CULTURE IN VITRO

L'intrt actuel pour les biotechnologies, qui se manifeste dans la plupart des pays industrialiss ou qui aspirent l'industrialisation, repose sur la quasi-certitude d'une autre rvolution industrielle qui aura, par dfinition, des effets profonds sur la structure des conomies. Les pays qui accderont aux savoirs et au savoir-faire affrents aux biotechnologies seront aussi ceux qui se montreront les plus aptes prendre en main leur destin conomique; ceux qui se laisseront devancer risquent de compromettre gravement leur scurit conomique nationale. (Conseil des sciences du Canada) tant donn cette perception de l'importance des enjeux, il a t irresponsable de la part des pouvoirs publics qubcois de ne pas dfinir une politique et des objectifs en matire de dveloppement des biotechnologies au Qubec. Le secteur biotechnologique qubcois est ainsi devenu l'un des secteurs technologiques de pointe dont la programmation des mesures d'intervention est la plus labor. (Le virage technologique. Btir le Qubec Phase 2.) Un des facteurs importants dans le dveloppement des biotechnologies est le nombre de praticiens forms dans les disciplines scientifiques qui alimentent les biotechnologies. Quoique les praticiens soient forms principalement dans les universits, il n'en reste pas moins qu'une approche dans le domaine au niveau collgial pourrait tre le creuset o prendrait naissance de futurs biotechnologistes.
C'est prcisment l'objectif que veut raliser, modestement, ce laboratoire sur la culture de cellules vgtales.

Buts
Connatre un des grands domaines des biotechnologies. Pratiquer la multiplication vgtative in vitro. Appliquer les techniques propres la propagation in vitro. Acqurir des connaissances sur la culture de tissus vgtaux. Starr, C. et Taggart, R. Biologie gnrale, pages

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Thorie
La culture in vitro ou culture de tissus se dfinit comme l'ensemble des techniques qui permettent de faire crotre en milieu artificiel (en prouvette) des cellules spcialiss, par exemple des cellules animales comme la peau humaine ou des cellules vgtales, ce qui reprsente une grande varit de tissus. Par opposition la culture en terre ou dans des substrats imbibs de solution nutritive, la culture in vitro se fait en laboratoire labri de toute contamination cryptogamique, dans des rcipients qui peuvent tre tant des tubes essai que des bocaux conserve. Ces rcipients sont placs dans un endroit o l'intensit de la lumire, la dure de l'illumination, la temprature et l'hygromtrie sont constamment contrles. Afin de mieux comprendre la culture in vitro des tissus vgtaux, il faut possder quelques notions sur la reproduction des vgtaux. La reproduction chez les vgtaux peut se faire de 2 manires : - la multiplication sexue, l'aide d'changes gntiques : gamtes mles X gamtes femelles = graine - la multiplication asexue comme par bouturage o un seul petit fragment de tige ou de feuille peut redonner aprs dveloppement, une plante entire. C'est prcisment ce type de multiplication vgtative qui est mis en pratique dans la culture in vitro de manire acclr l'abri de toutes contaminations par des bactries ou par des champignons. La culture in vitro vgtale est possible parce que les cellules vgtales prsentent la potentialit de reproduire des individus complets identiques la plante sur laquelle les cellules ont t prleves. Cette proprit a t baptise totipotence cellulaire. La cellule animale prsente aussi cette capacit mais un degr moindre. Toutes les cellules d'un mme organisme renferment dans leur noyau exactement les mmes chromosomes, linformation gntique pour reconstruire lorganisme entier. Ce message hrditaire reprsente toutes les potentialits de l'individu. Cependant, un moment donn de la vie embryonnaire, un choix va se faire, dans un groupe de cellules donnes, destin former un organe ayant une forme et une fonction prcise. Une grande partie du message hrditaire va tre mise en sommeil, dans un autre groupe, destin une autre fonction, c'est une autre partie du message qui sera occulte. Le dveloppement partir d'une cellule simple va se faire par de nombreuses divisions cellulaires (mitose) et par le blocage ou le dblocage de certains gnes, les cellules orienteront leur dveloppement vers une voie particulire qui formera soit un tissu, soit un organe ou autres lments ncessaires la future plante.
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Ce sont des inhibitions slectives qui provoquent la diffrenciation entre les cellules et leur spcialisation. Toutes les cellules contiennent en puissance la totalit de l'organisme, mais elles n'en expriment qu'une partie. Cependant, contrairement aux cellules humaines ou animales, certaines cellules vgtales ont le don de se dspcialiser et de redevenir capables d'engendrer un organisme entier. C'est prcisment cette facult que l'on exploite dans la propagation in vitro de plusieurs plantes. Les cellules vgtales appartiennent des tissus trs spcialiss qui possdent la possibilit de se dspcialiser, formation d'un CAL, et redevenir capables d'engendrer une plante entire en recommenant tout le processus de spcialisation (blocage et dblocage). Afin de raliser la culture in vitro de tissus vgtaux, il est important de respecter les tapes de mmes que les diffrentes conditions ncessaires, le choix de lexplant et le milieu de culture. Les explants Lexplant est une petite partie ou fragment du plante-mre, qui est mis en culture dans lprouvette. L'tat sanitaire de cette plante conditionne la nature de l'explant. - Si le plant-mre est malade, virose, alors il faudra prlever un explant constitu de cellules mristmatiques. Ce type d'explant est appel indiffrencier. - Si le plant-mre est en sant, alors d'autres types d'explant pourront tre prlevs, cest explants sont appels diffrencis. Cependant, il est important de noter que d'autres facteurs vont conditionner les ractions de l'explant, l'ge ou le stade physiologique du plant-mre, la structure, la taille et l'emplacement de l'explant lui-mme. En effet, des explants diffrents prlevs sur une mme plante donnent des rsultats diffrents sur un milieu identique. Lexplant peut tre prlev sur n'importe quelle partie du plant-mre condition de renfermer des tissus vivants et de tenir compte de ltat du plant. Il y a plusieurs sortes d'explants, - Les explants indiffrencis sont prlevs lapex de tige, de racine, de bourgeons, de nuds - Les explants diffrencis sont prlevs sur la tige, la feuille, la racine. Ces explants sont des structures constitues de cellules trs spcialises qui devront se dspcialiser avant de pouvoir rgnrer la plante entire.

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Le milieu de culture Le milieu de culture est important pour la croissance. Il est le plus souvent une solution aqueuse rendue semi-solide ou moyen de glose (agar). Remplaant le sol et supplant la plante, il doit contenir diffrents lments. Trs gnralement il est compos dune base comprenant des sucres (nergie), des lments minraux divers, des rgulateurs de croissance, des vitamines (complexe B), des composs organiques (acides amins, polypeptides, ). La concentration de ces composs peut varier d'une espce l'autre, mais ces variations n'ont qu'une incidence faible sur les ractions des cellules. Les facteurs essentiels sont les rgulateurs de croissance qui stimuleront la multiplication cellulaire et orienteront la morphogense. Dans le milieu de culture, on retrouve des substances qui sont : - soit endognes, cest--dire quelles sont produits par la plante - soit exognes, cest--dire des substances de synthse ou artificiel mais dont l'effet est similaire. Les principales substances (rgulateur de croissance) utilises pour la culture in vitro sont les auxines, les cytokinines et les gibbrellines. Leurs effets varient avec les concentrations utilises et le dosage, doses levs, ils peuvent se montrer inhibiteurs ou toxiques. Dans la famille des auxines, on retrouve lacide indolyoctique (AIA) et les substances de synthse action analogue comme l'acide naphtylactique (ANA), l'acide indolybutyrique (AIB) ou l'acide 2,4 dichlorophnoxyactique (2,4D). Ces substances possdent de nombreuses proprits. - Activent la multiplication cellulaire (mitose) - Amnent la formation de racines (rhizognse) - Stimulent le mtabolisme Dans la famille des cytokinines, certaines sont des composs endognes comme la zatine et l'isopentnyladnine (IPA), ou de synthse comme la benzyladnine (BA) ou la kintine. - Agissent en synergie avec les auxines avec un effet stimulant sur le mtabolisme et sur la division cellulaire. Si de fortes concentrations de cytokinines sont combines des concentrations plus faibles d'auxines, les cytokinines - Agissent en synergie avec les auxines - Activent la multiplication cellulaire (mitose) avec la formation d'un cal

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Dans la famille des Gibbrellines on retrouve que des substances endognes. La plus utilise est l'acide gibbrellique (GA3). Les gibbrellines seront utiles dans les cas ou seule la croissance est souhaite. - Stimulent l'longation cellulaire et la multiplication cellulaire - Elles peuvent rendre les cellules plus sensibles l'action des auxines Comportements des deux grands types d'explants dans le milieu de culture Pour les explants indiffrencis, lorsquils sont disposs sur le milieu appropri, on observe rapidement une cicatrisation de la blessure. Il se produit alors la diffrenciation ou la spcialisation. Par la suite, plusieurs modalits sont possibles : - la plus simple, (illet ou chrysanthme) un seul milieu contenant une auxine et une gibbrelline suffira pour assurer la croissance de la jeune plante jusqu'au stade d'acclimatation. Dans ce cas, lauxine et la gibbrelline assurent la croissance de la jeune tige qui mettra ensuite des racines. - la plus complexe, (rosier ou pommier) une succession de milieux est ncessaire pour assurer les diffrentes tapes de la morphogense. Pour les explants diffrencis, ils doivent effectuer un retour l'tat mristmatique. Aprs le repiquage on observe la formation du tissu cicatriciel (le cal), qui procd la multiplication cellulaire. Il se produit la ddiffrenciation ou la dspcialisation qui sera suivit d'une diffrenciation ou d'une spcialisation. Si cette phase se ralise, plusieurs voies sont possibles selon les espces. - la premire est la voie de la callogense dans laquelle les cellules se multiplient activement, forment un massif globuleux et sont plus ou moins fortement lis. Ce stade qui constitue la premire tape du retour peut tre le seul atteint, ensuite, quel que soit le milieu, il n'est pas possible d'obtenir de noformations de bourgeons. Quelquefois cette phase est un pralable l'organogense. - la seconde voie qui parcourt toutes les tapes et conduit ltat mristmatique soit partir du cal ou de certaines cellules pidermiques. - la troisime voie est celle qui conduit la formation d'embryons somatiques (les clones). Elle peut se produire aprs la formation d'un cal ou bien directement partir de quelques cellules ou de cellules isols. Les embryons somatiques mis en culture sur un milieu de croissance redonnent une plantule identique au pied-mre. Cest le cas de la violette africaine. Dans ce type d'explant, il faut not que le comportement est conditionn par d'autres facteurs comme l'ge du plant-mre, les dimensions de l'explant, la manire de placer l'explant dans le milieu de culture, l'exposition du plant-mre la lumire,
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Comportement de lexplant diffrenci (feuille) dans un milieu de culture de multiplication riche en kintine cytokinine et pauvre en auxine
Feuille Explant Multiplication cellulaire intense (mitoses) Renflement (cal) couleur plus ple que la feuille Microfeuilles Microplants

Cellules spcialises ! Tissus spcialiss

Cellules spcialiss ! Tissus spcialiss

! CAL

Ce qui se passe

Cellules spcialises et Tissus spcialiss

Diffrenciation ou Dspcialisation ou Simplification

Cellules simples ! Tissus simples ! Tissus mristmatiques

Diffrenciation ou Spcialisation ou Complexification

Bourgeons microscopiques

! Bourgeons et Microfeuilles ! Cellules spcialises ! Tissus spcialiss

Multiplication cellulaire intense (mitoses) Environ 6 semaines

Dans un milieu de culture ncessaire la rhyzogense, formation des racines, celles-ci font leur apparition quelques semaines aprs que les microplants y soient placs. Ce milieu de culture est plus riche en auxine et il y a une absence de kintine (cytokinine),

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Milieu de culture et croissance des explants

Ce que vous avez fait lors de lexprimentation a consist prlever des explants de feuille et de tige, les striliser et les placer sur un milieu de multiplication exprimentale et un milieu tmoin. Milieu exprimental Les milieux de multiplication utiliss pour les explants de feuille et de tige ont t mis au point par MURASHIGE & SKOOG. Voici la composition chimique de ces milieux : Composition chimique Milieu tmoin
mg/L NH4N03 KNO3 CaCl2 2H2Oa MgSO4 7H2Ob KH2PO4 Na2 EDTA FeSO4 7H20 H3B03 MnSO4 H20 ZnSO4 7H20 KI Na2MO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6H2O Total: Phosphate de sodium monobasique Sucrose Sulfate d'adnine 2H2O Agar 1650.0 1900.0 440.0 370.0 170.0 37.3 27.8 6.2 16.9 8.6 0.83 0.25 0.025 0.025 4,628.00 170.0 30 000.00 80.00 8 000.00

Milieu exprimental
mg/L 1650.0 1900.0 440.0 370.0 170.0 37.3 27.8 6.2 16.9 8.6 0.83 0.25 0.025 0.025 4,628.00 170.0 30 000.00 80.00 8 000.00

Milieu rhizognese
mg/L 1650.0 1900.0 440.0 370.0 170.0 37.3 27.8 6.2 16.9 8.6 0.83 0.25 0.025 0.025 4,628.00 170.0 30 000.00 80.00 8 000.00

Sels minraux

Autres

Hormones

IAA Kintine
1-inositol Thiamine HCl Tampon (phytion TM) pH 70.1

0 0
100.00 0.40 159.0

0.10 10.00
100.00 0.40 159.0

1.00 0
100.00 0.40 159.0

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Les explants que vous allez mis en culture dans le milieu exprimental (multiplication) vont tre soumis l'action de rgulateurs de croissance (hormones), particulirement l'action d'une kintine et secondairement l'action d'une auxine (IAA). La seule diffrence qui existe entre le milieu tmoin et le milieu exprimental (multiplication) est l'absence de rgulateurs de croissance (hormone). Suite 4 ou 5 semaines de croissance, vous devriez observer dans les prouvettes exprimentales, la prsence de petits bourgeons, de micro-feuilles ou de micro-plants dpourvus en grande partie de racines. Souvenez-vous que les racines sont produites en rponse l'action d'AUXINE (hormone) en concentration relativement leve. Cependant, en laissant les micro-plants encore quelques semaines supplmentaires en prouvettes, vous observeriez lapparition de petites racines rsultant de l'action dune AUXINE ENDOGNE synthtise par les micro-feuilles qui sont capables, ce moment, d'laborer plusieurs lments essentiels leur croissance. Si vous dsiriez, comme dans l'industrie, obtenir des racines rapidement, vous pourriez transfrer les micro-plants, qui ont peu ou pas de racines, dans un second milieu de culture. La caractristique principale de ce milieu est qu'il est surtout riche en AUXINE (1.00mg/L) et la KINTINE est totalement absente cest un milieu pour la RHIZOGNESE.

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Exprience
Par quipe (2 tudiants), sans bijoux et montre et les mains extrmement propre. Matriel flux laminaire ou quipement similaire plant de violette africaine six (6) tubes de milieu de culture eau dsionise strile (bocaux) scalpel et pince deux (2) pinces un brleur et briquet bchers alcool thylique (70% v/v) botes de Ptri striles hypochlorite de sodium (1% v/v) agent mouillant (Triton 80) agitateur magntique pipette pasteur Pince ensemencement chronomtre milieux de culture de Murashige (exprimental et tmoin) spcifique pour la violette africaine Manipulation En groupe de 6, 3 quipes de 2 a) Prlvement de l'explant - Choisir un plant de violette africaine en parfaite sant (vigoureux) - Slectionner une jeune feuille et la sectionner laide du scalpel. Garder cette feuille son ptiole. (1 par quipe) - Identification des prouvettes sur une zone apparente, les initiales, la date, lexplant F (feuille) T (tige), et particularit E (exprimental) T (tmoin) avec # (1, 2, 3) si plusieurs (voir p.24 schmatisation). (1 par quipe)

b) Strilisation de l'explant - Dposer la feuille munie de son ptiole dans 400ml d'une solution d'hypochlorite de sodium (l% v/v) contenant deux ou trois gouttes de Triton 80. Ajouter les feuilles des 3 quipes en mme temps. - Agiter constamment la solution au moyen d'un agitateur magntique pendant une priode de six (6) minutes, pour bien striliser les tissus. Sassurer que les feuilles soient bien immerger. (1 par groupe)
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Aprs une priode de 5 minutes 30 secondes, le bcher de strilisation est transfr dans un milieu totalement aseptique, cest--dire dans le flux laminaire. Toutes les manipulations ultrieures devront s'y effectuer. Aseptie Aseptie Aseptie

c) Lavage de l'explant - l'intrieur de l'enceinte du flux laminaire, retirer l'aide des pinces qui auront t pralablement striliss dans la flamme du brleur, les feuilles et les dposer successivement dans trois (3) bocaux contenant de l'eau dsionise strile, 15 seconde par bocaux. Bien agiter chaque passage dans leau strile. (1 par groupe)

d) Prparation de l'explant pour sa mise dans le milieu de culture - Retirer les explants du dernier bocal d'eau strile et les dposer dans 3 botes de Ptri striles. (1 par groupe mme que c) - l'aide d'un scalpel et d'une pince, sparer la feuille du ptiole. (1 par quipe) - Dcouper en vous servant d'un scalpel et d'une pince un explant de feuille dont les dimensions sont denviron de 10 mm x 10 mm. Attention de ne pas brler ou abimer lexplant. Vous inspirez du modle suivant :

- Dterminer ensuite un explant de tige ou de ptiole en sectionnant avec le scalpel une rondelle d'environ 5 mm de longueur. Il est prfrable, tout d'abord, d'liminer la premire rondelle produite. Attention de ne pas brler ou abimer lexplant. Vous inspirez du modle suivant :

- Toujours l'intrieur de l'enceinte du flux laminaire, prendre un tube de milieu de culture et passer son ouverture, pendant quelques secondes, dans la flamme du brleur et liminer la condensation pouvant sy tre accumuler. Rpter cette opration pour les 6 tubes de lquipe.
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e) Mise en culture de l'explant et installation pour croissance - Toujours l'intrieur de l'enceinte du flux laminaire, prendre un tube de milieu de culture et passer son ouverture, pendant quelques secondes, dans la flamme du brleur. - Tout en conservant dans une main le tube, prendre, l'aide d'une pince densemencement pr-flambe, un explant et l'enfoncer lgrement dans la glose du milieu de culture contenu dans le tube. Attention de ne pas brler ou abimer lexplant. Flamber de nouveau l'ouverture du tube et y mettre le bouchon. - Recommencer la mme procdure pour tous les explants. (chaque quipier met en culture 3 explants) - Les tubes de culture sont disposs dans la biotronette qui assure le maintien des conditions de croissance. f) Croissance et observations - Observer chaque semaine, pendant environ six (6) semaines, les explants. Autant que possible, essayez de faire vos observations travers les vitres de la biotronette afin de minimiser les risques de contaminations. Regrouper vos observations sur une feuille d'observation. Premiers jours : Observez sil y a des contaminations causes par les champignons Observez sil se produit une dgnrescence de lexplant Les jours suivants : Observez sil a des contaminations causes par des bactries Observez sil se produit de la dgnrescence au niveau de lexplant Observez lapparition du cal (renflement) Observez lapparition des micro feuilles des micro plants Observez lapparition des racines (possible dans le milieu I) Il est important de vrifier la disposition des tubes dans la biotronette. Lexplant doit toujours tre orient vers la lumire des fluorescents Lumire

- Normalement au bout de cette priode de six (6) semaines, des micro-plants devraient tre visibles dans les tubes de culture. Aprs une priode de trois mois, les plants sont prt mettre en terre.
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Schmatisation des ensemencements effectuer Prlever les explants tmoins de feuille et de tige de mme que les explants exprimentaux de feuille et de tige sur la mme feuille FT
Tmoin (T)

FE-1

FE-2
Exprimentaux (E)

FE-3

TT
Tmoin (T)

TE-1
Exprimentaux(E)

Explants de feuille (F) (4 prouvettes)

Explants de tige (T) (2 prouvettes)

Lgende: FT: milieu de multiplication + explant de feuille tmoin FE-1, FE-2, FE-3: milieu de multiplication + explant de feuille exprimental no.1, 2 et 3 TT: milieu de multiplication + explant de tige tmoin TE-1: milieu de multiplication + explant de tige exprimentale no.1

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Voici une fiche dobservation : Fiches dobservation Date

(semaine et jour)

Identification (prouvettes) FT

Observations

FE-1

FE-2

FE-3

TT

TE-1

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Un peu de pratique
Ce formatif doit tre fait avec les documents du laboratoire, votre livre de rfrence et la vido sur le site du cours.

1- Nommez et dcrivez brivement deux modes de reproduction chez les vgtaux ?

2- Quelle est la caractristique que possde la cellule vgtale qui permet sa culture in vitro ?

3- Quest-ce quun explant ?

4- Nommez deux lments importants pour la culture in vitro ?

5- Quel nom porte un explant constitu de cellules mristmatiques ?

6- Quel nom porte un explant constitu de cellules trs spcialises ?

7- Nommez des facteurs (5) qui vont conditionner la raction de lexplant ?

8- Dans quelle partie de la plante est prlev un explant diffrenci?

9- Nommez les lments (5) constitutif dun milieu utilis pour la culture in vitro ?

10- Quest-ce quun rgulateur de croissance et nommez en trois utiliss en culture in vitro ?

11- Pour chaque rgulateur de croissance nommez au numro prcdent, indiquez ces proprits ou effets ?

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12- Quelle est la particularit, au niveau des concentrations de cytokine et dauxine quant leur effet ?

13- Nommez les tapes que doivent subir ou franchir les cellules dun explant diffrencier pour produire un clone ?

14- Dcrivez ce quest un cal ?

15- En comparant les milieux tmoin et exprimental, mentionnez les diffrences ?

16- Lors de la strilisation de la feuille, quelle prcaution doit-on prendre ?

17- Lors de la manipulation de la feuille, pour les transferts et pour la coupe, quelles prcautions doit-on prendre et pourquoi ?

18- Daprs votre comprhension de lexprience (les faits) et des notions thoriques, (les faits) tentez dtablir une problmatique (question gnrale et spcifique) ?

19- Daprs votre problmatique (question gnrale et spcifique), tentez de prvoir le rsultat et rdiger ce dernier sous forme dune hypothse ?

20- quelle frquence sont faites les observations sur les explants en croissance et pour combien de temps ?

21- Quelles sont, pour les priodes suivantes, les observations importantes faire sur les tubes de cultures ? a) Les premiers jours : b) Les premires semaines : c) Les semaines suivantes : d) Les dernires semaines :
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22- Mettez en ordre les tapes de lexprience ? a) La feuille dposer dans une bote de Ptri strile est coupe laide dun scalpel et dune pince pour former six explants de feuille et deux explants de tige. b) Striliser la feuille et son ptiole dans une solution dhypochlorite de sodium (1% v\v) et Triton 80 en agitant pendant six (6) minutes. c) Placer les tubes de culture dans la biotronette qui assure le maintien des conditions de croissance. d) Laver la feuille successivement dans trois (3) bocaux (15 secondes chacun) contenant de leau dsionise strile. Utiliser, pour le transfert, des pinces qui auront t pralablement striliss dans la flamme. e) Sur un plan de violette africaine en parfaite sant, slectionner une jeune feuille avec son ptiole laide du scalpel. f) Striliser un tube de milieu de culture et la pince, prendre avec celle-ci un explant et lenfoncer lgrement dans la glose du milieu de culture.

23- Daprs votre comprhension de lexprience (les faits) et des notions thoriques, (les faits) tentez dtablir une problmatique (question gnrale et spcifique) ?

24- Daprs votre problmatique (question gnrale et spcifique), tentez de prvoir le rsultat et rdiger ce dernier sous forme dune hypothse ?

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Rfrence
( noter que les rfrences sont parfois incompltes)
Livres AUGE, R. et al., La culture in vitro et ses applications horticoles, Lavoisier, Paris, 1986. BOUCHARD, L., GAGN F., MINVILLE, JJ., Les biotechnologies, Conseil de dveloppement du loisir scientifique, 1989. BUVAT, R., La cellule vgtale, Hachette, lUnivers des Connaissances, Paris, 1968. CAMPBELL, Neil A., Biologie, Saint-Laurent (Qubec), ditions du Renouveau Pdagogique inc., 2006. (Adaptation et rvision scientifique en franais par Richard Mathieu). DODDS, J.H. et ROBERTS, L.W., Plant Tissue Culture, Cambridge University Press, Cambridge, 1986. LARPENT et all., Biotechnologie, Principes et mthodes, Doin Editeurs, Paris, 1992. SCRIBAN, R., Biotechnologie, Lavoisier, Technique et Documentation, Paris, 2ime dition, Paris, 1984. SIMMONDS, N.W., Principes damlioration gntique des vgtaux, Les Presses de lUniversit Laval, Qubec, 1988. VERNE, J. et HERBERT, S., La culture des tissus, Que sais-je? no 1274, PUF, 1967. Handbook of Plant Cell culture, (Vol. 1,3,4,5,6), Mc Graw-Hill Publishing Compagny. (Cote:631.52 -H 236 -1990) Revues Aug R. (1984) La culture in vitro. Sciences et Vie Hors Srie, no 146. Dontigny (D.), 1987. - Lhorticulture de verre. Qubec Science, no 8, 25: 22-27. Famelart (M.), 1979. La culture de tissus vgtaux ou la production de plantes en prouvettes. Sajib. no4:44-50. LHeureux (P.), Cellule vgtale: volutions rcentes et perspectives. Bio futur, dcembre 1984, p. 53-59. Martin C. (1984) La culture des plantes en prouvettes. La recherche, no 160, novembre, 1984. Moinet, M.-L. (1983) La prodigieuse aventure de l'horticulture en prouvette. Sciences et Vie, no 787. Morel (M.), Martin et Muller, 1968. La gurison des pommes de terre atteintes de maladies virus. Ann. Physiol. vg., 10 (2), 113-139. Prieur B. (1985) Dossier sur la multiplication in vitro. Qubec Vert, octobre, p. 14-36. Rajnchapel-Messai J. et Guerche Ph. Mthodes in vitro et productions vgtales. Biofutur, octobre 1985, p.31-45. Shepard J. 1982 La rgnration in vitro de pommes de terre. Pour la Science, p. M-47. Tisdall P. 1985. Au seuil dune re nouvelle. Dimension Science 3: 24-31. Winter P. 1985 Les micro forets. Dimension Science 6: 9-14.

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