Norllle

Marocaine

NM ISO 7402
2002
Indice de classement NM 08.0.106

Microbilogie Directives gnrales pour le dnombrement sans revivification des Enterobacteriaceae

Technique NPP et mthode par comptage des colonies

N orme

Marocaine

homologue
par arrt conjoint du Ministre de l'Industrie, du Commerce, de l'Energie et des Mines et du Ministre de l'Agriculture, du Dveloppement Rural et des Eaux et Forts

--

..

~---_._--

mu-

-.~~._-

' ..' ' ~

~----------._--.--

--

Correspondauce
La prsente norme reprend intgralement la norme ISO 7402/1993.

Modifications

Examine

et adopte par le comit technique de normalisation des mthodes d'analyse et d'chantillonnage des denres alimentaires Edite et diffuse par le Service de Normalisation Industrielle Marocaine (SNIMA)

SNIMA 2002

NlVI ISO i402

S01VIMAlRE
Page

1 Do Blain e d'a p p Iicatio n

2 R f l'en ces no rma tiv es 3 Dfini ti 0ns 4 Prin cipe 5 Diluant, milieux de culture et ractif ..............................................

...... ... ..... ....................... .....

1 1 1

..

1 2 4 4
.

6 A p p areilla ge et verreri e 7 E chan till 0nn a ge 8 Preparation de l'chantillon

......... ......................................................... pour essai

,, ,-~

4
.. -. ---'-'.._-..-.-------....-.-----

9 NIode 0pra toi re

10 Ex p ressi 0n des rsultats

...... ...........

4
6

Il Rapport

d' essai

~............................................................................ ................. ........

Ann exe A Ann exe B

A n Ilex e C.............................................................................................

8 10 11

11

NORME INTERNATIONALE

ISO 7402:1993(F)

Directives gnrales pour le dnombrement sans revivification des Enterobacteriaceae - Technique NPP et mthode par
Microbiologie
~

comptage

des colonies
"-

'

"

Domaine d'application

tuent des. disposition-s valables pour la !:>rs8n1e

Norme internationale. Au moment de la publication, les ditions indiques taient en vigueur. Toute norme est sujette rvision et les parties prenantes des accords fonds sur la prsente Norme internationale sont invites rechercher la possibilit d'appliquer les difions les plus rcentes des normes

La prsente Norme internationale donne des directives gnrales pour le dnombrement des Enterobacteriaceaedans les produits destins la consommation humaine ou l'alimentation animale
;

~~~-,.~"'~~~::.;"C~...~-:::..~::~;:::~~~~~~:=~=~,~ ..' solide aprs incubation

,

indiquesci-apr~.Les membres de.la CEI~tdeTISO 'par calcul d nombre le plus probable (NPP) aprs .incubation 35_oCou37 C en milieuliqide; "-_n__P?~~dent le registre des Normes mternatlonales en
:~--::;:~~-.~-:~::o",:=:,==:~~=:::.,:,~::vI9U,~uL~cC_,!q::rnRcI11~PtdpDnE3_::;=~::;..

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i_.::0~0;Z~:.;~p~r~CJ!.rnRt~g~2ges7~Golonie~.96ten1Je-s?err:milie"\J0~c:~:::::':~=,.:;;=;","~-=~=='::#0:

35C
. ..

ou 37 C;-

..~:

'."

- OffectIVes gnerales pour la prparation des dilutions en vue de l'examen U

ISO 6887:r983, MicrobIologie microbiologique.. .'; ".
;ccc
-, .'.,

~~..~=tTi=':-;~:'~~:::~~~:;~;~:;=2:2.

La temprature

utilise

doit faire l'objet

.' . "

d'un accord

entre les parties concernes et doit tre mentionne dans le rapport d'essaI..
NOTE 1 Dans le casdes produits rfrigrsetcongels, une temprature d'incubation de 30 .C est recommande, notamment lorsque le dnombrement est effeCtu dns uri . .
but .-technologique...
-

ISO 7218:1985, Microbiologie - Directives gnrales pour les examens microbiologiques:_~7',.

----'-.-u_u_.--..

3. .Definitions Pour les besoins de la prsente Norme-internationale,

1 d f initions suivantes s'appliq.uent,;:=~ es
. 3.1 Enterobacteriaceae: ]antJe. g!cose_fd6r1bao!
.-' '.

PourJes petits nombres, la techniqueNPP est prf"rable;- sinon -on -prfrera -la -mthode par-comptage des colonies. '
.La ...prsente Norme. ,internationale:n'inclutpas ..~de
..

,. _.--

Micro-organismes fermenun~r~ction._p~dasentE~-~.
'. -. -:

technique de revivification, et les rsultats ne doivent pas tre relis aux critres ou spcifications bass sur
Jasuppsitionqi.J'ur'rvlvificatiOn
"..~ '. .:-~--

gative lorsque, l'essai, est effectu. .selon .Iamthode . ,

----;,'~--"-.

. ->spcifie.'-c:'~ .-

ateffeCtue':;.~
m. :-~---u'

Nombred'Enterobacteriaceae trouvpar~miUilitre ou tion de la prsente Norme internationale, du fait que. -=par gramme d'chantillon lorsqut.ssai esteftectue: ,.
Des'limites'

sonfimposs-aux

:.:

..~::'-"'.-'"

3.2 dnombrement
mthode_spcifie.

-..

...

des

..-

:;.-:;c
u.

..:;.-::=-:---,

-,<.,._n
-

Enterobacteriaceae:--

possi~ili1ei'apJ)lia~

ces..rnth()des ~()IJ~~jettes~AE!:grande.~yaria1ion~___'selon1a Il est recommand d'employer.c~s mthodes et d'in-. . terprter lesrsltats la.' lumire "aes:rensei~ gnements .donn~er1. J O,3,;~_.T)
, .
.

.".''-~

Rfrences
.

normatives
~""'~>,;~,;"" . -.,

. . ,4.1.Prparationdesdilutions
'

,,,,",-~'...,.~ . .

~~;;i.~=.':'
- .~ --. -.-,.J . -.. '..;,c."; - -. ',. -' .

Les normes suivantscontiennentdes dispositions qui, par suite de la rfrence qui en est faite.consti~

partir dl;chantillon
dilutions dcimales.

po~r ~s~a-i,~~r~~~~tionde~;."

7402:1993(F)

Dnombrement

des Enterobacteriaceae

Diluant, milieux de culture et ractif

1 Technique du nombre le plus probable P)

"E2 Il est recommand d'utiliser cette technique 1ue le nombre cherch est suppos se trouver dans Hvalle de 1 100 par millilitre ou par gramme d'chan) pour essai.

5.1

Gnralits de laboratoire, voir

Pour les pratiques courantes l'ISO 7218.

emencement de trois tubes de milieu double centration avec une quantit dtermine de hantillon pour essai si le produit examiner est Iije, ou avec une quantit dtermine de suspenl mre dans le cas d'autres produits. ;emencement de trois tubes de milieu simple Icentration avec une quantit dtermine de :hantillon pour essai si le produit examiner est Iide, ou avec une quantit dtermine de suspenn mre dans le cas d'autres produits, puis, dans les imes conditions, ensemencement de trois tubes milieu simple concentration avec la premire dilu1 dcimale obtenue partir de l'chantillon pour ,ai ou de la suspension m'e. :ubation des tubes 35 e ou 37 e (selon accord) ndant 24 h. Jartir du nombre de tubes confirms positifs, calcul nombre le plus probable ci'EnterJbacteriaceae,par lIiTitre ou par gramme d'chantillon pour essai au Jyen de la table NPP (voir annexe A).

5.2

Diluant

Voir l'ISO 6887 et la norme spcifique traitant du

produit analyser.

5.3

Milieux de culture

5.3.1 Milieu tamponn, la bile, au vert brillant et au glucose (milieu E.E.) 5.3.1.1 Composition
a) Milieudouble. concentration.
Peptone Glucose Hydrognophosphate disodique (Na2HP04) Dihydrognophosphate
de potassium (KH2P04)

b) Milieu simple concentration 10.09 5,0 9 6.459 2.0 9 20,0 9 0,015 9 1 000 ml

20,09 10,0 9 12,90 9 4.0 9 40,0 9 0,030 9 1 000 ml

2.2 Comptage des colonies

JTE 3 1\ est recommand d'utiliser cette technique rsque le nombre cherch est suppos suprieur 100 par illilitre ou par gramme d'chantillon pour essai.

nsemencement en profondeur du milieu glos la ile, au cristal violet et au glucose, coul dans deux otes de Petri, avec une quantit dtermine de chantillon pour essai si le produit examiner est liuide, ou avec une quantit dtermine de la sus,ension mre dans le cas d'autres produits. lecouvrement avec une couche du mme milieu. )ans les mmes conditions, ensemencement d'aures paires de botes avec les dilutions dcimales obenues partir de l'chantillon pour essai ou de la iuspension mre. ncubation des botes 35 e ou 37 e (selon accord) Jendant 24 h :!: 2 h.

Bile de buf dshydrate Vert brillant Eau

5.3.1.2

Prparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dshydrat dans l'eau, en portant le tout bullition. Ne pas chauffer le milieu plus de 30 min. Refroidir le milieu rapidement. Ajuster le pH, si ncessaire, de sorte qu'aprs bullition, il soit de 7,2 25 e. Rpartir le milieu de culture par quantits de 10 ml dans des tubes striles (6.8). Ne pas striliser le milieu l'autoclave. Le milieu peut tre conserv 1 semaine au maximum entre 0 C et 5 e.

~ partir du nombre de colonies caractristiques confirmes par bote de Petri. calcul du nombre d'Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme . d'chantillon pour essai.
2

ISO 7402:1993(F)

5.3.2 Glose la bile, au cristal violet et au glucose (VRBG)

5.3.3

Glose glucose Composition

5.3.3.1 5.3.2.1 Composition

7,0 9 3,0 9 1,5 9 10,0 9 5,0 9 0,03 9 0,002 9 818g1) 1 000 ml
Tryptone

10,0 g 1,5 9 10,0 9 5,0 9 0,015 9 8g18g1) 1 000 ml

Extrait de levure

Peptone Extrait de levure Sels biliaires Glucose Chlorure de sodium Rouge neutre Cristal violet Agar-agar, en poudre ou en flocons Eau

Glucose Chlorure de sodium Pourpre de bromocrsol Agar-agar Eau

1) Selon le pouvoir glifiant de l'agar-agar.

5.3.3.2

Prparation

1) Selon le pouvoir glifiant de l'agar-agar.

Dissoudre les composants ou le milieu complet dshydrat dans l'eau, en chauffant si ncessaire. Ajuster le pH, si ncessaire, de sorte qu'aprs strilisation, il soit de 7,0 25C.

5.3.2.2

Prparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet ds~ hydrat dans l'eau, en portant le tout bullition. Ne pas chaufferie milieu plus de 30 min.c-<oc"=,--=H~"
--~ ,~ --__0'__- _n_.._

Rpartir le milieu de culture par quantits de 15 ml dans des tubes (6.8). Striliser~nl'I~!o_clave (6.1) rgl~~"J 2JoC pendln~ .
-.

Ajuster le pH, si ncessaire, de sorte qu'aprs bullition, il soit de 7,4 25C. Rpartir le milieu de culture dans des tubes striles ou dans des flacons striles (6.5) de 500 ml de capacit maximale. Ne pas striliser le milieu l'autoclave. Prparer ce milieu extemporanment 9.3.1 ). (voir 9.2.2 et

. -'.. ._-~-- - ~- -- -

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15 min.
-~ -

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~--

Maintenir les tubes en position verticale. Le milieu peut tre conserv 1 semaine au maximum entre 0 "C et 5 "C. Juste avant l'emploi, chauffer dans de l'eau bouillante ou sous courant de vapeur pendant 15 min, puis refroidir rapidement la temprature d'incubation.

5.3.4 Glose nutritive

5.3.4.1 Composition
3,0 9 5,0 9 818g1) 1 000 ml de l'agar-agar.

5.3.2.3 Prparation des botes de glose (seulement ncessaire pour la technique NPP 9.2.2)

voir

Extrait de viande de buf

Pepton
Agar-agar, Eau 1) Selon le pouvoir glifiant en poudre ou flocons

Transfrer immdiatement environ 15 ml du milieu de culture, refroidi environ 45 "C, dans des botes de Petri (6.3) et laisser se solidifier. Juste avant l'emploi, scher les botes de glose, de prfrence avec le couvercle enlev et la surface de la glose tourne vers le bas, dans une tuve (6.3) jusqu' schage de la surface de la glose. Si elles ont t prpares l'avance, les botes de glose non sches ne doivent pas tre conserves plus de 4 h la temprature ambiante ou plus d'un jour entre 0 C et 5C.

5.3.4.2

Prparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dshydrat dans l'eau, en chauffant si ncessaire. Ajuster le pH, si ncessaire, de sorte qu'aprs strilisation, il soit de 7,0 25 "C.

ISO 7402:1993(F}

Rpartir le milieu de culture dans des tubes ou des

6.4 pH-mtre, prcis :t 0,1 unit pH 25 "C. 6.5 Bain d'eau, ou dispositif similaire, rglable
45 'C :t 1 'C. 6.6 Botes de Petri, en verre ou en matire plastique, de diamtre 90 mm 100 mm.

flacons (6.8) de 500 ml de capacitmaximale.

Striliser l'autoclave (6.1) rgle 121 'C durant 15 min.

5.3.4.3 Prparation des botes de glose (voir

9.4.1 ) Transfrer immdiatement environ 15 ml du milieu de culture, puis refroidir environ 45 'C, dans des botes de Petri (6.6) et laisser se solidifier. Juste avant l'emploi, scher les botes de glose, de prfrence avec le couvercle enlev et la surface de la glose tourne vers le bas, dans une tuve (6.3) jusqu' schage de la surface de la glose. Si elles ont t prpares l'avance, les botes de glose non sches ne doivent pas tre conserves plus de 4 h la temprature ambiante ou plus d'un jour entre 0 'C et 5 'C.

6.7 Anse boucle, d'un diamtre d'environ 3 mm, et fil droit en platine iridi ou en nickel-chrome, ou baguette de verre ou anse boucle usage unique.
NOTE 5 Le nickel-chrome ne convient pas pour l'essai l'oxydase (voir 9.4.2.1).

6.8 Tubes essai, de dimensions 16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm environ, et flacons ou fioles, de capacit comprise entre 150 ml et 500 ml.

5.4

Ractif pour "essai "oxydase

Pipettes gradues coulement total, de capacits nominales de 1 ml et 10 ml, gradues res6.9 pectivement en 0,1 ml et 0,5 ml.

5.4.1 Composition

7
Dichlorhydrate de N,N,N',N'

chantillonnage
ou

.. 1,O.g =.o~ ,.-c. _.J00 ml-_",o.

ttramthyl-p-phnylne diamine

Eau
-

d -u U_---------

-.. till()nrellrI!~nr}epr5erltatif, non endomm-ag modifilors-du transportet-del'entreposage."'----

Il est important que le laboratoire reoive un chan-

5.4.2 Prparation
Dissoudre le ractif dans l'eau froide. Prparer le ractif immdiatement avant usage.

L'chantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie dans la prsente Norme internationale. S'il n'existe pas de Norme internationale spcifique l'chantillonnage du produit concern, il est recommand que les parties concernes se mettent d'accord ce sujet.

Appareillage et verrerie
Le matriel usage unique est acceptable au
si ses spcifications .

Prparation

de l'chantillon

pour

essai

NOTE 4

mme titre que la verrerie rutilisable, . sont similaires.-

Matriel courant de laboratoire de microbiologie, et notamment: 6.1 Appareil pour la strilisation en chaleur sche (four) ou en chaleur humide (autoclave) Voir l'ISO 7218. 6.2 tuve, rglable 37 'C :t 1 'C. ou

Prparer l'chantillon pour essai conformment la Norme internationale spcifique du produit concern. S'il n'existe pas de Norme internationale spcifique, il est recommand que les parties concernes se mettent d'accord ce sujet.

Mode

opratoire

9.1 Prise d'essai, suspension mre et diiutions

.. .

Voir l'ISO 6887 et la norme spcifique traitant du

produit concern. Prparer une seule srie de dilutions dcimales partir de l'chantillon pour essai si le produit est liquide, ou de la suspension mre dans le cas d'autres
produits. .

6.3 Enceinte de schage ou tuve, rglable entre

35 'C :t 1 'C et 55 'C :t 1 'C.

ISO 7402:1993(F)

9.2
9.2.1

Technique

NPP
et incubation

Recommencer ces oprations avec des dilutions successives, l'aide d'une nouvelle pipette strile, pour

Ensemencement

chaquedilution dcimale.

Prendre trois tubes de milieu double concentration [5.3.1.1, a)]. Transfrer, dans chacun de ces tubes, avec une pipette (6.9), 10 ml de l'chantillon pour essai si le produit est liquide, ou 10 ml de la suspension mre dans le cas d'autres produits. Prendre trois tubes du milieu simple concentration [5.3.1.1, b)]. Transfrer, dans chacun de ces tubes, avec une nouvelle pipette (6.9), 1 ml de l'chantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la suspension mre dans le cas d'autres produits. Prendre trois autres tubes de milieu simple concentration [5.3.1.1, b)]. Transfrer, dans chacun de ces tubes, avec une nouvelle pipette (6.9), 1 ml de la premire dilution dcimale (10-1) de l'chantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la premire dilution dcimale de la suspension mre (10- 2) dans le cas d'autres produits. Faire incuber ces neuf tubes durant 24 h 35C ou 37 cC.

9.3.1.2 Couler, dans chaque bote de Petri, environ 15 ml du milieu glos la bile, au cristal violet et au glucose (5.3.2), prpar puis refroidi environ 45 .C au bain d'eau (6.5). Le temps qui s'coule entre la fin de la prparation de la suspension mre (ou de la dilution au 10-1 dans le cas d'un produit liquide) et le moment o les dilutions entrent en contact avec le milieu (5.3.2) ne doit pas dpasser 15 min. Mlanger soigneusement l'inoculum au milieu par des dplacements horizontaux des botes et laisser le mlange se solidifier en posant les botes de Petri sur une surface frache et horizontale.

9.3.1.3 Aprs solidification du mlange, ajouter une

couche superficielle compose d'environ 10 15 ml du milieu glos la bile, au cristal violet et au glucose (5.3.2), prpar puis refroidi comme dcrit en 9.3.1.2, afin d'empcher l'talement des colonies et d'obtenir des conditions de semi-anarobiose. Laisser .

se solidifier comme dcrit ci-dessus.

9.2.2

Isolement
incubes (voir 9.2.1). sur des botes de

9.3.1.4
24 h.

Inverser les botes prpares et les incuber l'tuve rgle 35C ou . 37 C (selon accord) durant .
.

Ensemencer en stries une anse (6.7) de chacune des

neuf cultures

u.u_._~_u~-=.~.

. .

.-

~~~;.~),~: f~:~;i~~~~~~tf~sVi~~~~:ta~5g:~c~~e3~v~~"--~'--9~3:2---C~mpiige~f;slect')nC"dtfs:c~lonies"-'" (selon accord) durant 24 h.

9.2.3

Slection

des colonies

pour confirmation

partir des botes incubes en 9.2.2, prsentant un dveloppement de colonies caractristiques roses rouges (avec ou sans halo de prcipit). ou incolores, muqueuses, prlever au hasard cinq de ces colonies en vue de la confirmation biochimique (voir. 9.4.2) effectuer aprs une sub-culture (voir 9.4.1).

Choisir les botes (9.3.1.4) contenant moins de 150 colonies caractristiques (voir 9.2.3) ayant un diam- tre de 0,5 mm ou plus. Compter ces colonies suspectes. Prlever au hasard cinq de ces colonies sur chacune. des botes de Petri de la confirmation biochimique (voir 9.4.2) effectuer aprs une sub-culture

(voir 9.4.1).

9.3 Technique par comptage des colonies

9.3.1 Ensemencement et ihcubation 9.3.1.1 Prendre deux botes de Petri striles (6.6).
l'aide cune si le mre d'une pipette strile de ces botes, 1 ml produit est liquide, dans le cas d'autres (6.9). transfrer, dans chade l'chantillon pour essai ou 1 ml de la suspension produits.

Considrer la dtermination sans valeur si la moiti ou plus de la surface d'une bote est envahie. Si moins de la moiti de la surfac.e d'une bote est envahie, effectuer le dcompte des colonies sur la partie claire et. extrapoler pour que le nombre .corresponde la surface totale de la bote.

9.4

Confirmation

9.4.1 Sub-culture
Ensemencer en stries sur des botes de glose nutritive (5.3.4) chacune des colonies slectionnes en vue de la confirmation (voir 9.2.3 et 9.3.2). Faire incuber ces botes durant 24 h :!::2 h 35 .C ou 37 .C (selon accord). Slectionner une colonie bien isole partir de chacune des botes incubes en vue de confirmation biochimique (voir 9.4.2).

Prendre deux autres botes de Petri striles. raide d'une nouvelle pipette strile (6.9), transfrer 1 ml de la premire dilution dcimale (10-1) de l'chantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la premire dilution dcimale de la suspension mre (10-2) dans le cas d'autres produits.

ISO 7402:1993(F)

9.4.2 9.4.2.1

Confirmation biochimique Essai l'oxydase

Enterobacteriaceae, le nombre de micro-organismes prsents sera le mme que celui trouv au comptage effectu en 9.3.2. Dans tous les autres cas, le nombre doit tre calcul partir du pourcentage de colonies oxydase ngative et glucose positif par rapport au nombre total de colonies slectionnes (voir 9.3.2). Arrondir le rsultat un nombre entier de colonies.

l'aide d'une anse boucle ou d'un fil en platine iridi ou d'une baguette de verre (6.7). prendre une fraction de chacune des colonies bien isoles (9.4.1) et ensemencer par stries sur papier filtre humect de ractif, (5.4) ou sur un disque disponible dans le commerce. Il ne faut pas utiliser d'anse ni de fil mtallique en nickel-chrome. Considrer l'essai comme ngatif si la couleur du papier filtre imbib de ractif n'a pas vir dans les 10 s. Pour les disques prts l'emploi, indications du fabricant. 9.4.2.2 Essai de fermentation se conformer aux

10.2.2 Cas gnral

Calculer le nombre N d'Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme de produit, l'aide de l'quation suivante:

Repiquer les mmes colonies slectionnes en 9.4.1, avec un fil ensemencer (6.7). dans des tubes contenant du milieu glucos (5.3.3). Faire incuber durant 24 h 35C ou 37 C (selon accord). Si une couleur jaune se dveloppe dans la totalit du -contenu du tube, la racti)n est considre comme positive. La plupart des souches produisent du gaz.

N=

L>
(n, + 0, 1~)d

est la somme des colonies aprs identification sur toutes retenues;

comptes les botes la pre la

n,
.

est le nombre de botes retenues mire dilution; est .Ie-nombre de botes -

10

Expression

des rsultats
. -"""---.-.....-...----.-.. ---

--~-c.. c~~--~~.~:~=-~~JjE3tJ~lmedilutlQft;="

retenues

-10.1 Calcul du nombre le plus probable - .-'-"-----.

(NPP)
10.1.1 Compter le nombre de tubes raction positive pour chaque dilution. donnant une

est le taux de dilution correspondant la premire dilution.

v

Arrondir les rsultats calculs deux chiffres sianificatifs. Noter comme rsultat le nombre d'Enterobacteriaceae par millilitre ou par gramme de produit, exprim par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multipli par 1Cf, o x est la puissance approprie de 10. EXEMPLE Un dnombrement direct d'Enterobacteriaceae donn les rsultats suivants: a

10.1.2 Si l'une des colonies caractristiques (9.2.3) slectionnes partir d'une sub-culture (voir 9.4.1) est oxydase ngative et glucose positif, le tube qui est l'origine de cette sub-culture doit tre considr comme positif. 10.1.3 Au moyen de la table de NPP (voir annexe A). dterminer, partir du nombre de tubes positifs dans les diffrentes dilutions, le coefficient du nombre le plus probable (NPP). 10.1.4 Dans le cas de produits liquides, le nombre d'Enterobacteriaceae par millilitre est gal au coefficient NPP divis par 10. Dans le cas d'autres produits pour lesquels des suspensions mres sont prpares, le nombre par gramme est gal au coefficient NPP.

la premire

lonies;

diiution (10-

3) retenue: -66 et 80 co-

la seconde dilution (10-4) retenue: 4 et 7 colonies.

On t repiques: pour 66 colonies: 5 colonies,dont4ont aux critres, d'o a = 50;

-

tO.2

Calcu! partir du nombre de coionies

rpondu

10.2.1 Gnralits
Si au moins 80 % des colonies caractristiques slectionnes (voir 9.3.2) sont oxydase ngative et glucose positif, et donc confirmes comme tant des

pour 80 colonies: 5 colonies, dont 3 ont rpondu aux critres, d'o a = 48; pour 7 colonies: 5 colonies, dont 4 ont rpondu . aux critres, d'o a = 6;

6
-. -_.'--,-' ._-~--, "---_.--

ISO 7402:1993(F)

pour 4 colonies: les 4 se sont toutes rvles tre le microorganisme recherch.

moins de 1 micro-organisme par millilitre (produits liquides); (autres produits), d tant le taux de dilution de la suspension mre. Fidlit Mthode NPP
moins de 1 x el' micro-organisme par gramme

Il s'ensuit que

N=

l>
(n, +0,1~)d 66 + 48 + 6 + 4 (2+0,2) x 10-3 124 = 56 363 2,2 x 10-3

10.3 10.3.1

Arrondir deux chiffres significatifs, soit 56 000 ou 5,6 x 104 Enterobaeteriaeeae par millilitre ou gramme de produit. 10.2.3 Estimation des petits nombres

Il est connu que des variations importantes peuvent tre observes avec la technique du NPP. Les rsultats obtenus selon cette mthode doivent tre utiliss avec prudence. Les limites de confiance sont donnes dans l'annexe A. 10.3.2 Mthode pour comptage des colonies
..'

Si les deux botes, au niveau de l'chantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mre (autres produits), contiennent moins de 15 colonies, faire la moyenne m des colonies comptes sur les deux botes. Donner le rsultat sous la forme:

Pour des raisons d'ordre uniquement statistique, dans 95 % des cas, les limites de confiance de la mthode par comptage des colonies varient de :t 16 % :t 52 %'); pour des dnombrements infrieurs 15 colonies par bote, les limites de confiance sont donnes dans l'annexe B. En pratique, des variations plus importantes encore peuvent tre observes et, en particulier, entre les rsultats obtenus par diffrents oprateurs.

nombre estim (NE)d'Enterobacteriaceae par millilitre:

,NE = m(produits liquides)~u --~ ~

".Rapportd'essai
.

nombre estim gramme:

(NE) d'Enterobacteriaceae

par

Le'rapport' 'essai6it ndiqerl-mthoe' utilise,'la temprature d'incubation et les rsultats obtenus. Il doit, en outre, mentionner tous les dtails opratoires facultatifs, ainsi que les incidents ventuels susceptibles d'avoir agi suries rsultats.

non prvus dans la prsenteNormeinternationale,ou -

NE= m x el' (autres produits), d tant le taux de dilution de la suspension mre. 10.2.4 Aucune colonie caractristique

Si les deux botes, au niveau de l'chantillon pour essai (produits liquides) ou de la suspension mre (autres produits), ne contiennent aucune colonie caractristique, donner le rsultat sous la forme

Le rapport d'essai doit donner tous les renseignements ncessaires l'identification complte de l'chantillon.

1)

Voir

Cowell N. D. and Morisetti M. D.. J. Sei. Fd. Agrie., 20, 1969, p. 573.

ISO 7402:1993(F)

Annexe A
(normative)
Dtermination
Voir tableau A1 et tableau A.2.
Tableau
Nombre de rsultats positifs Coefficient NPP1)

du nombre le plus probable

A.1
Limites de confiance1)3) ~ 95 % ~ 99 %

Catgorie2).lorsque le nombre d'essais est 2 3 5 10

--. 2 .10,01'

o o o o o o
1 1 1 1 1 1 1
,

o o
1 1 2 3

o 1 o .
1

< 0,30
..

0,00
3. 2
_u

0,94
0,95. .0,00

0,00 0,00 0,05 0,18 0,01 0,05 0,2 0,06 0,2 0,2
0,2 u~0,05--2,50

1,40
1,40

0,30

0,30
.0,61

2
HO

1
--3m3

1 2 0 1 1

1 1 3 1. 1 3 1 2.
2.'

0,01 0,12 0,35 0,02 0,12 0,4 '0,132,00 0,4

0;5'

1,00 1,70 3,50 1,70 1,70 3,5 3,53,5.

3,8

1,60

3-3-:---0,121,70

o o o 1 1 2 2

o o o 1 2
.0 1

o 1
-

0,62 0,94 0,36 0,72 1,1 0,74 1,1 1,1 1,5

~~~:~;&962-=~~;=-

3 0 1 2 O. 1 3 -.2 3

2 0 1 2

2 0 1 1 3 11 1 3 2 2 2L___1--_J.-OA. 3 3 '3'

2,50 4,60 2,50 2,50 4,6 2,70 - 4,6 4,6 .

5,2

.~u ,2... .0 .':':.-'C==.2::..'::'..-0

~}~~~t~i~ii~-rfZ-;;~~~t~~~~~
.1'.

2 21 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0 1 1 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

=:c:cc1 ;4~=.cc-==c22C'-~-.~i=='1==1=-~=1-~-" O. 2,0 3 3 3

.1,5

o 1 2 o , 2 o , o
-

.2,0 2,7 2,1 2,8 3,5

2,9

2 -0 1 3 0
32

11

- 1

.3 1 '.0,4

~-~0~i5~~2;:;3\8b~i .~g,J7~~~...~~~go~~~-c:,=0;4='='~~~~.3;5~""-""'+0;2 ---~4,6 = ~ 0,5 3,8 0,2 5,2

3,8 .:0,2 .5,2

2 -3 11. 2
1 1
-

3 2 0
2

1 3 1 2.. '. 0
2

1 3 1 1. 3 3
1 -,
.

0,5 0,9 0,5 0,9 0,9 .9.4u

0,9

3,8 9,4 4,0 9.4

9.4

0,2,5,2 0,5 0,2 0,5 - 0,5

0,5

14,2 5,6 14,2 14,2

14,2

3,6
2,3

03
L

3
1 1
21 2

3
, 1
--2--:-2 nu .. 11. ..1.._1_=:. -- .2 -- ..3 .1.

0,99.4
0,5 0,9
. 9.4 18,118,1.0,5 19,9 36.. 38.--: ..2

0,5
0,3

--

14,2
14,2

1 2

3,8
6,4 4,3 7,5 12 16-0

1
3 1 1 3

.10.4

.._0,5

---

15,7_..
-

o 1 2 3 o 1 2 3 o 1 2 3

3 1.1 1 200

-1,6 <0,9 1,7 3 3-.3

~-1,0'--1,1 -2 -

25,0... 25,0 .27,0 44 52

9,3 15 21
29 24 46

1 1 , ._1 1 2 __1 3 3---3 1 1 , --_n:':11

1 1
1.

11-1,8 L - L .. .- . ,-,
2 - .-:2. -1..-'-.

3 3
- 9 4. .198

36,0 382 40 .
- 99 _99

.1,243,0 2
535

52 56
-152 152 283H

.-:.:,.

:-:':-':'':'1:''-:''--9

110 > 110

11

. -1

.20400

10

570

1) D'aprs De Man, J. C., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17,1983, pp.301-305.

2) Voirtableau A.2.

3) Les limites de confiance donnes dans ce tableau ne sont destines qu' fournir quelques notions de l'influence des variations statistiques sur les rsultats. Il y .,aura toujours d'autres sources de variations qui peuvent mme,quelquefois,.. . .. . tre plus importantes.

'8

ISO 7402:1993(F)

Tableau A.2 Catgorie1)

Catgories
Dfinition

Lorsque le nombre de bactries dans le produit est gal au NPP trouv, le rsultat est un de ceux qui ont le plus de chances d'tre obtenus. Il existe tout au plus 5 % de chances d'obtenir un rsultat qui est le moins probable que le moins probable dans cette catgorie. Lorsque le nombre de bactries dans le produit est gal au NPP trouv. le rsultat est un de ceux qui ont le moins de chances d'tre obtenus. que mme le moins probable dans la catgorie 1, mais il existe tout au plus 1 % de chances d'obtenir un rsultat qui est le moins probable que le moins probable dans cette catgorie. Lorsque le nombre de bactries dans le produit est gal au NPP trouv. le rsultat est un de ceuxiqui ont le moins de chances d'tre obtenus. que mme le moins probable dans la catgorie 2, mais il existe tout au plus 0.1 %;de chances d'obtenir un rsultat- qui est le moins probable que le moins probable dans cette catgorie. Lorsque le nombre de bactries dans le produit est gal au NPP trouv, le rsultat est un de moins de chances d'tre obtenus, que mme le moins probable dans la catgorie 3. Il n'existe de 0,1 % d'obtenir un rsultat dans cette catgorie, sans que rien ne soit faux. ceux qui ont l qu'une chance -. -.

1) Avant de commencer les essais, il faut dcider quelle catgorie sera acceptable, c'est--dire seulement la catgorie 1, 1 et 2, ou mme 1. 2 et 3. Si la dcision est trs importante. pour tre prise sur la base des rsultats, on acceptera seulement les rsultats de la catgorie 1 ou tout au plus ceux des catgories 1 et 2. Les rsultats de la catgorie 0 devront tre considrs avec la plus grande prudence. -

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ISO .7402:1993(F)

Annexe B (normative)

Limites de confiance des estimations des petits nombres de colonies

Les limites de confiance au niveau 95 % des estimations des petits nombres. lorsque le nombre de colonies retenues sur les botes est infrieur 15 micro-organismes, sont donnes dans le tableau B.1. Tableau 8.1
Nombre de

Limites de confiance au niveau 95 %

infrieure suprieure.

micro-organismes
.1 2 3 4 5 6 7 8 9
"=""~c.="'.'.c~."'.1

<1 <1 <1 1 2 2 2 3 4

2 4 5 6 9 10 12 13 14
_. --- -~ ---~ u -'" ~. . --. -

0 19 20 21 23

12 13 14 15

-- ---

--

--------------

10

NM ISO 7402

ANNEXE
(informative)

CORRESPONDANCE DES REFERENCES NORMATIVES DE LA PRESENTE NORME AVEC LES NORMES MAROCAINES

Rfrences normatives

Normes marocaines correspondantes

ISO 6887-] ISO 7218

NM 08.0.100 NM 08.0.101

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11

ISO 7402:1993(F)

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CDU 579.672'842.1/.2:57.087.23
Descripteurs: produitagricole, produitalimentaire, produitd'alimentationanimale, essai, analyse microbiologique,dtermination; microorganisme. bactrie, entrobactriacae, comptage des bactries. conditions gnrales. Prix bas sur 10 pages