Des Gènes et des

Hommes

Q uatre décennies prodigieuses, scandées d’exploits scientifiques, depuis la découverte de

la structure de l’ADN en 1953, nous ont entraîné dans une descente vertigineuse vers les
commandes de la vie. Aujourd'hui, biologistes et généticiens explorent sans relâche
l’infiniment complexe. Au cœur des cellules, ils décryptent avec succès les secrets de la
logique du vivant, bouleversant les rythmes séculaires de l’espèce humaine, chamboulant ses
certitudes, modifiant son évolution, ébranlant les fondements mêmes sur lesquels les sociétés
se sont édifiées. Des bébés éprouvettes à la thérapie génique, l’humanité se prépare à une
gigantesque mutation dont on imagine mal encore aujourd’hui toutes les implications. Age
d’or de 1’espèce humaine pour les uns, ou meilleur des mondes façon Aldous Huxley pour les
autres, le XXIe siècle que nous promet la science sera essentiellement génétique.

Espoirs, craintes et controverses ont accompagne dès ses commencements cette discipline
surdouée, dotée d’une incroyable soif de connaissances. La révélation de la double hélice
d’ADN, par James Watson et Francis Crick, a ouvert une voie royale dans laquelle
s'engouffrent les chercheurs. La découverte du nombre exact des chromosomes humains (23
paires) en 1956 et celle de la première anomalie chromosomique (trisomie 21) en 1959
marquent le début d’une longue quête dont 1’établissement de la carte du génome humain, qui
mobilise aujourd'hui les généticiens, sera l’aboutissement. Jamais la science n’a nourri de si
grandes espérances. Mais de la connaissance au maniement, il n’y a qu’un pas, franchi en
1973 par deux Américains, qui réussissent la première manipulation génétique sur une
bactérie. Le monde scientifique, échaudé par l’aventure nucléaire, prend peur. Et pour la
première fois, il décrète un moratoire sur ces recherches à Asilomar, en Califormie, en 1975.
Coup d’arrêt sans lendemain pour cette crise d'adolescence de la communauté des généticiens.
Et pendant que s’é1aborent les outils du diagnostic prénatal et ceux de la maîtrise de la
reproduction, les manipulations génétiques deviennent un exercice quotidien dans les

1
laboratoires. Les bactéries recombinées travaillent au service de l’humanité, produisant sans
relâche de précieuses substances.

Au tournant des années 80 apparaissent les premiers bébés-éprouvette : Louise Brown, la

petite anglaise, et Amandine, la petite française, nées de l’art de la procréation assistée. C’est
1’explosion de la génétique et des biotechnologies. Comme un jeune adulte conquérant, la
technoscience toute neuve envahit tout, de la médecine à l’agriculture. Elle multiplie les
exploits spectaculaires 1982, naissance du premier animal transgénique; 1983, premières
plantes transgéniques en laboratoire; 1987, premiers essais en plein champ de plantes
transgéniques ; 1988, première, souris transgénique brevetée aux Etats-Unis... Des pionniers
entreprennent avec circonspection les premiers essais de médecine par les gènes, la thérapie
génique.

A l’aube des années 90, les fabuleux progrès des sciences de la vie fascinent et
effraient à la fois. Alors que les chercheurs se lancent dans une entreprise titanesque, le
décryptage intégral du génome humain, que les médecins traquent les maladies héréditaires,
espérant demain les guérir, que les premiers légumes modifiés génétiquement pointent vers
nos assiettes et que les milliards attendus de la génétique attirent les géants de l'industrie
pharmaceutique, les citoyens et leurs gouvernants s'inquiètent. Va-t-on modifier 1’espèce
humaine ? Notre fin de siècle veut canaliser les pouvoirs de la génétique. Poser un cadre
1égislatif qui assure la sauvegarde du respect de la personne humaine, tout en maintenant la
nécessaire liberté de la recherche, n’est pas chose simple. Le Comité international de
bioéthique de l'Unesco travaille pour faire adopter par la communauté internationale une
déclaration sur la protection du génome humain. Moins d’un demi-siècle après la découverte
de Watson et Crick, la double hélice a fait bien du chemin...

Extrait d’un éditorial des cahiers de l’express de Sylvie O'Dy

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 ACKNOWLEDGMENTS

I am grateful to Professor Josef M. Pfeilschifter who allowed me to work in this

laboratory with freedom and who supported me along my thesis. I would like also to thank
Dr. Herman Van Der Putten for the time and the energy he spent for me during these years. I
am grateful to all the other members of the group, in particular Gilles Sansig for his help in
the work with ES cells, Sabine Kauffmann for her assistance. I am also particularly grateful to
the members of my thesis committee Professor Dominique Fellmann for supporting me,
Professor Brigitte Kieffer, Dr. Jean-Louis Boulay, Dr. Florence Botteri and Professor Denis
Monard for accepting to be reporters and for their invaluable suggestions.

J’aimerais également remercier tous les membres de ma famille, mes amis et toutes les
personnes qui se sont impliquées dans ce travail.
A mes parents, en témoignage de ma profonde affection,
A Hervé, en témoignage de tout mon amour,
A ma sœur et à sa merveilleuse famille, en témoignage de mon affection,
A Monsieur et Madame Gauthey,

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 CONTENTS

PREFACE page 1

ACKNOWLEDGEMENTS page 3

CONTENTS page 4

LIST OF FIGURES page 5

ABBREVIATIONS page 7

RESUME/SUMMARY page 9

GUANOSINE TRIPHOSPHATE CYCLOHYDROLASE

GTP cyclohydrolase deficiency page 11

Background and structure page 20
Localization of GTPch I protein page 25
Regulation of GTP cyclohydrolase I page 28
HPH-1: a mouse mutant deficient in GTPch I activity page 36
La GTP cyclohydrolase I proteine page 39

GTP CYCLOHYDROLASE I PROMOTER

Isolation of 129Sv mouse Bacterial Artificial Chromosome (BAC)

containing the GTP cyclohydrolase I gene and its mapping page 46
GTP cyclohydrolase I promoter studies page 65
Expression of β -galactosidase under the control of GTPch I
Promoter in transgenic mice page 80

GTP CYCLOHYDROLASE I KNOCK-OUT MICE

Targeting mouse page 96

Inducible or conditional GTP ch I targeting vector
in embryonic stem cells page 109

DISCUSSION page 148

REFERENCES page 156

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 List of figures

Guanosine triphosphate cyclohydrolase I

Figure 1: Biopterin synthetic pathway and its relationship to the synthesis
of dopamine Page 13
Figure 2: Synthetic pathway of tetrahydropterin and its relationship to the
synthesis of dopamine and serotonine Page 17
Figure 3: The de novo tetrahydropterin pathway for H4biopterin biosynthesis. Page 20
Figure 4: The GTP cyclohydrolase active site Page 24
Figure 5: Photographs of GTPch I positive cells in the adrenal medulla and liver Page 25
Figure 6: GTPch I, TH and nNOS localization in nigra and ventral area Page 26
Figure 7: GTPch I, TH and nNOS localization in locus ceruleus Page 27
Figure 8: GTPch I, TH and nNOS localization in adrenal medulla Page 27
Figure 9: Effects of LPS treatment in vivo on GTP ch I and iNOS m RNA Page 30
Figure 10: GTPch I feedback regulatory protein (GFRP) Page 33
Figure 11: The proposed role of GFRP Page 34
Figure 12: Concentration-dependency of TPA-stimulated phosphorylation
of GTPch I Page 35
Figure 13: Phosphorylation of GTPch I by different agents Page 35
Figure 14: Comparison of TH and PHE protein in control and Hph-1 mice Page 37
Figure 15: Brain BH4 concentration in control and Hph-1 mice Page 38

GTP cyclohydrolase promoter

Figure 16: The BAC vector Page 50
Figure 17: 5‘ untranslated exon 1 part of GTPch I Page 56
Figure 18: Screening BAC superpools Page 57
Figure 19: Screening BAC pools Page 58
Figure 20: Screening mouse BAC colony DNA membranes Page 59
Figure 21: Mapping BAC clones Page 60
Figure 22: Mapping structure of GTPch I gene Page 61
Figure 23: Mapping of GTPch I BAC promoter localization Page 62
Figure 24: Mapping of GTPch I BAC exon 1 localization Page 63
Figure 25: Enzymatic mapping of 5‘ GTPch I gene Page 64
Figure 26: TAU-Lac Z protein Page 81
Figure 27: P2-IRES-tau-lacZ mice stained with X-gal Page 82
Figure 28: Schematic representation of GTPch I promoter-IRES-Tau-LacZ
reporter gene Page 85
Figure 29: Southern blots analysis of GTPchI promoter-IRES-tau-lacZ mice Page 86
Figure 30: Northern blots analysis of GTPchI promoter-IRES-tau-lacZ mice Page 89
Figure 31: Nothern blots muscle analysis Page 90
Figure 32: Transfected mDAT cells stained with X-gal product Page 92
Figure 33: Brain cells stained with X-gal Page 93
Figure 34: RT-PCR analysis of GTPchI-LacZ Page 95

5
 Knock-out mice

Figure 35: Differentiation between a simple gene replacement events

and integration of all vector components into the target locus Page 99
Figure 36: Enrichment strategies for gene targeting events Page 101
Figure 37: Schematic representation of site specific Cre/loxP system Page 103
Figure 38: The initiator NLS sequence Page 108
Figure 39: Strategy for a tissue-specific knockout Page 107
Figure 40: Deletion of lox P-flanked gene segments in vivo and transmission
of the acquired mutation through the germ line Page 108
Figure 41: Deletion of loxP-flanked gene segments Page 110
Figure 42: Conditional targeted vector Page 112
Figure 43: Selection marker genes for conditional targeted vector Page 113
Figure 44: Strategy for conditional targeted vector construction Page 114
Figure 45: Primary mouse embryo fibroblast cell cultures Page 118
Figure 46: Different stages of mouse embryonic stem clones after transfection Page 124
Figure 47: Generation of mouse germ line chimeras by micro-injection
of ES cells Page 127
Figure 48: ES cell-embryo co-cultures Page 132
Figure 49: PCR analysis of transfected single ES clones Page 133
Figure 50: Selection of homologous recombination event Page 135
Figure 51: Selection of lox P integration in the homologous
recombination event (1) Page 136
Figure 52: Selection of lox P integration in the homologous
recombination event (2) Page 137
Figure 53: Selection of lox P integration in the homologous
recombination event (3) Page 139
Figure 54: Stu I methylated site detection in the targeted vector Page 139
Figure 55: Detection of integration events Page 140
Figure 56: Schematic representation of targeted GTPch I gene in ES cells Page 142
Figure 57: RT-PCR detection of fusion GTPexon1/neomycin mRNA Page 143
Figure 58: General scheme for generating Knockout mice Page 144
Figure 59: Transmission of a disrupted gene within the mouse germ lines Page 147

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 ABBREVIATIONS

Aº Angstrom
BAC Bacterial artificial chromosome
BH4 Tetrahydrobiopterin
BSA Bovine serum albumine
Ci Curie
cNOS Constitutive nitric oxide synthase
CNS central nervous system
cRNA Complementary ribonucleic acid
CSF Cerebrospinal fluid
Da Dalton
DAHP 2, 4 Diamino-6-Hydroxypyrimidine
DAHP 2,4-Diamino-6-hydroxypyrimidine
DEX Dexamethasone
DEX Dexamethasone
DIG Digoxigenin
DMEM Dulbecco’s modified eagle’s medium
DNA Desoxyribonucleic acid
DRD Dopa responsive dystonia
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
ES cells Embryonic stem cells
FCS Fetal calf serum
GFP Green fluorescent protein
GFRP GTP cyclohydrolase I feedback regulatory protein
GTPch I GTP cyclohydrolase I
HPD Hereditary progressive dystonia
Hph-I Mouse mutant deficient in GTP cyclohydrolase I activity
IL-1 Interleukin 1
iNOS Inducible nitric oxide synthase
IRES Internal ribosomal entry site
JPD Juvenile Parkinson’s disease
Kb Kilobase
Kda KiloDalton
LB Luria-Bertani medium
L-DOPA L-3,4-Dihydrphenylalanine
LPS Lipopolysaccharide
M Mole liter -1
mg milligram
ml milliliter
Mr Molecular weight
mRNA Messenger ribonucleic acid
ng nanogram
NO Nitric Oxide
NOS Nitric oxide synthase
NOx Nitrate and Nitrite
o/n Overnight
OB Olfactory bulb
ºC Degrees Celsius
Pb Pair base

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PB Phosphate buffer
PBS Phosphate buffered saline
PCR Polymerase chain reaction
PD Parkinson’s disease
PHE Phenylalanine Hydroxylase
PKC Protein Kinase C
pmole picomole
R.TºC Room temperature
rAAV Recombinant adeno-associated virus
RNA Ribonucleic acid
rpm Revolutions per minute
RT Reverse transcriptase
SDS Sodium dodecyl sulfate
SSC Standard saline citrate
SV40 Simian virus 40
TBS Tris buffered saline
TH Tyrosine hydroxylase
TNF-α Tumor Necrosis Factor α
TPH Tryptophan hydrolase
U Unite
UTR Untranslated region
UV Ultra violet
YAC Yeast artificial chromosome
µ g Microgram
µ l Microliter
µ m Micrometer

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 Summary

Catecholamine biosynthesis is regulated by Tyrosine Hydroxylase (TH) requiring tetrahydrobiopterin

(BH4) as cofactor. BH4 is synthesized from GTP by GTP cyclohydrolase I (GTPch I), the first and rate-
limiting regulatory enzyme in this pathway. Mutations in the GTPch I gene that lead to decreased BH4
levels are responsible for some rare and familiar forms of dopa-responsive dystonia. No genetic evidence
exists for such mutations in Parkinson patients. Nevertheless, GTPch I is critically required and regulates
dopamine levels.

We used a PCR-based screen to isolate mouse Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) containing the
GTPch I gene. Oligonucleotides for this purpose were designed from a GTPch I cDNA sequence. The
GTPch I gene structure was confirmed and a 4 Kb GTPch I promoter-containing DNA fragment was
sequenced. Next, a 3.6 Kb GTPch I promoter-Lac Z reporter gene was generated and used to study
GTPch I promoter activity in vivo. Transgenic mice were produced by DNA micro-injection and eight
founders were obtained of which three did not yield germ line. Offspring of all other five founders were
tested for transgene mRNA and protein expression. High levels of transgene mRNA were detected in
testis, medium to low levels in muscle, and in one line, significant levels were detected in brain.
Histological visualization of lacZ enzymatic activity was not obtained in any of the tissues examined.
Western blot analysis revealed only very low concentrations of lacZ in the central nervous system and
muscle. Despite the very high transgene mRNA levels in testis, this tissue contained no lacZ protein.

A rodent model with disrupted GTPch I function could provide an animal model for testing
drugs/strategies to improve dopaminergic neuron function. To this end, a mouse 129 Sv/J DNA-derived
targeting vector was constructed of the GTPch I gene in an attempt to generate both conventional and/or
conditional mutants of this gene in mice. A conditional knockout (KO) was our prime goal. But upon
transfection into ES cells, one of the three lox-recombination sites in our targeting vector was always lost.
Nevertheless, the remaining 2-lox (lox-Neo-lox) configuration of the targeted GTPch I gene in embryonic
stem cells was found to disrupt gene function. Therefore, using such ES cells, attempts were made to
generate a constitutive GTPch I KO mouse. Expected phenotypes of such mice would include a) reduced
dopamine and BH4 levels in heterozygote (+/-) mice and their absence in homozygote (-/-) mice, b) dopa-
responsive dystonia in +/- mice (if dopamine levels are reduced sufficiently), and c), possibly, early
postnatal lethality and/or dopa-responsive dystonia in -/- mice. Chimeric mice were produced with three
different ES clones carrying a properly targeted GTPch I allele. The chimeras were generated by
aggregation and breedings are ongoing to establish a knockout line.

9
 Résumé

La tyrosine hydroxylase (TH) régule la biosynthèse des catécholamines grâce au cofacteur nommé
tetrahydropterine (BH4). BH4 est produit à partir du GTP par l’action de la GTP cyclohydrolase I
(GTPch I), le premier et le plus important des enzymes (Tyrosine hydrolase, Dihydropterine reductase,
Dopamine decarboxylase) régulant cette voie de synthèse. Des mutations du gène de la GTPch I
entraînent une diminution du niveau de BH4 responsable des formes rares et familiales de dystonies. Il
n’existe pas d’évidence de telles mutations dans le cas de patients atteints de parkinsonisme. Cependant
GTPch I est le point central des régulations du niveau de dopamine.
Nous avons utilisé une sélection par PCR pour isoler ce gène d’une banque de chromosomes artificiels
bactériens de souris. Dans cette optique, des oligonucléotides spécifiques à la séquence de l’ADNc de
GTPch I ont été utilisés. La structure du gène a été confirmée et 4 kilobases (Kb) du promoteur ont été
séquencé. Par la suite, 3,6 Kb de ce promoteur fusionné avec le gène rapporteur lac Z a été créé et utilisé
pour étudier l’activité du promoteur de GTPch I in vivo. Des souris transgéniques ont été créé par micro-
injection d’ADN. Cinq lignés ont été obtenues et testées pour l’expression du transgène (ARNm et
proteine). De hauts niveaux d’ARNm transgénique ont été détectés dans les testicules, des niveaux
moyens à faibles dans les muscles et un niveau significatif dans le cerveau d’une lignée. L’analyse
histologique de l’activité de l’enzyme lacZ n’a pu être visualisé dans aucuns des tissus examinés. Les
analyses par Western blot ont révélé de très faible concentration de protéine dans le système nerveux
centrale et dans le muscle. En dépit de niveau élevé d’ARNm du transgène dans les testicules, ces tissus
ne contenaient pas de protéine lacZ.

Un modèle de rongeur avec une fonction altérée de GTPch I pourrait fournir un modèle animal pour tester
des drogues et des stratégies dans le but d’améliorer les fonctions neuronales dopaminergiques. Pour cela,
un vecteur cible de GTPch I dérivé d’ADN 129sv/J de souris a été construit pour générer des mutants
conventionnels et conditionnels. Bien que le knockout (KO)conditionnel ait été le but principal, durant la
transfection dans les cellules embryonnaires souches (ES), un des trois sites lox de la construction a été
perdu. Néanmoins, les deux loxP (lox-Neo-lox) de la construction cible restant dans les cellules ES ont
montré une altération de la fonction du gène GTPch I. Par conséquent, utilisant ces cellules ES ainsi
modifiées, nous avons générer une souris potentiellement KO. Les phénotypes espérés d’une telle lignée
pourraient inclure a) une réduction du niveau de dopamine et de BH4 dans les souris hétérozygotes (+/-)
et leur absence dans les homozygotes (-/-) b) le développement d’une forme de dystonie dans les
hétérozygotes c) une possible létalité et/ou une sévère dystonie pour les -/-. Des souris ont été produites à
partir de trois clones de cellules ES différents porteur de la mutation sur un allèle du gène de GTPch I.
Les chimériques ont été générées par agrégation et l’élevage se poursuit pour établir une lignée de KO.
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