puis la concentration C2, Les résultats sont reportés dans le tableau suivant : [ATP] (mmol/!) vi (unités arbitraires) vi (unités arbitraires) - = fans 0,20 116 0,27 145 oat 189 0,79 2,70 Tracer les courbes 1/vi Glevée. Justifier. Exercice 5: étude de la lactate déshydrogénase La lactate déshydronénase (E.C.1.1.2.27 ; (S}-tactate : NAD+ oxydoréductase) catalyse la déshydrogénation du lactate. Son activité peut étre aporéciée par spectrophotométrie 8 340 nm. 1. Ecrire ’équation de la réaction catalysée parle LOH. Donnerle nom de la substance dosée a 340 nm et préciser I évolution de absorbance a cette longueur donde lorsque le substrat de la réaction est le lactate. Justifier. la LOH est présente dans le sérum. L’électrophorése de a fraction LOH du sérum, accompagnée dune révélation spécifique de cette enzyme, permet d observer cing bandes distinctes. Expliquer la présence de ces bandes différentes. 3. Par élution, les fractions correspondant & deux des cing bandes précédentes (appelées fractions 1 et 2) sont récupérées. activité LDH de ces deux fractions est mesurée dans des conditions optimales de pH et de température, selon le mode opératoire suivant + 0,1 ml de solution d’élution réagissent avec le coenzyme et le lactate dans un volume réactionnel total de 3 ml; + ta variation d'absorbance par minute est mesurée, dans des cuves de 1 cm de trajet optique, pour des centrations croissantes de lactate Concentration on jactate dans le milieu | Aa/At fraction 1 (min) | AA/At frac réactionnel (mol/)_ i 0,500.10 [08a z 0,250.10 i a (see a 053 Tgi7oa0* 39 anne [oss E 0,325.10 126 [ost a. Toutesles mesures ont été effectuées de faron & correspondire & la vitesse intiale. Définir la vitesse initiale, expression de la vitesse initiale dans le milieu réactioninel est: viuny =Kx(AA/At) "2, Oémontrer que K = 159. fn déduire ta vitesse initiate dans te milieu réactionne pour chaque fraction, aux différentes concentrations en lactate (donner ies réssitats sous forme de tableau). . A partir des courbes en cocrdonnées inverses, calculer les constantes de Michaelis pour t'enzyme présente duns la fraction 1 et pour celle présente dans ia fraction 2. Comparer les résultats. En ciéduire la fraction ayant le plus affiniee pour le substrat. e.Calculer le concentration dactvité catalytique de chacune des deux fractions par litre de solution d’élution. f. Indiquer ce qu'il faudrait connaitre pour déterminer activité catalytique spécifique de enzyme présente dans les deux fractions 4. Lactivité catalytique de la LOH peut étre modifiée par action de oxalate, a. Des expériences effectuées en présence d’une méme quantité de LDH, mais avec des concentrations croissantes _____ de actate, donnent les résultats suivants : a Meh Concentration en lactate dans le | vi en absence d’oxalate (unités | vi en présence d’oxalate (unités milieu réactionnel (mol/!) | atbitraires) _| arbitraires) 2,5.102 0,066 a | 00100 _ = 5,0.103 0.0250 4 0.0166 i hi 7,510 00298 100.107 Ss Tracer les courbes 1/vi = f(2/{S)). b.. En dédulre le mode d'action de V'oxalate sur la LDH. Justfier la réponse, Donnée : coefficient d’absorption molaire du NADH 340 nm : 630 m*/mol.wu Eee 2 GL DHA ghdocterd -Y- ent —>= One + Ha, | cholesterol + Og, y Leb 4 euinone tentne + YEO V.007% grane ; DM;02 ale Lei Uneard tes At mmol IL sane Liequabion A ye Jacko Limitank et We Choliotero| dans , 2% earcdton We gocreny imitans sot Wade Cer yal as & uperrare becenene te feadven Maura EAS Quo | \s> condrtens do concen aX cproncsttarte ek bY me Lere adel te quiun aubstrat eat produr't, 8 on | C'gh gour quie chore ¥ par \ongymng aiptrrat) ect pcie 20 Charge Ja-& gacanvetre Unok que cof we Km Hane Seage e jp- & esublah du dosage w Ries coaimic CUE la tkyO. G a NoNns — corns g arn. Car io utter ao © rua adm nur la quanti fe” oy | ba- ecrvee lo @achion Vigo _Aoralases Hot 40g : a bes enaura do demuuattion de b= (i afer dosarve! ec que ee ; 3 pane Imig Car Or aurd WN eroduckton do Aus dveny Moree A\ Eer(2 Wo fack'oy) a apuycecol + me yer Winds 5 ofgceros & S a.g6grywcel + Kip ee See ee ae bin a woe + EP pyruvare Wlaasp ey pycuate * pnp LDH 5 wants lodate | ta Longuaie ab onde URS! mn le absorloarte@ Seb di- gauer Wee lo disparrkven hy Whe Dt ou \togearttren au Nat Ae gee Fomes dv tacubarion eet pore edicrwner & gycere\ ‘alayissack ot Wve adler Ors tatorgecarde Au dosage. du ay cera) earrada avenanr Ave ary lo oo Lom es AS incbsh'on ciodt pour erode & qeytero| Space avo deren’ Age grate a 6K to duces, dot Oke ge rade + AP He = BUD | & = G30 mt mok Qeacn sAo*m Ce ozo MMM Sxl 262° apf od eae fc ~63e a x yo. a: y f Zen? _bgore KAard _ G30 *AP ZA |mmod = 6230 KAS Amok — Ao? ca nok [r= 6-6 A) pw he b3e Ue FORD Az A\2b catenins © le glyarol 5] & mode opecakoire. qe permst, pat i > per vaca bayen on aura kou- ondo gee Cac matigros Lo ars WN quote! TAQ dx aryacol provenant Aun au- re tom pox", Cem a3 : ee tbhen Angyor® Aha (KhoW wa) er idonsty calm) ya AND As 5A m Q N= Ee Renee eal VL neG,AB.“hme oe vensnonese sureuun Wea. a aan ae [sie] ee Seemoev ener 105 i: EERE CURIE OrocnE EPaeUVE DE sLOCHUNAE TSoNe 3 PREMIERE SESSION -SEPTEMBRE2015 i ekereloe a dosage du tateiuni sénque par spectrophotométie. SSS are Principe : En milieu alcalin et réducteur, le bleu de méthylthymol forme avec le calcium un complexe coloré bleu stable pendant une heure. Le procédé est specitique : addition de 8-hydroxyquincléine supprime I'interférence avec le magnésium. Cette méthode est tts sensitte et ‘ezmet un microdosage. La loi de Beer-Lambert est respectée pour des concertations finales en calcium (dane le mélange réactionnel)jusau's 01037 mmol. Technique a réaction colorée s'effectse dela mariére suivante Compositioh du tube dessa: ‘Rébetifau bled de métiythymol smd ~ métanger Soigneusement ot lr Fabsorbance 8612 nm aprés 10 minutes contre un témoin de connpensation réactifconvenable. * 1.” Calera concintraton mannii i dsible ss lito pr erect exprim&® en mi de cleo ar tre, ~- Dera WET prot de 10 a de soon Gan mero 1375 mmol decalcum 3 prt de carbonate de eakium pu et ante. 3. _Bxpliquer la préparstion dé 10 ml de cing solutions étalons filles permettant d'effectuer une gemme d’étalonnage convenable. 4. Donner ia composition du tube blanc-éactifet des tubes de ia gamme colorimétrique. feercice n°? "Une femme de 64 ans est admise au service des urgences pour anorexie, perte de poids et anémie. Ele est normotendue et ne présente pas deedemes, Les résultats biochimigues suivants ont été obtenus peu'de temps aprés son admission : Parannities a sate Inkevalle de ference [ese Natrgiie (idol) : i T0=ae Rolie (oamai7D 3 as sea Traine Tmo) ea; So75 Créatininémie {umol/!) erty a 95-120 OsmTaté lasmatique mOamia] wa. 50-308 ‘emolaté uinave (mOsmVea] Ts __—*| 30-366 FalBoonie, Wp S ice £ dosage dy calsum Sertque par ageckro Photo matri'g 2)cahel da le Concentration du cer eM) Ursa rite’: 93 mmol . hy zVat Yo aut js ol ote a! Sarl x ol \ \ | Boon 750 F \ Vive 55° yl ©) o3% most eS ERS’ pe Qo ieee pe bo KOOF* s) pescrtptior & ep realsahion en prakaua Lo= arene | L = 34 Sado” mol lL fe Syne “ tm = B SEAS joo FADO KAS” m <0 ,Bt5 oe ac axe m mel Ie Ca Cog orgs de ROOML , oN Agoske On BY we Mose MO BSE de \ooudhe (ve ourceimit® a cea rola y Sutoy Bly de ho sro” oe a cau” eae rayne eon mobisa. » PLES on amare ee au cas JUSqQu au trot y at youge =o,09 mls * gop ution cere & Ok eho ml, Von = Oy8? ! 10) UY cs reid) — a ae nLwe oogel M) oot 1) cpt ) Seam ' soa nila) raat + 1350 fs) pent poet yaeo 3 e\ Pia nk {eo\ (4D 1 Yep)y) Compostton) pr smi (Sai + D mL Cho) (elie da Qo Sluk’on Gille son Compete’ de (ea) +4 Yao Qvr =4o ml).TDS De LepucaTion naroHALe, £ - SECRET SUPER Sujet n°. & rronsoncs SCENTIRQUEET DEE RSOVATION CHARGE DELACULTURE UNEVERSTTE DES SCHENCES DELA SANT Epp tec reqnrescanron cua. -mocenar ‘ease our Fasion ose got i fi ton. ‘xaen oe diocuteme T5804 2 Bias ‘Session p'ocrooRE2013 mea oe [A) Prericen"t: étude de a lactate déshydrogénase La lactate déshydrogénase “(ECL1.127; (S}actate: NAD+ oxydoréductase) catalyse -Ia déshydogénation du | activitépeutétreapprésiée par spectrophotométrie 8340 nm. yO OH 0 Lads eres Ecrire équation de la réaction catalysée par [2 LD!!. Donner le nom de fa substance dosée 3 240 nm at précisar I th absorbance 3 cette longueur donde lorsque le substrat de la réaction estle lactate Justfier. eget a eri hme ere ae ae 444 encyine, permet dbserver cing bandes ditnctes Exlquerla présence de cesbandesditérentes. iy 3. Par élutio, les fractions correspondant 4 deux des cing bandes précédentes(appelées fractions 1 et 2) sont eécupéré Ge {DH de cas doux fractions est masurée dans des conditions optimates de pt et de température, salon le mode opérator Sei o ostentde sokition e’éution ragissent avec le coenzyme etl lactate dans un volume réactionnel total de 3 rl 32 7 La variation dabsorbance par minute est mesurée, dans des cuves de 1 an de trajet optique, pour des to 4 croissantes de lactate. : Gi 4 4, [Gontentfation en Tactae cans le mile eéactonnal(oV) “anfat fraction i(min"| | AA/AtFracton 2 (ia) F 9500107 289 — [oss 0,250.10 £58. 0.53 0,170.10" 1,39 0,39 "0:125.107 426 fost a, Youtas les misites ont td eflachutes de fagon &correxpondre hla witese Intle,O&firla vitesse nial. # B,_Vlexpression de le vitesse intisle dans le miliau.ctectionnel ezt viva savas) “8 Déngatzacque = 259. €. Eheeduire fa vitesse Inia dans le illey réactionnel pour chaque faction, aux différentes concentrations en lactate ‘résultats sous forme de tables). d. A partir des courbes en coordannées inverses, calculer les constantes de Michaelis pour 'enzyme présente dans la fracti ole présente dans la fraction 2. Comparer les résultats. En dédute la ration ayant le plus affinit pour le substrat. ce. Cabeler la concentration dactitécataique de chacune des deux factions par tre de solution ution. £tndiquesce qui audraitconnaltre pour déteresineractvké catalytique spéciique de enzyme présente dans les deux 4. activité catalytique dela LDH peut étre modifié par action de Foralate. ‘a. Des expériences effectuées en présence d'une m&me quantité de LDH, mais avec des concentrations croissants dofinentles résultats suivants: = [Concentation on lactate dans le | wien absonce™ Colate (onits [wien présence Powalite (unités milieu céxcdnne! (aU) arbitra) arbiters) 0 00166 10,0100) (09,0250 (0.0166 1 00298 mi 0,0215. 3 0.0333; parr 0.9250 Tracer les courbes 1/vi= f1/{S])- En déduire le mode d'action de oxalate sr la LOM. Sutil répanee, (donnée: confit dabsorption molaire du NADH 8 340.0m : 630 m'/mal. 2/ Seraien't} {e bilan fipidique Un bilan fipidique est réalisé sur le sérum d'un patient de 55 ans, présentant une hypertension artérlelle et ur pondérale. a 1. Desage du choles Solution de travail: ~~~ i ieyg: Cholate de sodium 13,74 mmol{i_ 3B aminoantipyrine 10,50 mmol/l i -Peroxydase 1210000 BO As - Cholestérol onydase 2 :22000/1 rs , ~Cholestérol estérase @ 221250) 5 Précipitation des VLDL et des LOL: aw aad ~Sérum ie 7500 HI. | ne sspl eee ~Réactif présipitant FAs" 3 S . & fasten Us Rowe l Dosage athe ey a La réaction colorée est effectige sur une prise d’essat de 10'ml de sérumm ou de surnageant de précipitation, en présence de mi ve colution de travail Labsorbance est lue 8 500 nmvaprés 5 minotes 837°C ou 10 minutes & 20-25°C. 1, Ectirela séquence des réactions enzymatiques intervenant dans ce dosage. 2. ndiquer le réle de chaque constituant de la solution de travail. 3. Les absorbances mesurées sont respectivementégals 8 0,208 (pour essai sérum) et 0,110 (pour essai surnageant). Calculer & partir de formulesiittérélespréalablementdémontfées = . ‘a. La concentration en cholestérol total du sérum (en mmal/!) b.Laconcentration en cholestérol aux HDL (non précipité) du sérum (en mmol/l) Le rapport cholestérol total / cholestérol HOL onnées le coefiient ¢ebsorpven mole dela qulnoe imine 8 SO0.m es 2460 m‘/mol 9} bosoge des trigtyerides Solution de travail: > Taipon ts pH7.S - Parachlorophéno! <4-aminoantipyrine” ATP = = Magnésium oleae Slyeérokinase ‘= Glycéro}-3-phosphate onydasea oy Peroxydase'w en Le réaction colorée est effectuée sur tine prise d'essal de 10 i! de sérum ou de solution étalor ri de solution de travail. 'absorbance est lue & 505 nm aprés 5 minutes & 37°C ou 10 i Dosage : a. Ecrre la séquence des réactions enzymatiques intervenant dans ce dosage. >. indiquer le rble de cheque constituant de la solution de travall eee sbsorbances mesurées sont respectivement 6gales 8 0,194 (pour Yessal serum) et 0,206 (pour étalon). Calculer lo concentration en triglyeérides du sérum (en mmol/l). Seatac ren een ae 3, Calcul de faeericentration en chotestérol LOL. = 5 5 caleulacta concentration en chotestérohLDl du patient et conclure §jee te eee 2 — dararee 2 eo bilan Wer dtqut Sequence ronctkron nalle> \ ockert geet _chol —> chol - bre. ete rast z Chel EP OD) —— Woe, Pacotye 5, qusino' dose as ications ~ant PUT Una eronel QYg®ct U amine 1gdle ave gone uot > ae i moaghare. qos © OT nen pane Spero ‘yo Qo cooertot wadicak CG crour Nate SSal~e ot Joon fonction ta ahipyeins . oubeiral as. Uo each (avy indtentre Ce . wPreadonyse. 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