4) Quel ett Vacide aminé présentant le RF le plus important ? Cela vous parait-il Jogique ? Expliquer votre réponse. La payline ext un scene aemaigu. Il et hdopbeplice de pares emcees dp cane rc qe prt pu arg ec eat joo Eisen er sue doseage oko Gan me) ong a ‘enpouoe spn sane (ome) I mie done We } Ba vous appuyant sur la igure 3, indiquer quels sont les A Ssoldes amings présonts on quantités anormales chez patients «Br, C etx Ds Is tactsdeptline ceding erat Bates, alien. Btant expert dans le métabolisme des acides aminés, vous saves que {a phenyleétonurie est une maladie génétique & Vorigine de retards mentaux dus @ une degradation enzymatique défectueuse de la phenylalanine qui waccumule alors & des hiveatx toxigues dans le aan {is maladie drop drable est maladie génétique due a wn problime de degradation fenaymatique de la leucine, de Hsoleucine et de la valine qui s'accumulent dane Torganiame & des niveaux toxiques. Ces. accumulations peuvent conduire & une Aéginéreacence du eysteme nerveux Levctralinemic est une maladie genétique dic & ane déficience enaymatique au sein du yee de Mirde menant & une accimulaion de citrine et A terme & tine accumulation ‘Pammoniao, hautement toxique pour Torganisme. La etrullinémie peut se manifester de {acon tes diverse allant de Tabsence de manifestations des cas mortls 4) Bn prenant en considération ces données, déterminer de quelle maladie soultrent ee patients » Bs sCvet sD Chapitre 3: PEPTIDES et PROTEINES EXERCICE 1 8) Eerie la structure chimique complete des peptides Iys-Val-Ser-Asn-Tyr-Glu (peptide 1) {peptide 2} - a 0 epite Go Be) ieen ce cuenta gna a EER Pepe?'b) Comment peut-on mettre en evidence la présence de tyrosine dans le peptide 1? ar pce opie amore 8280 am arene dun ey orate) EXERCICE 2 La tropomyosine, protéine musculaire de 70 kDa est constitude de deux bring structurés en hélice a enroulés Tun autour de astro, Quelle est la longueur de la molécule? ‘Choque bina use masse 35 MDa tose si environ 318 rds (35 00/110 318, lamas mele ‘mojenne fun rss did smi an de 110 Ds). Btn dom qu dns re Nl ln gies und et 150.15 Inonguur de la rote es fle 0,15 x S18" 4,7 wm = 477 A EXERCICE 8 : La figure ci-contre représente une helice a ‘a) De combien dacides amines cette nice est- 0 “1 ApH 6 ppt sera charg engravers Ico ‘Om caneue done que peptide es sous forme LYS- LEU - ASN EXERCICE 8: Soit un mélange de 2 polypeptides A, B et dlun octapeptide dont composition globale en acides amines est donnée dans Je tableau suivant (Lee pKa données correspondent aux acides amines Lis) fa) Que peut-on dire du polypeptide A? (On vot qu'il a dee aeNF, deat «COOH deux etn dans epolypeptise A ily done deux chines polypepdigs ees pr un poo dui. A pH 4,5, quelles seront les charges globales de A, B ot de Yoctapeptide ? Nombre de résidus Bia A [B [Octapeptide! fag [12.0] 8 fia] 2 tys__|10,0/13]16[ 1 [aia + Asp) 4,5 [13/10| His [ool2ta[——~ [sot t 1 eNHs | 78) 2.01 wcoon|3e)2[1[—1 ‘Avex ka des difrent aces mings, n poe sv ule carge pont os aids amis p43 age‘Quan 2 ' 2 8 202 2 Pour Fen C ermine pK (8 tpl (45) sou spars de moins de uit po tise lean acne Hale l= pkg (HA)! one p= pk= log (AVIAN) doe (AVIA) 10 [c0o'y{cooH= 10" [COOHICOOH - 10 ~5.01 0a [CO01-S [C00K ‘na done 5 ois pls de forme dprtede que de fame prods, (On at ions dus extrnisC sarin: ens [COOH [COO-2 [0007-3 [COOH] ‘Done [C007-2-1C00H] 24€00H-s\C00H) 2 3{c00H}+{cooH) 2-«{cooH) [coor-216-033 ove [C005+-2.035+1,67 ‘Charme tne de Ba Hs: NHS Rare Rye RGWASp Reis RC «COOH me “Te ase & 7 ob ow fe toa t Cue 1S masts On ote: [COOVICOOH] = 5.0 oi [COTS COOH ‘nae une see extréitcarboy termine done [COOH +{C00 1[COOT-S [COOH] Done [C007 1-001) {c00#}-s1c00H) s{coot}{cooH} "6(co0H} [cooH-6-016 charge Done [COO-11-0,16-084 charge 084 ‘Chae sable de stapes UNH RA Rigs RCys «COOH pe Ee Ey oT 2 1 ot 7 Cue 1 2.34 charge lobale 316 EXERCICE 9: Les immunoglobulines (Ig) sériques (anticorps) sont des glycoprotéines Impliquées notamment dans la reconnaissance et Yelimination des agents, pathogenes ppar le systéme immunitaire. Les immunoglobulines de type G (IgG) sont lea Ig les piu fortement concentrées dans le sang. Blles sont formées de quatre chaines : deux chaines egeres(L)identiquies et de deux chaines lourdes (H) identiques (Figure 1) Vous souaites étudier la nature des liaisons reliant les sous-unites dea Ig. Pour cel apres leur purifieation, vous faites migrer ces IgG sur Un gel SDS-PAGE en suivant deux ‘aitements a et b. Ces traitements correspondent a la migration des IgG en presence de SDS seulement (a), ct a ln migration de Timmunoglabuline en présence de SDS et de mercaptoethanol (6) (Figure 2. page-22-4 a b \f. ? ee - pes a -_ : ‘Figure 1: Représentation schématique d'une ‘Figure 2: Gel SDS-PAGE coloré au bleu de | {bj immunoglobutine en présence de SDS et de frmereaptodthana 4) Rapper le principe de lelectrophorése sur gel SDS polyacrylamide, Voir. ») Quelle eat Ia fonction du SDS ? Du fmercaptaéthanol ? ©) Grice & la figure 2, déterminer la masse moléculaire approximative des chaines legeres, des chaiies laurdes, t des IgG, Pour ditemine Ia mse molclaze approxima, on ace ls logins mole M) en fston de Ia stance de migration our chaque marque de plds mocuaie. (on dria tint de migration ‘etimmanoplobotine 85 mm » ‘elactaine 305 mn ~ ‘elachnine L: 485mm Conon: pour inmunogoblie: ght = 2.18 de M= 1st do= 15 Da (Pg ft 30RD) por chains Hog ~ 1.70 done M ~ $0.2 DADa scat ode de TeG SOK) pour ine L:lgM = 1.36 doe M =229=25, a hn igre de 025 BD) Ce tt 5002 + 2362 = 146 kDa; On ne rombe pas xactnet aur 51 kDa cee ot de dae ps op mal} 4) Quel type de liaison relic les chaines entre cles? “Typed son: pores dus.[EXERCICE 10 . Purification du Botox. La toxine botulique de (ype A (BONTA) ou Botox® est uilisée dans fe traitement de ‘maladies neurologiques comportant une trop grande activité musculaire (contractions et ‘mouvements anormaux, crampes, spasticté, dystonic). Elle est aussi employee en ‘cosmeétique, par exemple pour reduire les rides facinles ou la transpiration excessive La BoNTA est composée d'une chaine lourde de 100 kDa et d'une chaine legére de 50 kDa, iées par un pont disulfure. L'sctivité protéasique du Botox est portée par la chaine legere (1) et nécessite un ion Zn? lié aux chaines latérales de deus acides glutamiques ct de deux histicines (Figure 1) ‘oom ee, gag ‘Plgure 1: représentation schématique du Botox, Preparation and Characteriantion of Homogeneous Neurotoxin ‘Type A from Clostriduim botulinium, Bur. J. Blochem 122, 493- xds_t_? 3 500, 1982. ma Dans cet article, les auteurs rapportent les différentes étapes duu protocole de purification dus Botox. Dans ce eas, la proteine dintérét fest obtemie a partir de cultures de Closiriduium botulinum. Apres In 1 lyse cellulaire, le Botox est obtenu en complexe avec Iemagglutinine (Goir le gel dénaturant SDS-PAGE Figure 2 Piste 1) igure 2: Gel SDS-PAGE des diferentes fractions de la purification da Botox. 10 48) A quoi correspondent les différentes bandes observées en piste 1? ND: Meri de consis Fs réponse a questions) eB) come « proviso; Une wifeation de ces lies effec apres de collogesaynt dj ett ct TD. Ln ema de ie & jour sera envoy a Pas vie Mech! Lifes hanes ober creiondet a sociation dy comple blo igs pre SDS (a nate es pretns et er contre une charge naive) et pale erapothanol (ou Te DTT) quiet ks pots ‘isles ese Alo, (es dents esis éNémagaainie soa dsoeles du Botox (ter qu le Btox Sascie wee iret ype hemagaltinine) (ie de sau du Botox se icon Nout pouvons don fie Thypahie que les deux sons dy Bon (asaiés vis en pot dle) qporisent 100 34a, ‘Les ates bands (130 Ka, 40 Da, 65 KD, 20 KD et 10 KD) comespnden risenblbmet & ites poe Thomeaghe +b) Deux protéines forment le complexe. Pourquoi voit-on 3 bandes majortaires ? ‘es andes mises 10D et 0 BD caespondnt raenblatnt a eos canes de DoNTA. {a bunde 420 kDa corespond vnisonbtblemat dun spe dhénagelatisin eset en multiple copes drs le complexe 1° Gtape : chromatographie «) Donner le principe alts page= 24 =4) Sachant quill existe un inbibiteur inréversible de Vhémagglutinine, proposez lun protocole de puribeation uy Botox a partir du complexe botex-hémagglutinine Le p-Aminptay B-Detozalactopyranisid ot ue ‘nhieu never de homage let pose ‘atacer covalent cete mole mv spose i a it dtr coat 1) Covplerep-Aminophen! BD ‘tpautpyraosde ge de ips. 2) Dans un cps, maar gel de separ ‘soup au -Aminopheyl B-D ‘Bwauctopyraosic ane complexe bn ‘mageltnine (Garmet 28 425°C mine uation: Duran cte ee, hémagaanine Siplenéaubotoesatache as gel vialepe Pama! of hahcnnmnnl ren seeds 8 amp ‘Aninopbent B-Dshingacyransie.” "PASTAS Recap ote cet 2) tnroie et areca tate Whe ona Sih ee ae 2 Gimimritimereremininse Rac cra Tyce atc nae ones tae nian eam reckon pensions etches Siew 3) Laver in colo (amen 30 nt sodiam phosphate #63) {Elm letotc eve un tpon 1 M sodium php 179 coten | M NACL Aprés le depot des protéines sur Ia colonne, celleci est lavée par une grande quantité de tampon de charge (60 mM Phosphate pH 6.3). Puis le Botox est elue par variation du PH avec le tampon phosphate 0,1 M pH 7.9, 1M NaCl, ‘e) Pourqual lave-tor la colonne aprés le depot des protéines ? 1 fat aver In clonse pour se dburaser dete le lus tact pt spéiiquement ay gst « sphadex oopé ws rAminephenyl B-D-ioplcopraosie f Décrire la figure 3. Comment est éluée la protéine ? esr de gut pote presents dans chaque Fraton par spectopotométie 4276 an, ‘Breakthrough »: ts peu de_poines prises ins Ia solution decomplee botox: agin iinet mise en contact ese el oi eponse 4.) W stage de acloae: Pas de rote tees Elaion avec un unpon de pf e force kniie ace provoqua we diaiaton du caplexe ba sgl): lon ane prande ant de prin sou ferme a picangue 4) Le pic de la figure 3 est analysé par gel dénaturant SDS-PAGE (figure 2 piste 2). Qu'en fonelues-vous ? icin due supa en pe (pron des buds 1020, 65 30 kD. La cromatograpie ain 2 oo ser effin. Cepia ies eocore une pone « containante» de 130 KDs. On pe ot qe ote ‘dite est asemblbement ps une haggltnin cael spas rene at acaba. 2° étape : éehange d'or a deuxieme étape de purification est un échange dons sur colonne DEAE-Sephadex. Tee groupements actife DEAE (DiethylAminoEthyl) sont chargés positivement pH Dasique. Avant le dapat des protéines, la résine est équilibrée dans le tampon phosphate 01M 9H 739. 1h) Quel est le principe dune échangeuse dons ? oir cours. 4) Quel est lintéret déquilibrer la colonne ? "La aloo et guile can le tampon ve lel e Botox cntaminan a sate drt a cromatgriphic alin. Ain fru Te otosccontmimut et hag sur la clone écangeuse ons it me sbi ps hence NaCl dans I tmpon auitration carl box ne pour pase ee para coloae ans condos lemtange botox cumin 2 dls vant te char sua colnne lange on. 43) Daprés la figure 4, comment sont éluées les protéines ?Figure 4; Prof} tution de la thomatographie échnneruse ions [DEAE-Sephades) Un tradient linéaire de NaC (00,5 IM) dans Ie tampon & pH 7.9 est Utlise. Abe 278; [Nac snes raceme tk es Concert de NIC amp, aie 0 bord ean de prsines ous fome dun pic Hn (aour 40 mL) pis lon aes rots i ge ete et 26 meni) Le pic de la figure 9 est analyse par gel denaturant SDS-PAGE (Sgure 7 piste 3. ) Quien conclues-vous ? [nation omen botx por (és des nes $0 10a seule Calcul de concentration : Nowe voulone connaftre I concentration de notre pratéine purifice. Suivant la Relation de Beer-Lambert A= eC avee A tant Fabsorbance de la solution pour une longueur donde, C (en M) est la concentration du solute, I fen cm) est Ia Jongueur du trajet optique et ¢ (en MI cm) le coeficient cextinction molaire qui depend de la nature du solute et dela longueur donde, 1) Sachant que coeficient d'extinetion molaire de BONTA sfseeystoen) ~ 193260 M cmt et la longueur du trajt optique ~ 1 em, calculr la concentration de protéine pucilie En pont en cosine cbsosion (gue) ova: A (278 a) = 10S. anal repaint ans Pétion on oben“ C-1 0509326081) C=88 yma Chapitre 4: GLUCIDES EXERCICE 1 . Parmi les formules suivantes, quelle est celle qui correspond a un ose? & un acide aldonique ? CiiinO>—CalleOe Case CaflOs Cally Les tect pou fre CHD) 0 ts, aces ldoiqusrsuen de anyon de loss, ty au oxysin nus On done Oy Laformale qu corespond Tose et Cathe, a fermsl qui corespond acide hacongue et. caheos EXERCICE 2. Quelle est I fructose ? alee sine que le OH nce fnction alcool primal es duct ote epsetton de Fisher. Le [DINE SIGNIFIE PAS qe see detozyr. ‘Lesign + n—lndgue le sede vin de alanis L—infque ue ole vo. jgnification de la lettre D et du signe (-) dans le D- EXERCICE 3 , erie la structure linéaire di D-gincose et dui D-fructose en projection de Fischer. Donner la structure de leurs formes énantiomeres, Hf-on Dectucose won DeFrtone Leas éouomerce 4 sont el Glens ele L-Pritss, on ge = 26