BIOLOGIE MOLECULAIRE ET GENETIQUE 2 (UED412)

Clonage/technologie de l’ADN recombinant

N. Holic-Barlet nathalie.barletholic@univ-evry.fr

Année 2021-2022 1
 A- Définitions

 ADN recombinant (ou recombiné)

 Vecteur/insert

 Clonage d’ADN recombinant

http://tainano.com/chin/Molecular%20Biology%20Glossary.htm
2
 A- Définitions

 Principe général
Obtention du vecteur
recombinant

Amplification du vecteur
recombinant

http://tainano.com/chin/Molecular%20Biology%20Glossary.htm

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B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
1. Plasmide : vecteur de clonage
1.1 Plasmides natifs

4
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
1. Plasmide : vecteur de clonage
1.2 Plasmides utilisés en biologie moléculaire

[AmpR] [TeTR]

pBR322

5
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
1. Plasmide : vecteur de clonage
1.2 Plasmides utilisés en biologie moléculaire

Polylinker

Amp
R

ORI 6
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
1. Plasmide : vecteur de clonage
1.2 Plasmides utilisés en biologie moléculaire

7
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.1. Préparation du plasmide

a) Linéarisation du plasmide

b) Déphosphorylation

ER générant
bouts francs
3’OH 5’P 3’OH 5’OH
ou 5’P 5’OH
3’OH 3’OH
dépassants phosphatase

8
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert

a) Digestion par des enzymes de restriction

Exple 1 : ER générant des extrémités cohésives
Vecteur EcoRI : G/AATTC
GAATTC
CTTAAG
Insertion EcoRI : G/AATTC
5’ GAATTC GAATTC 3’
3’ CTTAAG CTTAAG 5’

5’AATTC 3’
3’G 5’
5’ G 3’
G 3’ 5’AATTC 3’ CTTAA 5’
CTTAA 5’ 3’ G

5’AATTC G 3’
G CTTAA
3’ 5’

Electrophorèse purification sur gel

GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC

CTTAAG CTTAAG GAATTC
CTTAAG CTTAAG
CTTAAG

Régénération sites EcoRI

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 a) Digestion par des enzymes de restriction

Vecteur AluI : AG/CT Exple 2 : ER générant des extrémités franches

AGCT
TCGA

Insert/Insertion SspI : AAT/ATT

5’ AATATT AATATT 3’
3’ TTATAA TTATAA 5’

5’ATT 3’
AG 3’ 5’CT 5’
3’TAA
TC 5’ 5’ ATT 3’
3’GA
3’ TAA 5’

5’ATT AAT 3’
3’TAA TTA 5’

Electrophorèse purification sur gel

AGCT
AG ATT AAT CT AG ATT AAT CT TCGA
TC TAA TTA GA TC TAA TTA GA

10
 a) Digestion par des enzymes de restriction

Exple 3 : RE générant des extrémités cohésives compatibles

Vecteur EcoRI : G/AATTC & MboI: /GATC
Insertion EcoRI : G/AATTC & MboI: /GATC

5’ GAATTC GATC 3’
3’ CTTAAG CTAG 5’

5’ G 3’ 3’
5’GATC
3’ CTTAA 5’ 3’ 5’

G 3’ 5’GATC
3’
CTTAA 5’
5’AATTC 3’
3’G CTAG 5’

5’AATTC 3’
3’G CTAG5’ Electrophorèse purification sur gel

Electrophorèse purification sur gel

GAATTC GATC
CTTAAG CTAG

Régénération sites EcoRI & MboI

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert

b) Prép de l’insert par digestion mécanique

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert

c) Préparation de l’insert pr PCR

Vecteur AluI : AG/CT
AGCT
TCGA 5’ 3’
3’ 5’

Electrophorèse purification sur gel

AG 3’ 5’CT
TC 5’ 3’GA

AG AG AGCT
CT CT
TC TC TCGA
GA GA

13
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert

c) Préparation de l’insert pr PCR (ajout d’enzymes de restriction)

Vecteur EcoRI : G/AATTC & MboI: /GATC

Insertion EcoRI : G/AATTC & MboI: /GATC

EcoRI

5’ 3’
3’ 5’

MboI

5’GATC
PCR
G 3’
3’
CTTAA 5’

Electrophorèse  purification sur gel

 digestion par EcoRI et MboI

5’ AATTC 3’
5’AATTC 3’ 3’ G CTAG 5’
3’G CTAG5’

Electrophorèse purification sur gel

GAATTC GATC
CTTAAG CTAG

Régénération sites EcoRI & MboI

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert
d) Préparation de l’insert par préparation d’ADNc (bout francs)
5’ AAAAAAAAAAAA 3’ ARNm

Amorce spécifique

5’ AAAAAAAAAAAA 3’
3’ NNNNN 5’
Reverse transcriptase
& dNTPs

5’ AAAAAAAAAAAA 3’
3’ NNNNNNNNNNN 5’
1er brin d’ADNc
RNAse H

5’ AAAAAAAAAAAA 3’
3’ 5’

DNA polymerase I (Polymérase 5’->3’ et ExoN 5’ -> 3’)

5’ 3’
3’ 5’

DNA ligase

5’ 3’
15
3’ 5’ ADNc double brin
 d) Préparation de l’insert par préparation d’ADNc (bout francs) (suite)

Vecteur AluI : AG/CT

AGCT
TCGA

AG 3’ 5’CT
TC 5’ 3’GA

5’ 3’
3’ 5’

Electrophorèse purification sur gel

AGCT
AG CT AG CT TCGA
TC GA TC GA

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 d) Préparation de l’insert par préparation d’ADNc (adaptateur)

5’ 3’
3’ 5’
CATG
GTAC
5’ CTCAAAG 3’ T4 DNA ligase
Vecteur 3’ GTACGAGATTTC 5’

5’CTCAAAG CTTTAGAGCATG 3’
3’ GTACGAGATTTC GAAACTC 5’
Digestion Nla III :
CATG/
CATG CTCAAAG CTTTAGAGCATG
GTACGAGATTTC GAAACTCGTAC
CATG 3’ GTAC5’
3’
5’

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.2. Préparation de l’insert

e) Synthèse chimique
f) Résumé

Nombre de sens d'insertion Clonage avec extrémités

1 2 franches cohésives
Digestion RE x x x x
Cassure mécanique x x
Amplification PCR x x
x
x (adaptateur) x x (adaptateur)
Préparation ADNc
x (Site restriction) x (Site
x x
Synthèse chimique restriction)

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B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
2. Préparation du plasmide recombinant
2.3. Ligature vecteur/insert

3’OH 5’OH
5’OH 3’OH

5’P 3’OH
5’P
+
3’OH

+ LIGASE

3’OH
5’OH
5’OH
3’OH

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
3. Transformation bactérienne

Obtention du
vecteur recombinant

Amplification du
vecteur recombinant
Efficacité transfo : Nb
colonies obtenues/µg
d’ADN plasmdique
(>105 col/µg ADN
transformé

http://tainano.com/chin/Molecular%20Biology%20Glossary.htm
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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
3. Transformation bactérienne

Obtention du
vecteur recombinant

Types colonies

Pas de pl. Amplification du

vecteur recombinant

Pl. vide

Pl. recomb
(sens 1)
Pl. recomb
(sens 2)

http://tainano.com/chin/Molecular%20Biology%20Glossary.htm
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B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.1 Criblage par antibiotique

22
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.1 Criblage par antibiotique

Etape absolument obligatoire!

Pas de pl.

Pl. vide

Pl. recomb
(sens 1)
Pl. recomb
(sens 2)
23
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.2 Criblage par PCR sur colonies

Discriminer plasmide vide & recombinants

1 bande x pb 1 bande taille 1 bande taille

>>> x pb >>> x pb

24
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.2 Criblage par PCR sur colonies

Discriminer plasmide vide & recombinants

1 2

2 1

1 bande x pb 1 bande taille 1 bande taille ∅ 1 bande 1 bande

>>> x pb >>> x pb

25
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.2 Criblage par PCR sur colonies

Discriminer plasmide vide & recombinants

1 2

2 1

1 bande x pb 1 bande taille 1 bande taille ∅ 1 bande 1 bande

>>> x pb >>> x pb

Discriminer plasmide vide & recombinant & sens d’insertion

∅ 1 bande
∅
26
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.2 Criblage par PCR sur colonies

Discriminer plasmide vide & recombinants

1 2

2 1

1 bande x pb 1 bande taille 1 bande taille ∅ 1 bande 1 bande

>>> x pb >>> x pb

Discriminer plasmide vide & recombinant & sens d’insertion

1 bande 1 bande
∅ ∅ ∅ ∅
27
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.3 Sélection blanc/bleu (ou alpha-complémentation)

Lactose glucose + galactose

(-Gal = LacZa et LacZw)

[AmpS]
-galactosidase non fonctionnelle (bactéries mutantes LacZa muté)

LacZa

Puc18/19
vide [AmpR]
amp -galactosidase fonctionnelle X-Gal+IPTG Pdt bleu
(incolore)

insert

Puc18/19
rec.
[AmpR]
amp
-galactosidase non fonctionnelle

28
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
4. Criblage des clones d’intérêts
4.3 Sélection blanc/bleu (ou alpha-complémentation)

29
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
5. Récupération des clones d’intérêts
5.1 Preparation ADN plasmidique

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4. Digestion par ER
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
5. Récupération des clones d’intérêts
5.2 Vérification

a) Vérification par digestion enzymatique

BamHI

BamHI

BamHI

31
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
5. Récupération des clones d’intérêts
5.2 Vérification

b) Vérification par PCR

32
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
5. Récupération des clones d’intérêts
5.2 Vérification

c) Vérification par séquençage

33
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
6. Résumé/Conclusion

Vérification plasmide

http://scienceniche.com/type/research/plasmid-cloning-video.html
34
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
6. Résumé/Conclusion

• Clonage vs PCR

35
B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
7. Avantages/inconvenients

36
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Amplification d’une séquence d’intérêt

http://scienceniche.com/type/research/plasmid-cloning-video.html
37
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Séquençage d’un fragment d’ADN inconnu

38
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Expression d’un gène dans une cellule procaryote (transformation)

• Expression d’un gène dans une cellule eucaryote (transfection)

39
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Production d’un ARN d’intérêt

Figure 8-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) (modifiée) 40
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Production d’une protéine d’intérêt (insuline, hormone de croissance,…)

Figure 8-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) 41

 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Transgenèse
 Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des
animaux transgéniques

42
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Transgenèse
 Introduction d’un gène dans des cellules, des plantes ou des
animaux transgéniques

43
 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Banque d’ADN

Digestion/ enz restriction

ADNg digérés

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 B- CLONAGE A l’AIDE D’UN PLASMIDE
8. Applications

• Banque d’ADN

+
ADNs Vecteur
d’intérêt Vecteurs
recombinants

+
Vecteur Organisme hôte Organismes
recombinant transgéniques

Division cellulaire

Banque cellulaire

45
 C- CLONAGE A l’AIDE D’AUTRES VECTEURS
1. Vecteurs phagiques

ADN linéaire, double brin

Phage recombinant

46
 C- CLONAGE A l’AIDE D’AUTRES VECTEURS
2. Cosmides

• Vecteur hybride plasmide/phage l

encapsidation comme génôme phagique
Insert : 30 – 40 kpb

47
 C- CLONAGE A l’AIDE D’AUTRES VECTEURS
3. Vecteurs BAC

• vecteur BAC (bacterial artificial chromosome)  dérivé du facteur F

phagique

48
 C- CLONAGE A l’AIDE D’AUTRES VECTEURS
4. Vecteurs yAC

• vecteur YAC (yeast artificial chromosome)

phagique

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 C- CLONAGE A l’AIDE D’AUTRES VECTEURS

Cloning vector Size of insert

Standard high copy number plasmid vectors 0–10 kb
Bacteriophage λ insertion vectors 0–10 kb
Bacteriophage λ replacement vectors 9–23 kb
Cosmid vectors 30–44 kb
Bacteriophage P1c 70–100 kb
PAC (P1 artificial chromosome) vectors 130–150 kb
BAC (bacterial artificial chromosome) vectors up to 300 kb
YAC (yeast artificial chromosome) vectors 0.2–2.0 Mb

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