Hémoculture : techniques conventionnelles et automatisées

I-Introduction

Les infections restent une source importante de morbidité et de mortalité. Cet état de
fait peut être amélioré grâce à une prise en charge adéquat qui s’appuie sur les évolutions
thérapeutiques, mais aussi sur le perfectionnement des techniques de diagnostic qui
permettent de confirmer ou d’infirmer le diagnostic de bactériémie, d’adapter le traitement et
suivre ainsi son efficacité,
le diagnostic repose essentiellement sur L'hémoculture qui est un examen
essentiel,urgent et dont la qualité conditionnera la prise en charge des patients , Les situations
cliniques et épidémiologiques qu’ils soit d'origine communautaire, ou nosocomiales sont
donc très variées, mais elles ont toutes un point commun : il s'agit de I'examen
bactériologique pour lequel la relation entre le clinicien et le biologiste a le plus d'impact en
terme de stratégie diagnostique et de pronostic de I'infection.

II-Indications
Larges et concernent toutes fièvre d’origine indéterminée surtout si elles s’accompagnent de
signes évocateurs d’infections. Le contexte clinique et épidémiologique sont importants a
déterminer (infection communautaires ou nosocomiales, recherche de bactéries particulières)
car peuvent nécessiter l’utilisation de méthodes spécifiques.

III-Les difficultés rencontrées

Les bactéries présentes dans le sang sont peu nombreuses leur mise en évidence directe
(examen Microscopique ou isolement sur milieu gélosé) est impossible, Peu viables, Leur
décharge est irrégulière, Il est donc nécessaire
 d'ensemencer des quantités de sang suffisantes,
 d'ensemencer un bouillon très riche sous un volume important (50 à 100 ml)
 de garder les milieux suffisamment longtemps ;
 de répéter prélèvements et examens

VI-Technique et modalités du prélèvement

Que les méthodes employées soient classiques ou modernes, les hémocultures doivent obéir à
des règles strictes de réalisation pour réduire les difficultés ultérieures d’interprétation.
-Prélever le sang avant toute antibiothérapie, devant l’impossibilité de retarder l’ATB….) une
fenêtre de 48h peut être envisagée
-La désinfection cutanée, précédant la ponction d’une veine périphérique, nécessite d’utiliser
l’alcool à 70° et un produit iodé avec un temps de contact (minimum de 1,5 à 2 minutes) doit
être respecté.
-La désinfection du capuchon du flacon d’hémoculture peut être faite avec de l’alcool à 70°
-Les ponctions de tubulures et de matériels intra vasculaires sont à proscrire.
-Si la fièvre est continue, trois prélèvements sont réalisés espacées de 30mn à 1h, mais si elle
est discontinue ou oscillante, les prélèvements sont réalisés au moment des frissons, des
poussées thermiques ou des hypothermies.
-Lorsque la fièvre est mal tolérée, deux prélèvements peuvent être suffisants pour ne pas
retarder la mise en route d’un traitement antibiotique.
-Compte tenu de la très faible concentration en bactéries dans le sang (1 à 10 UFC/mL), un
volume de 10 ml est nécessaire (20 ml est préférable),pour les enfants (de 1 à 5mL suivant
l’âge) avec des flacons adaptés qui permettent de respecter le facteur de dilution optimal : un
volume de sang pour dix volumes de bouillon. Cette dilution permet d’atténuer les effets
inhibiteurs sur la croissance bactérienne que peuvent avoir le complément, le lysozyme et les
cellules phagocytaires.

V-Les milieux :
Les milieux pour hémoculture sont des bouillons conditionnés en flacon enrichi de facteurs
de croissance : Peptones de Caséine et de Gélatine, Extraits de levure, NAD et Hémine,
Vitamines B6, K3, Cystéine qu’on inocule à travers un opercule en caoutchouc.
L’atmosphère à l’intérieur du flacon est faite de C02.L’anticoagulant est le SPS.la
présentation Bi phasique (phase solide - phase liquide) retrouvée dans le modèle
CASTANEDA (BIORAD) ou HEMOLINE (BIOMERIEUX).la présentation monophasique
destinée à la détection des bactéries anaérobies strictes :bouillon de culture SCHAEDLER
conditionné sous vide. L’hémoculture SIGNAL (OXOID).Le bouillon pour hémoculture de
l’Institut Pasteur d’Algérie.
Généralement on associe deux flacons par hémoculture, un bouillon aérobie et un
bouillon anaérobie, que l’on ensemence simultanément Pour garantir la qualité de
l’hémoculture, le milieu doit posséder certaines qualités :une atmosphère enrichie en CO2
favorisant la culture de certaines bactéries :Brucella, Neisseria , Haemophilus…
l’anticoagulant sans effet inhibiteur sur la croissance bactérienne : SPS ou Poly Anéthol
Sulfonate de Sodium à 0.025%, qui inhibe les effets antibactériens du sérum et des
phagocytes.(mais effet inhibiteur sur certaines souches de Neisseria de
Peptoanaerobius ou de Streptobacillus moniliformis il existe des flacons d’hémoculture,
contenant des additifs favorisant la croissance de certaines bactéries exigeantes (ex.
l’Hémine : Haemophilus) ou des inhibiteurs de l’activité des antibiotiques utilisé lors de
prises ATB avant le prélèvement .

VI -Transport et incubation des flacons d'hémocultures :

Les flacons d’hémoculture doivent être correctement étiquetés avec nom, prénom du malade,
service d’hospitalisation, date, heure du prélèvement et température du patient au moment du
prélèvement et rapidement acheminés au laboratoire d’analyse compagnes d’une fiche de
renseignements cliniques

Technique de diagnostique
1 Techniques conventionnelles Incubation
Une incubation à l'étuve à 37°C pendant 7 jours est suffisante en routine au delà de ce délai
les bactéries détectées sont généralement des contaminants qui étaient présents en faible
quantité dans le prélèvement. Un temps d'incubation plus long peut être nécessaire pour des
micro-organismes particuliers : bactéries du groupe HACEK, Brucelles ou Legionelles ou
encore pour des patients suspects d'endocardite (1 mois)

Examen des flacons

Chaque jour ou mieux deux fois par jour, les flacons sont inspectés en vue de rechercher des
signes témoignant d'une croissance visible (turbidité, hémolyse, coagulum, dépôts
blanchâtres floconneux au fond du flacon ou particules adhérentes sur sa paroi interne.),
certaines bactéries comme les Neisseria, les Haemophilus et les Campylobacter troublent
peu ou pas le bouillon de culture et que l'usage d'un flacon diphasique s'avère utile pour ces
espèces. Au moindre signe de culture on effectue une coloration de Gram sur un échantillon
prélevé par ponction aseptique de l’opercule avec une seringue stérile. L’examen direct
permet de reconnaître la morphologie de l’agent bactérien présent oriente l’identification du
germe permettant d’instituer ou rectifier le traitement antibiotique.
Des prélèvements à partir de chaque flacon sont ensemencés sur des milieux de culture à la
moindre suspicion de culture, et de façon systématique à 18-24 h, 5-6 ème jour et à la fin de la
période de surveillance des flacons sur milieu au sang frais et cuit, et on ajoute d’autres
milieux en fonction des résultats des examens microscopiques. Ces milieux de culture sont
incubés sous Co2 pendant 48 h et examinées à la 24 ème heure puis à la 48ème heure. Toutes les
manipulations se font sous hotte bactériologique à flux laminaire. Le port d’un masque et de
gants est indispensable vu le risque de transmission au manipulateur, de certains germes
dangereux (exemple Brucella).

Amélioration de la précocité et de la sensibilité de la détection de la croissance

bactérienutilisation
Plusieurs procédés ont pour objectif d'améliorer la précocité et la sensibilité de la détection
de la croissance bactérienne :
• l'agitation des flacons aérobies pendant les premières 24 heures d'incubation accélère la
croissance bactérienne, mais elle est difficile à mettre en pratique sans automate ;
• l'aération des flacons aérobies avec un dispositif adapté favorise la croissance des
Pseudomonas ;
• la détection précoce de la croissance en pratiquant un examen direct au microscope du
bouillon de culture avec de l'acridine orange est rarement utilisée ;
•Repiquage systématique précoce (entre 6 et 72 h) du flacon anaérobie sur gélose chocolat
incubée en aérobiose à 35° C peu réalisable ;
• les systèmes diphasiques permettent la croissance précoce de colonies sur le milieu gélosé
utile pour les espèces bactériennes à croissance délicate ; Un inconvénient est la proportion
importante de contaminants en raison, d’une part, du risque de contamination au moment de
la fixation de la lame gélosée et d’autre part, du manque d’étanchéité absolue. Les systèmes
diphasiques, type Castaneda n’ont pas ces inconvénients ;
• le système signal utilise un seul flacon sur lequel est adapté un dispositif permettant de
signaler la surpression produite dans le flacon par la croissance microbienne.

Inconvénients :
-expose le préleveur et le technicien a des risques lies au sang du malade
-Une méthode manuelle astreignant
-détection tardive de la croissance bactérienne,
-absence de détection des bactéries de croissance difficile
-risques de contamination lors des repiquages répètes.
2-La centrifugation-lyse : le système Isolator

Ce système permet de concentrer les microorganismes. Le sang recueilli (8 à 10 ml) est

inocule dans un tube contenant de la saponine pour lyser les leucocytes et les érythrocytes, et
du SDS comme anticoagulant. Les tubes sont centrifuges à 3 000 tours/min pendant 30 min.
Le culot de centrifugation est ensemence sur 2 ou 3 boites de milieu gélose approprie. Le
système Isolator ® 1.5 est plus simple d'utilisation car il ne nécessite pas d'étape de
centrifugation. II est utilisable en pédiatrie.
Les indications sont multiples :

-mycobactéries, champignons fillamenteux,

-bactéries a croissance lente ou difficile (HACEK, Bartonella, Legionella)
-Hémoculture quantitative pour le diagnostic d'une infection sur matériel intra vasculaire.
Inconvénient
Lourdeur des manipulations qui oblige a limiter son utilisation, le risque de contamination
lors des manipulations oblige a travailler sous hotte
3-les automates
A-Critère de choix
- Les caractéristiques extrinsèques : valeurs prédictives positive et négative
- La qualité du système informatique : clarté et facilite d'emploi.
- La rapidité de détection..
- La simplicité d'utilisation.
- La possibilité de connexion bidirectionnelle avec I'informatique centrale du laboratoire.
- le prix qui inclut le prix d'achat de I'appareil, le prix des consommables.
- La maintenance et le service après-vente.

B-Principaux appareils et principe

1-Bactec de première génération
Premier système mis au point, le principe est la présence d’un substrat radioactif dans le
bouillon d’hémoculture entrainant, en cas de positivité un dégagement de CO2
Inconvénients :
- utilisation d’un produit radioactif ;
- méthode invasive par prélèvement dans chaque flacon ;
- maintenance quotidienne.
2-Les systèmes commercialisés
Le principe de détection de ces automates est la mesure directe ou indirecte du CO2 produit
dans les flacons.
Bio Argos
Mesure la production de CO2 à par spectrophotométrie.
• BacT/Alert
Le principe est d'incorporer dans chaque flacon un détecteur colorimétrique" CO2 sensor" de
coloration verte. La production du CO2 entraîne une diminution du pH et le sensor devient
jaune. Le virage de couleur est interprété par réflectométrie,
• Bactec 9240
Le principe est basé sur l'existence d'un sensor sensible aux variations de pH. Le CO2 produit
abaisse le pH qui est mesurée par une coloration fluorescente mesurée par une photodiode.
• Vital
Utilise la technique HFT (Homogenous Fluorescence Technology)
Dans les flacons se trouve une molécule fluorescente sensible auCO2 (perd sa fluorescence)
La croissance est aussi détectée parvariation du pH et modification du potentiel d'oxydo-
réduction.
C-Avenages
Les systèmes automatisés d’analyse des hémocultures permettent une surveillance presque en
continue de la croissance microbienne et accélèrent ainsi la détection des micro-organismes,
la majorité d’entre eux étant détectés en 24 heures
D-Inconvénients
Ces automates sont fermes et utilisent leurs propres flacons, voire leur propre système de
prélèvement d’où leur cout élevé.
4-CAS PARTICULIERS
Recherche de mycobactéries
Le diagnostic de l’infection repose sur la mise en évidence de la bactérie par
hémocultures ,plusieurs méthodes sent appropriées avec une sensibilité comparable.
-La méthode Isolator consiste a ensemencer le culot résultant de la centrifugation- lyse sur
milieu solide de Middlebrook 7H11.
-La méthode Bactec 460 TB Méthode de respirometrie radiométrique. Détecte une culture de
mycobactéries en milieu liquide de Middlebrook 7 H 12 contenant de I ‘acide palmitique 14 C
par mesure du 14CO2, libéré au cours du métabolisme.
Cette méthode ayant l’inconvénient d’utiliser des radio éléments,
Autres microorganismes
Les méthodes destinées a cultiver des microorganismes ayant des exigences nutritives
particulières doivent être mises en œuvre sur des critères cliniques rigoureux.
Bactéries à croissance lente et/ou difficile
Les méthodes de détection automatisées de la croissance bactérienne sont plus rapides que les
méthodes conventionnelles, mais pas plus sensibles que la méthode Isolator@.
Brucella
Certaines souches sont exigeantes en CO2. Le sang est donc inocule en flacon diphasique type
Castaneda, incube 6 semaines a 37 “C. Les subcultures se feront sur gélose Trypticase soja
additionnée de 5 % de sérum de bœuf incubée en atmosphère de 5 % de CO2
Campylobacter
Culture a 37 “C en microaerophilie dans une atmosphère de 5 % de CO2sur milieu de
Skirrow, Butzler ou Karmali incube 72 h.I
Legionelles
Culture sur milieu Buffer Charcoal Yeast Extract (BCYE) incubé a 37 “C en atmosphère
enrichie de 5 % de CO2. Observation pendant 10 j.
Mycoplasma-Ureaplasma
Culture en bouillon Pleura Pneumoniae Like Organisms (PPLO) ou gelose A3 incubée en
microaerophilie a 37 “C et observe 3 j.
Leptospira
Recueil du sang sur tube héparine en ensemencements en tubes de milieu Tween-Albumine
ou Ellinghausen-McCullough-Johnsen-Harris (EMJH) incubé j 30 “C a I’obscurieC.
Observation hebdomadaire des cultures au microscope a fond noir pendant 2 mois.
Groupe HACEK
Nécessitent une incubation des flacons d’au moins 14 j.
Streptocoques déficients
Certaines souches de streptocoques du groupe viridans exigent du pyridoxal pour leur
croissance.
Elles se caractérisent par une croissance en bouillon et une absence de croissance en milieu
gélose.
Le besoin en pyridoxal est mis en évidence par la croissance sur géloses au sang additionne de
0,001 % de pyridoxal ou par un test de satellitisme autour d’une strie de S. aureus.
Bartonella (Rochalimaea)
Leur culture sur milieu acellulaire est lente et delicate. Le culot d’un tube Isolator@ est
ensemence sur gélose au sang de lapin ou de mouton incube en atmosphère de 5% de CO,
pendant 6 semaines.
Une autre cause d’endocardites a hémocultures négatives pourrait être la courte duré usuelle
(5 a 7 j) d’incubation des flacons dans les automates. Cette duré est probablement insuffisante
pour détecter toutes les souches a croissance lente et difficile. Aussi, il conviendrait que le
biologiste soit systématiquement informé de toute suspicion d’endocardite infectieuse, de
façon a prolonger le temps d’incubation des flacons de ces malades ou procéder a des
repiquages de ces flacons.'h6moculture, positive souvent celle-ci.
Conclusion