II-B-Modifica+on des acides nucléiques

Couper, fragmenter

modifier

44

44

II-B-Modifica+on des acides nucléiques

1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

Endonucléases
Coupe ADNdb
Site de restric7on

45

45

1
 II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on
a-Site de restric+on

Palindrome

Taille majoritairement comprise entre 4 et 8nt

Dans un ADN avec 50% GC, un site de restriction de 4 nt est rencontré tous les x
nt?

Proba(site)= ¼ * ¼ * ¼ * ¼
Distance théorique moyenne entre 2 sites : 46

256pb

46

46

II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

b-Origine et nomenclature

1ère le$re en majuscule : genre de la bactérie

2ème et 3ème le$res : espèce bactérienne
4ème le$re en majuscule (pas toujours présente): souche bactérienne
Chiffre romain : ordre de caractérisa@on de l’enzyme

• Exemples:
- DraI Deinococus radiophilus
Reconnait palindrome
5’….TTTAAA….3’

3’….AAATTT….5’
-
- Eco RI Escherichia coli RYB,
Première caractérisée
Reconnait palindrome
5’….GAATTC….3’

3’….CTTAAG….5’
- Eco RV Escherichia coli RYB
Reconnait palindrome
5’….GATATC….3’

3’….CTATAG….5’

47

47

2
 II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restriction
C-coupure

5’ 3’
HpaI : GTT/AAC 5’…GTTAAC….3’
3’ 3’…CAATTG….5’ 5’

3’
5’ 5’…GTT3’ 5’ AAC…3’
3’ 3’…CAA 5’ 3’ TTG….5’ 5’

Enzyme à bouts francs

48

48

II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

C-coupure

5’ 3’
EcoRI G/AATTC 5’…GAATTC….3
3’…CTTAAG….5’ 5’
3’

5’ 3’
5’…G 3’ 5’AATTC…3’
3’ 3’…CTTAA 5’ 3’ G…5’ 5’

Enzyme à bouts cohésifs

5’ dépassants

49

49

3
 II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on
C-coupure

H1 H2

H1 H2 B1 B2 H3

H3

50

50

II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

D-classes d’enzyme de restric+on

• Type II : site de reconnaissance et site de coupure identiques

- 4 à 8 nt, palindrome
- Les plus utilisés

• Type I : différence entre site de reconnaissance (= site de restriction) et site coupure

- site de coupure : 1000 à 5000 pb en aval du site de coupure
- ex :TGANNNNNNNNTGCT

• Type III : différence entre site de reconnaissance (= site de restriction) et site coupure
- Coupure une vingtaine de nucléotides en aval
- site spécifique mais pas de symétrie
- Ex EcoP15I
• 5’…CAGCAG(N)25/…3’ 5’ dép
• 3’…GTCGTC(N)27/…5’

51

51

4
 II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on
e-Méthyla+on des sites de restric+on

Inac7va7on des sites de restric7on endogènes par des méthylases bactériennes

*
*

52

52

II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

f-Enzymes compa+bles
Enzymes de restric7on différentes générant des extrémités qui peuvent se
réapparier par liga7on/ligature avec une ligase

ü 2 simple digestions : Bam HI (G/GATCC) et Mbo I ( /GATC)

5’--GGATCC--3’ 5’--G3’ 5’GATCC--3’

3’--CCTAGG--5’ 3’--CCTAG5’ + 3’G--5’
(1) (2)

5’--NGATCN--3’ 5’--N3’ 5’GATCN--3’

3’--NCTAGN--5’ 3’--NCTAG5’ + 3’N--5’
(3) (4)

ü Reassociation par ligature

1+4 è 5’-GGATCN-3’ 1+3 è 5’-GGATCN-3’

3’-CCTAGN-5’ 3’-CCTAGN-5’

3+2 è 5’-NGATCC-3’ 4+2 è 5’-NGATCC-3’

3’-NCTAGG-5’ 3’-NCTAGG-5’

53

53

5
 II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on
g-Cas par+culier des isoschizomères
ER reconnaissant le même site restric7on qu’un autre enzyme de
restric7on (le site de coupure peut différer)

- Ex 1 : 2 souches bactériennes différentes

SacI 5’-GAGCT/C-3’
SstI 5’-GAGCT/C-3’

- Ex 2 : sites coupures différents (= néoschizomère)

Kpn I: 5’-GGTAC/C-3’
Acc65 I: 5’-G/GTACC-3’

54

54

II-B-1- Couper/fragmenter à l’aide d’enzyme de restric+on

h-Intérêt des ER

Générer des construc7ons

d’ADN hybride

Fragmenter l’ADN

Recherche de muta7ons

Sauvage Mutant
5’…GACTTC….3
5’…GAATTC….3 3’…CTGAAG….5’
3’…CTTAAG….5’

5’…GACTTC….3
5’…G AATTC…3’ 5’…GACTTC….3
3’…CTTAA G…5’ 3’…CTGAAG….5’ 3’…CTGAAG….5’

5’…GACTTC….3
3’…CTGAAG….5’
…
55

55 5’…GAATTC….3
3’…CTTAAG….5’

5’…G AATTC…3’
3’…CTTAA G…5’

6
 II-B-2- Modifica+on des acides nucléiques
2- Enzyme de modifica+ons

a) Les ADN polymérases:

b) Les ARN polymérases

c) Les ligases

d) Les nucléases

e) Enzymes de modifica7on des groupements phosphates

56

56

II-B-2- Modifica+on des acides nucléiques

2- Enzyme de modifica+ons

a) Les ADN polymérases:

Généralement ADN dépendante : matrice nécessaire

Nécessitent une amorce
Impliquées dans processus de réplica@on, répara@on ADN

57

57

7
 II-B-2- Enzyme de modifica+ons
a-ADN polymérase ADN dépendantes :ADN polymérase I

5’P 3’OH 5’P 3’OH

3’OH 5’P 3’OH 5’P

Matrice ADN simple brin

Amorce
+dNTPs

Ac$vité polymérase Ac$vité exonucléase Ac$vité exonucléase Fonc$on

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading
Réplica-on +
(re-re et remplace amorce)
OUI OUI OUI Répara-on +++

Origine E. Coli

58

58

II-B-2- Enzyme de modifica+ons

a-ADN polymérase ADN dépendantes :Fragment Klenow
Fragment Klenow ADN polymérase I

5’P 3’OH
3’OH 5’P

Matrice ADN simple brin

Amorce
+dNTPs

Ac$vité polymérase Activité exonucléase Ac$vité exonucléase U$lisa$on in vitro

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading
• Marquage ADN
• Suppression des extrémités
OUI OUI NON dépassantes
• Synthèse 2ème brin ADNc

5’P$ 3’OH$ +PolI$ 5’P$

3’OH$ 5’P$
+RE$ 5’P$ 3’OH$
3’OH$
3’OH$
5’P$
3’OH$ 5’P$

59

59

8
 II-B-2- Enzyme de modifica+ons
a-ADN polymérase ADN dépendantes : Terminal transferase

3’OH 5’P

Matrice ADN simple brin 5’P$ 3’OH$

+dNTP$ NpNpN$
3’OH$ 5’P$ 5’P$
3’OH$ 5’P$

+dNTPs

Activité polymérase Ac$vité exonucléase Ac$vité exonucléase U$lisa$on in vitro

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading
• Marquage extrémités 3’OH
OUI NON NON d’un ADN
• Ajout queue d’un ADNsb

60

60

II-B-2- Enzyme de modifica+ons

a-ADN polymérase ADN dépendantes : Taq DNA polymerase

5’P 3’OH 5’P 3’OH

3’OH 5’P 3’OH 5’P

Matrice ADN simple brin

Amorce
+dNTPs

Origine Thermus aqua*cus

Processivité élevée
Fidélité faible

Ac$vité polymérase Ac$vité exonucléase Ac$vité exonucléase U"lisa"on in vitro

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading

OUI NON NON PCR

61

61

9
 II-B-2- Enzyme de modifications
a-ADN polymérase ADN dépendantes : Reverse transcriptase

5’P AAAA 3’OH 5’P AAAA 3’OH

TTTT 5’P TTTT
3’OH 3’OH 5’P

ADNc
Matrice ARN simple brin
Amorce
+dNTPs

Ac"vité polymérase Ac"vité exonucléase Activité exonucléase U"lisa"on in vitro

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading
• Reverse
Transcrip@on
OUI NON NON • Fabrica@on de
banques d’ADNc

Origine virale
AMV (Avian Myeloblastosis Virus)
M-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) 62

62

II-B-2- Enzyme de modifica+ons

b)ARN polymérases

Matrice ADN contenant promoteur

+ribonucleo^des

Ac"vité polymérase Ac"vité exonucléase Activité exonucléase U"lisa"on in vitro

5’à3’ 3’à5’ 5’à3’
Proofreading
• Transcrip@on in vitro
OUI NON NON • Synthèse sondes
(ribosondes)

Origine E.Coli (T7 RNA pol & T3 RNA pol) Salmonella typhimurium (LT2)

63

63

10
 II-B-2- Enzyme de modifica+ons
c)ADN ligase
• permet de souder 2 fragments d’ADN par forma7on de liaisons phosphodiesters
entre une extrémité 3'OH et une extrémité 5'P de 2 nucléo7des.

5’P Fragment of 3’OH 5’P Fragment of 3’OH

interest interest
3’OH
3’OH 5’P 5’P

DNA ligase

5’P Fragment of Fragment of 3’OH

interest interest
3’OH 5’P

U"lisa"on in vitro
• Clonage
• Ajout d’adaptateurs
64

64

II-B-2- Enzyme de modifica+ons

c) ARN ligase

5’P Fragment of
interest
3’OH 5’P Fragment of
interest 3’OH

RNA ligase

5’P Fragment of Fragment of 3’OH

interest interest

U"lisa"on in vitro
• Marquage ARN
• construcWons ARN

65

65

11
 II-B-2- Enzyme de modifica+ons
d)ENDONucléase

Endonuclease Cible U%lisa%on in vitro

- ER ADNdb
Destruc7on ADN contaminant,
- DNAse I ADNsb ADNdb
marquage par ‘nick transla+on’

- Nuclease S1 ADNsb ARNsb

Elimina7on extrémités sb d’un ADNdb

Destruc7on ARN lors purifica7on

- RNAse A ARNsb ARNdb
ADN/protéine & mésappariement
dans hybrides ADN/ARN
- RNAse H ARN des
Destruc7on ARN après RT
hybrides
Détec7on hybrides ADN/ARN
ADN/ARN

66

66

II-B-2- Enzyme de modifica+ons

d)ENDONucléase
Marquage par nick transla^on

5’P
3’OH
3’OH
5’P
DNaseI 5’P 3’OH ADN pol I 5’P 3’OH
+ dNTP* * ** * *
67

67

12
 II-B-2- Enzyme de modifica+ons
d)EXONucléase

• Hydrolyse séquen7elle des nucléo7des d'un ADN dans le sens 3'-5' à par7r
d'une extrémité 3'OH libre.

Exonucléase III
5’P 3’OH
5’P 3’OH
3’OH 5’P
3’OH 5’P

Exonucléase III

5’P 3’OH

5’P 3’OH
3’OH 5’P
3’OH 5’P

Exonucléase VII

68

II-B-2-e) Enzyme de modifica+ons des groupements phosphates

• Déphosphoryla@on (phosphatase alcaline) : élimina@on des gpts phosphates en 5’

des ac. nucléiques
Phosphatase

5’P 3’OH 5’OH 3’OH

3’OH 5’P 3’OH 5’OH

> Applica@on : empêcher l’ac@on de la ligase (clonage)

69

69

13
 II-B-2-e) Enzyme de modifica+ons des groupements phosphates

• Phosphoryla@on (kinase, T4 polynucleo@de kinase): transfère du groupement

phosphate (gamma) d'un ATP sur l’extrémité 5’OH d’un ADN/ARN sb ou db

Kinase
5’OH 3’OH 5’P 3’OH
3’OH +ATP +ADP
5’OH 3’OH 5’P

+/- nucléo^des marqués

> Applica@ons :
- marquage des ADNs
- Phosphoryla@on d’un produit de PCR en vue du clonage

70

70

II-C – Transfert et hybrida+on

71

71

14
 II-C – Transfert et hybrida+on
1- Transfert d’ADN sur membrane Southern blot

Citrate sodium

• Diges@on de l’ADN par RE.

• Sépara@on par électrophorese
• Dénatura@on HCL condi@ons douces, suivie solu@on tamponnée
• Transfert sur membrane par capillarité. 15-20h
• Fixa@on covalente par chaleur ou UV

hYps://www.genome.gov
72

72

II-C – Transfert et hybridation

2- Transfert d’ARN sur membrane Northern blot

• Cf COURS TRANSCRIPTION

hYps://www.genome.gov
73

73

15
 II-C – 3-Hybrida+on moléculaire
a) Caractéris+que d’une sonde
Segment d’acides nucléiques utilisé pour repérer spécifiquement dans une réaction
dite d’ “hybridation molécualire” , un fragment d’acide nucléique auquel on s’intéresse.

à Un des partenaires marqué ou aYaché à un

support solide, bille magnéWque etc.

• Nature : ADN ou ARN - simple brin

• Taille variable : 20 nt à quelques centaines
• Complémentaire et antiparallèle du segment d’acide nucléique à reconnaitre
• Repérable (marquage radioactive ou froid)
74

74

V - Tech i e d h b ida i
C.II-C – 3-Hybrida+on
Hybridation moléculaire
sur membrane
1.b)Notion
Marquage d’une sonde
de sonde
2. Marquage de sonde
• Marquage radioac@f :
> incorpora@on deAgents
2.1. molécules
deradioac@ves
marquage(32P, 33P, 35S,3H)
>révéla@on par autoradiographie
a) Marquage radioactif
V- Tech i e d h b ida i 32P, 35S, 3H
C. Hybridation sur membrane
• Marquage froid b) Marquage froid
1. Notion de sonde
2. Marquage de sonde - direct

2.1. Agents de marquage

a) Marquage radioactif
32P, 35S, 3H > indirect : nt marqué par une molécule qui sera
> direct : nt marqué par un - indirect
révélée par une autre molécule
fluorophore
b) Marquage froid
- direct

- indirect
75

75

16
 II-C – 3-Hybrida+on moléculaire
b) Marquage d’une sonde
• Stratégie de Marquage

> extrémités T4 polynucleo2de kinase

Terminal transferase

> Sur toute la longueur : DNA polymerase, RNA polymerase + nt marqués

Random priming Nick transla2on

76

76

II-C – 3-Hybrida+on moléculaire

c)Hybrida+on moléculaire
1- Température de fusion

N<20 Tm= (2*Nbre AT) + (4*Nbre GC)

Dpt %GC, taille sonde, mésappariement, force ionique

Dénaturation
Renaturation

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/ 77

77

17
 II-C – 3-Hybrida+on moléculaire
c)Hybrida+on moléculaire
2- No@ons d’hybrida@on

N<20 Tm= (2*Nbre AT) + (4*Nbre GC)

Dpt %GC, mésappariement, force ionique

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/ 78

78

II-C – 3-Hybrida+on moléculaire

c)Hybrida+on moléculaire
3- Hybrida@on des membranes

hYps://www.genome.gov
• Pré-hybridation > saturation membrane
• Hybridation avec une sonde marquée (et dénaturée)
• Lavages > elimination de l’excès de sonde et hybridations non spécifiques
• Révélation
79

79

18
 II-C – 3-Hybrida+on moléculaire
D)Applica+ons

Northern-blot : autoradiographie

80

II-C – 3-Hybridation moléculaire

D)Applications

Southern-blot

BET Autoradiographie

81

19