BIO CELL,POLY CYCLE CELL ET APOPTOSE P16 24

ROCHICCIOLI ANNE-SOPHIE SPINA SARAH

APOPOTOSE ET CYCLE CELLULAIRE

INTRODUCTION
La cellule a tout moment les protines ncessaires pour induire sa mort (elle dclanche seule lapoptose ou par lattaque par une autre cellule). Elle intgre diffrents signaux qui conduisent la cration dun quilibre entre prolifration cellulaire, diffrenciation cellulaire et Apoptose. Lapoptose est un mcanisme important dans lhomostasie. Lapoptose est un mcanisme universel tout comme la snescence rplicative c'est--dire quelle concerne tous les types cellulaires de tous les tres vivants

Ex : un ver (caenorhbditis elegans) form de 1090 cellules a servi de modle pour ltude de lapoptose. Au cours de son dveloppement 131 cellules meurent par apoptose quelque soit le ver observ. Conclusion : lapoptose est un mcanisme gntiquement programm. Cest pourquoi on lappelle aussi mort cellulaire programme. Remarque : Chez lhomme le SNC ainsi que les gamtes sont trs sujets lapoptose. 1- morphologie dune cellule qui subit lapoptose Une cellule qui entre en apoptose prsente plusieurs caractristiques : une diminution globale de son volume (se contracte, perd de leau) une diminution de son volume nuclaire (condensation nuclaire) elle se divise en petites vsicules membranaires, les corps apoptotiques. Dans lapoptose les organites ne sont donc pas librs dans le milieu extra cellulaire ( linverse de la ncrose o il y a un clatement cellulaire,libration des organites,ce qui cre linflammation) mais contenus dans les corps apoptotiques qui seront digrs par des macrophages,fibroblastes. Le contenu de la cellule ntant pas libr dans le milieu extra cellulaire, il ny a pas de mcanisme de chimiotactisme et donc pas de raction inflammatoire qui accompagne lapoptose. - Il y a inhibition de contact c'est--dire que la cellule apoptotique se dtache des cellules voisines (elle sisole) par perte de ladhsion des intgrines. - Le phnomne dapoptose est isol alors que la ncrose touche lensemble dun lobe

Diffrence entre ncrose et apoptose (voir tableau poly) info complmentaires : - Lapoptose se droule physiologiquement lors de la cornification qui est la dernire tape de la maturation de lpiderme et pathologiquement dans le cadre des maladies de surcharge (la cellule ne pouvant plus faire face lafflux de protines non dgrades par ex, se suicide)

La ncrose est toujours pathologique Lors de lapoptose lintgrit de la membrane plasmique est conserve car on retrouve la membrane plasmique fragmente en petites vsicules. - Les organites et les enzymes lysosomiales sont prsents dans les corps apoptotiques - Lapoptose est un mcanisme actif. Au cours de lapoptose il y a consommation dATP pour assurer les mcanismes de transcription, traduction et rgulation. 2- principaux aspects biochimiques de lapoptose dpolarisation membranaire perte de lasymtrie de la membrane : il y a exposition de la phosphatidyl srine (PS) sur le versant exoplasmique de la membrane plasmique, ce qui correspond un signal de mort cellulaire programme ;la cellule en apoptose ne dpense plus dATP pour compenser le flip. la quantification de la PS sur le versant exoplasmique de la cellule permet de dterminer le nombre de cellules en apoptose Entre massive de calcium dans le cytosol : favorise laction de protases qui sont calcium dpendantes, les caspases (une douzaine chez lHomme). Les caspases agissent en cascade (des caspases initiatrices clivent dautres caspases pour les activer). La mitochondrie est un amplificateur de lapoptose (voire dclancheuse) principalement au niveau des cellules pithliales. Elle inhibe : - les molcules apoptotiques - les molcules anti caspases - le clivage des enzymes nucleosomales Il existe 2 schmas de mort cellulaire programme : - induite par voie extra cellulaire(suicide oblgatoire,la cellule vis dangereusement car expose en permanence des ligands de mort cellulaire comme Fas(CD95) ) - induite par le noyau de la cellule qui subit lapoptose (voie qui passe essentiellement par la protine p53) 3- initiation membranaire de lapoptose le rcepteur de mort : Fas ou CD95 Ce rcepteur fixe Fas ligand encore appel CD95 ligand. Sous leffet de ce ligand le rcepteur se trimrise ce qui induit le recrutement de protines adaptatrices au niveau du domaine de mort (partie intra cytoplasmique du rcepteur). Ces protines adaptatrices recrutent leur tour des caspases initiatrices (la plus connue tant la caspase8). Les caspases initiatrices sont sous forme de pro caspases qui sautoactivent au contact des domaines de mort. La forme active est ttramrique(aprs coupure du domaine NH2 terminal). Le CD95L est exprim par un faible nombre de cellules : - lymphocytes T activs

polynuclaires neutrophiles lymphocytes NK

p.18 Le Fas L est produit sous forme transmembranaire. Pour tre libr et agir sur la cellule cible il est coup par une mtalloprotase. Une fois libr il peut se fixer au rcepteur Fas et induire lapoptose. On parle alors dapoptose paracrine. La cellule peut autocouper le Fas L et raliser une apoptose autocrine. Une cellule ayant subit la fixation dun Fas L peut sans diffusion de FasL par un baiser de mort induire une apoptose fratricide La neutralisation paracrine : la cellule scrte une forme tronque du Fas. Le Fas lie le Fas L. ceci permet la cellule de se protger de la mort cellulaire induite par une autre cellule (mort cellulaire par voie extracellulaire). Ce mcanisme est observ chez les cellules tumorales. Le complexe Fas /Fas L peut tre rapidement endocyts avant mme que les caspases soient actives. Les cellules chappent alors lapoptose (cellules tumorales). Les caspases les caspases ont une spcificit restreinte, elles coupent au niveau de rsidus aspartiques. Les caspases initiatrices se diffrencie des caspases effectrices car leur domaine NH2 terminal est plus long. Les caspases initiatrices sautoactivent, elles forment un ttramre qui est actif, protolytique. Elles activent les caspases effectrices la caspase 3 active clive les inhibiteurs des endonuclases et les molcules anti apoptotiques donc active indirectement les endonuclases.

Transduction du signal de mort induit par les rcepteurs membranaires on diffrencie 2 types cellulaires au sein desquels lapoptose ne se droule pas de manire identique : les cellules msenchymateuses : lapoptose ne fait pas intervenir les mitochondries les cellules pithliales : lapoptose fait intervenir les mitochondries. dans les cellules msenchymateuse il y a trimrisation des rcepteurs de mort, recrutement des protines adaptatrices, puis des caspases initiatrices et effectrices. Le fibroblaste exprime une grande quantit de caspase 8 qui induit directement la mort cellulaire dans la cellule pithliale : lexpression de la caspase 8 tant plus faible, la caspase 8 clive BID (protine nuclosmale). Ce clivage permet BID de se fixer la membrane mitochondriale externe. cette fixation a pour consquence la formation de pores par lesquels sort le cytochrome C. Dans le cytoplasme le

cytochrome C se complexe avec la pro caspase et lAPAF pour former lapoptosome qui active la caspase 9 quil contient. Dans le cellule il y a un quilibre qui conditionne la survenue ou pas de lapoptose : - les protines apoptotiques induisent la formation de pores dans la mitochondrie. Elles sont cytosoliques - les protines anti apoptotiques empchent la formation de pores dans la mitochondrie. Elles sont situes sur la membrane externe de la mitochondrie.

La famille Bcl2 Bcl2 est une protine anti apoptotique qui est sous forme dimrique. Il peut sagir ; - dun homodimre : Bcl2/Bcl2 dun htrodimre : Bcl2/BAX Lquilibre homodimre/htrodimre conditionne la survenue de lapoptose(louverture ou non des pores) Schma gnral du dclenchement de lapoptose partir des rcepteurs de mort 1-interaction Fas/FAS L 2-trimrisation de Fas 3-activation des caspases initiatrices (pro caspase 8) 4-libration de la caspase 8 active Dans la cellule msenchymateuse 5-activation des caspases effectrices (caspases3) 6- clivage de substrats critiques pour La survie cellulaire 7- fragmentation chromatinienne 8-mort cellulaire Dans la cellule pithliale 5-clivage de BID 6-fixation de BID a membrane externe de la mitochondrie 7-permabilisation membranaire 8-Bcl2 soppose louverture des pores 9-BID et BAX induisent la sortie du Cytochrome C 10-le cytochrome c participe la Formation de lapoptosome 11-procaspase9 dans lapoptosome est Active en caspase 9 12- activation des caspases effectrices (caspases3) 13-clivage de substrats critiques pour la survie cellulaire

14- fragmentation chromatinienne 15-mort cellulaire

Remarque : les dernires tapes dans la cellule msenchymateuse et dans la cellule pithliale sont communes. Il existe des protases dont le rle est de rguler lactivit des caspases. Il sagit de protines rgulatrices qui empchent lapoptosome et la caspase 3 de se former. Fragmentation du noyau :p 21impossible de quantifier le pourcentage de cellules en apoptose
sur cette lectrophorse

4- induction de lapoptose par le noyau p53 est la protine centrale de linduction de lapoptose par le noyau. Les cellules tumorales dficientes en p53 chappent lapoptose. P53 et apoptose P53 est un facteur de transcription. Il induit : - la transcription de gnes comme les protines de lapoptosome, ou BID et BAX, inhibe Bcl2 et active donc la mort cellulaire par le systme interne de la mitochondrie. - la transcription de Fas et est active donc la mort cellulaire par voie extracellulaire. - La transcription de MDM2. MDM2 activ induit lubiquitinylation de p53 qui doit alors sortir du noyau. 5- mthode dtude des cellules apoptotiques
Mesure de la quantit dADN

Le noyau de la cellule apoptotique se divise en fragments de noyau qui sont au sein de vsicules membranaires (les corps apoptotiques) qui ont une quantit dADN infrieure 2n.On peut ainsi compter le nombre de vsicules et mesurer la concentration dAdn ds chaque vsicule. Si dans un tissu on retrouve des quantits dADN infrieures 2n cela signifie quil y a des cellules en cours dapoptose (attention aux gamtes qui ont une quantit dADN gale n) mesure de la quantit dADN : iodure de propidium - fixation des cellules - permabilisation membranaire

incubation en prsence diodure de propidium (compos fluorescent qui sintercale entre les bases de lADN) la fluorescence mesure est proportionnelle la quantit dADN

Sil ny a pas dapoptose on obtient comme rsultats : un pic 1 de fluorescence pour une quantit dADN gale 2n. ce pic correspond aux cellules en G1 (tjrs les plus abondantes dans une population cellulaire car cest ltape la +longue) . Un pic 2 de fluorescence compris entre 2n et4n qui correspond aux cellules qui sont entrain de subir la phase S du cycle cellulaire. Un pic 3 de fluorescence pour une quantit dAdn gale 4n qui correspond aux cellules en phase G2. Si il y a des cellules apoptotiques :

Le pic 1 est tjrs prsent lapoptose saccompagne dun arrt de la prolifration donc lintensit du pic 2 et 3 diminue. Un pic de fluorescence intermdiaire (entre 0 et 2n quantit dADN) apparat. Ce pic a une base large car les corps apoptotiques ont une quantit dADN variable (+ d la prsence de dbris dont membranaires) .

Inconvnient : la fixation cellulaire entranant la mort cellulaire ne permet pas ltude des cellules aprs la quantification de leur ADN.
Deuxime mthode : anexine 5 couple un fluorochrome. la phosphatidyl srine normalement sur le feuillet endoplasmique de la membrane plasmique interagit en particulier avec lanexine 5 qui rgule lorganisation des microfilaments dactine. Cration dun systme dtude artificiel : anexine est couple un fluorochrome, est introduite dans le milieu tudier. Seules les cellules en apoptose fixent lanexine artificielle sur le feuillet exo plasmique de la membrane plasmique. Cette mthode permet la mesure de cellules vivantes en apoptose.

Ralisation dun double marquage liodure de propidium nentre pas dans les cellules si elles ne sont pas au pralable permabilises. Donc il permet la mesure des cellules qui sont en ncrose (car les celules en ncrose clatent et leur ADN se retrouve dans le milieu extra cellulaire au contact de liodure de propidium) lanexine 5 permet la mesure des cellules qui sont en apoptose.

Le prlvement est pass dans un analyseur de cellules qui mesure la fluorescence lie liodure de propidium et lanexine.

si fluorescence lie lanexine est importante, les cellules expriment la PS et sont donc en apoptose si la fluorescence lie liodure de propidium est importante, les cellules meurent par ncrose.

Cette technique permet donc de distinguer les cellules apoptotiques, des cellules ncrotiques, des cellules vivantes (non apoptotiques et non ncrotiques).