Valorisation d'hydrolysat de poisson pour la santé

humaine : séparation des composés bioactifs par

électrodialyse avec membranes d'ultrafiltration et
évaluation de leurs activités biologiques impliquées
dans le développement du syndrome métabolique

Thèse

Rachel Durand

Doctorat en sciences et technologie des aliments

Philosophiæ doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

© Rachel Durand, 2019

Valorisation d’hydrolysat de poisson pour la santé
humaine : séparation des composés bioactifs par
électrodialyse avec membranes d'ultrafiltration et
évaluation de leurs activités biologiques
impliquées dans le développement du syndrome
métabolique

Rachel Durand

Sous la direction de :

Laurent Bazinet, directeur de recherche

Erwann Fraboulet, codirecteur de recherche

Résumé

La valorisation des co-produits de poisson est un enjeu économique et

environnemental. Depuis plusieurs années, des recherches ont montré que les co-produits de
poisson contenaient des molécules actives pour la santé humaine comme des acides gras
polyinsaturés et des peptides bioactifs. L’objectif principal de cette thèse était d’évaluer
l’utilisation potentielle d’hydrolysats de laitance de hareng pour l’amélioration de la santé
humaine, spécifiquement en agissant positivement sur certaines fonctions physiologiques
associées au syndrome métabolique, et l’effet de leur séparation par électrodialyse avec
membranes d’ultrafiltration (EDUF) sur la production de fractions bioactives.

Dans un premier temps, il a été démontré qu’une supplémentation avec différents

hydrolysats de laitance de hareng d’une diète riche en gras et en sucre chez des souris
permettait de moduler certains paramètres physiologiques impliqués dans le développement
du syndrome métaboliques (MetS) : amélioration de la tolérance au glucose, augmentation
de l’apport énergétique total et protection de la population de Lactobacillus dans le
microbiote intestinal. De plus, les hydrolysats ont aussi montré des activités anti-
inflammatoires in vitro à des concentrations de 1ng/ml et 100pg/ml.

Dans un second temps, la faisabilité d’une séparation par EDUF de deux hydrolysats
de laitance de hareng différents a été évaluée : le premier plus complexe était un mélange de
molécules (lipides, acides nucléiques, peptides, acides aminés libres), alors que le second
était principalement composé de peptides et d’acides aminés libres. Une nouvelle
configuration utilisant quatre membranes d’ultrafiltrations (deux de 50kDa et deux de
20kDa) a permis un double fractionnement simultané des composés anioniques et cationiques
en seulement une étape. Il a d’abord été montré que seuls les peptides chargés ainsi que les
acides aminés libres pouvaient être séparés par EDUF alors que les lipides et les acides
nucléiques ne migraient pas dans les fractions de récupérations. De plus, l’utilisation de
membranes présentant deux tailles de pores distinctes a permis le fractionnement des
hydrolysats en différentes classes de poids moléculaires. En effet, l’utilisation de membranes
de 20kDa a permis la concentration de peptides de faibles poids moléculaires (< 600Da) et

III
d’acides aminés libres, alors que les populations peptidiques des fractions obtenues avec les
membranes de 50kDa présentaient des poids moléculaires supérieurs et plus variés.

Dans un troisième temps, les bioactivités des fractions de récupérations et des

hydrolysats de laitance de hareng ont été évaluées in vitro. Ainsi, la séparation du premier
hydrolysat a permis l’obtention d’une fraction finale stimulant la captation du glucose in vitro
et d’une fraction anionique antioxydante. Le fractionnement du second hydrolysat a permis
quant-à lui la production de deux fractions cationiques anti-inflammatoires ainsi que
l’identification subséquente de deux séquences peptidiques bioactives.

L’ensemble de cette thèse a donc démontré que les hydrolysats de laitance de hareng
contenaient des composés actifs, comme des acides gras polyinsaturés et des peptides,
modulant positivement certains paramètres physiologiques impliqués dans le MetS et
pouvant ainsi permettre la diminution de son occurrence. De plus, la séparation des
hydrolysats par EDUF a permis la production de fractions bioactives ainsi que l’identification
de deux nouvelles séquences peptidiques anti-inflammatoires (IVPAS et FDKPVSPLL). Ces
travaux ont démontré l’effet bénéfique pour la santé humaine des hydrolysats de laitance de
hareng et de ses fractions, permettant d’envisager une valorisation plus efficace de ces co-
produits de poisson par les industries de transformation dans les secteurs liés à la santé
humaine.

IV
Abstract

Fish by-product valorization is an economic and environmental issue. For several

years, scientific researches have shown that fish by-products contained active molecules for
human health, as polyunsaturated fatty acids and peptides. The aim of this thesis was to
evaluate the potential use of herring milt hydrolysates for human health, especially by
evaluating their potential actions in physiological parameters involved in the metabolic
syndrome and the effect of their separation by electrodialysis with ultrafiltration membrane
(EDUF) for the production of bioactive fractions.

First, we have demonstrated that the supplementation of three different herring milt
hydrolysates in a high fat high sucrose diet in mice was able to modulate some physiological
functions involved in the metabolic syndrome: improvement of glucose tolerance, increase
of the total energy intake and protection against the Lactobacillus disappearance in the gut
microbiota. Moreover, the hydrolysates decreased the inflammation induction in
macrophages stimulated with LPS at 1ng/ml and 100pg/ml.

Secondly, we have evaluated the separation of two herring milt hydrolysates by

EDUF: the first one was more complex with a mix of different molecules (lipids, nucleic
acids and peptides) while the second one was mainly composed of peptides. A new
configuration using four ultrafiltration membranes (two of 50kDa and two of 20kDa) allowed
a simultaneous double separation of anionic and cationic compounds. It has been shown that
only charged peptides and free amino acids were fractionated in EDUF, while the lipids and
nucleic acids didn’t migrate to the recovery fractions. Moreover, the use of membranes with
different cut-off allowed a separation of the hydrolysates in different molecular weight
ranges. Indeed, the use of 20kDa membranes allowed the concentration of peptides with
small molecular weights (<800Da) and free amino acids, while the recovery fractions
obtained with the 50kDa membranes were composed oh peptide with higher molecular
weights.

Thirdly, the potential bioactivities of the recovery fractions and the herring milt
hydrolysates were evaluated in vitro. Hence, the separation of the first hydrolysate allowed

V
the production of a final fraction increasing the glucose uptake and an antioxidant anionic
fraction. While the separation of the second hydrolysate allowed the production of two anti-
inflammatory cationic fractions as well as the identification of two bioactive peptides
sequences.

All these results showed that milt herring hydrolysate contained bioactive compounds
such as polyunsaturated fatty acids and peptides, improving some physiological functions
involved in the MetS and may decrease its occurrence. Moreover, the separation of the
hydrolysates by EDUF allowed the production of bioactive fractions and the identification
of two new anti-inflammatory peptide sequences. This work demonstrated the existence of a
beneficial effect of herring milt hydrolysate and its fractions for the human health, allowing
a better valorization of this by-product of the food industry for the health sector.

VI
Table des matières

Les produits marins ................................................................................................................................... 4

1.1.1.1 Intérêt de la consommation de poisson ............................................................................................. 4

1.1.1.2 Production et utilisation du poisson : contexte global ....................................................................... 5
1.1.1.3 Le hareng de l’Atlantique (Clupea harengus) ................................................................................... 6

1.1.2.1 Valorisation de masse ....................................................................................................................... 9

1.1.2.1.1 Farine et huile de poisson ............................................................................................................ 9
1.1.2.1.2 Pulpe et isolat de protéines .......................................................................................................... 9
1.1.2.2 Valorisation de niche ...................................................................................................................... 10
1.1.2.2.1 Gélatine et collagène marin ....................................................................................................... 10
1.1.2.2.2 Lipides marins ........................................................................................................................... 11
1.1.2.2.3 Les peptides bioactifs ................................................................................................................ 13
1.1.2.2.3.1 Production des peptides de poisson bioactifs ...................................................................... 13
1.1.2.2.3.1.1 Hydrolyse chimique .................................................................................................... 14
1.1.2.2.3.1.2 Hydrolyse enzymatique .............................................................................................. 15
1.1.2.2.3.2 Peptides d’hareng de l’Atlantique ....................................................................................... 17
1.1.2.2.4 Laitance de poisson ................................................................................................................... 18
Le syndrome métabolique et les composés bioactifs marins ................................................................ 20

1.2.1.1 Résistance à l’insuline, obésité et diabète de type 2 ....................................................................... 21

1.2.1.2 Maladies cardiovasculaires et dyslipidémie .................................................................................... 22
1.2.1.3 L’inflammation dans le syndrome métabolique .............................................................................. 23
1.2.1.4 Impact du microbiote intestinal sur le syndrome métabolique ........................................................ 25

1.2.2.1 Acides gras polyinsaturés et la résistance à l’insuline .................................................................... 26

1.2.2.2 Prévention de la dyslipidémie et des maladies cardiovasculaires ................................................... 28
1.2.2.3 Effet des acides gras polyinsaturés sur l’inflammation ................................................................... 29

1.2.3.1 Rôle des hydrolysats et des peptides bioactifs de poisson dans la sensibilité à l’insuline .............. 30
1.2.3.2 Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson cardioprotecteurs ...................................................... 36
1.2.3.3 Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson anti-inflammatoires .................................................. 38
1.2.3.4 Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson antioxydants ............................................................. 39
Procédés de séparation et de purification des hydrolysats de poisson ................................................ 40

1.3.1.1 Les techniques chromatographiques ............................................................................................... 41

1.3.1.2 Les techniques baro-membranaires ................................................................................................. 42

1.3.2.1 Principe de l’électrodialyse ............................................................................................................. 45

VII
 1.3.2.2 L’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration ......................................................................... 47
1.3.2.2.1 Un procédé sélectif et polyvalent .............................................................................................. 47
1.3.2.2.2 Les paramètres d’influences lors de l’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration............ 49
1.3.2.2.2.1 Le champ électrique ............................................................................................................ 49
1.3.2.2.2.2 Le pH................................................................................................................................... 49
1.3.2.2.2.3 La concentration des solutions d’alimentation et de récupération ....................................... 50
1.3.2.2.2.4 Les caractéristiques des membranes .................................................................................... 51
1.3.2.2.2.5 Le colmatage membranaire ................................................................................................. 51

Hypothèse de recherche .......................................................................................................................... 59

Objectifs ................................................................................................................................................... 59

Transition contextuelle ..................................................................................................................................... 62

Résumé ............................................................................................................................................................. 63
Abstract ............................................................................................................................................................ 65
Introduction ............................................................................................................................................. 66
Materials and methods ............................................................................................................................ 67

3.2.1.1 Supplementation ............................................................................................................................. 67

3.2.1.2 Animals and dietary treatment ........................................................................................................ 68
3.2.1.3 Insulin tolerance test ....................................................................................................................... 68
3.2.1.4 Oral glucose tolerance test .............................................................................................................. 69
3.2.1.5 Biochemical analysis ...................................................................................................................... 69
3.2.1.6 Gut microbiota analysis .................................................................................................................. 69

3.2.2.1 Glucose uptake ................................................................................................................................ 69

3.2.2.2 Inflammation ................................................................................................................................... 70

Results ...................................................................................................................................................... 71

Discussion ................................................................................................................................................. 77

Conclusion ................................................................................................................................................ 81
Acknowledgements .......................................................................................................................................... 82
Atteinte des objectifs et avancement des connaissances................................................................................... 83

Transition contextuelle ..................................................................................................................................... 85

Résumé ............................................................................................................................................................. 86
Abstract ............................................................................................................................................................ 87
Introduction ............................................................................................................................................. 88

VIII
 Materials and methods ............................................................................................................................ 89

4.2.1.1 Chemicals ....................................................................................................................................... 89

4.2.1.2 Milt herring hydrolysate ................................................................................................................. 90
4.2.1.3 Electrodialysis material ................................................................................................................... 90

4.2.3.1 pH ................................................................................................................................................... 92
4.2.3.2 Conductivity.................................................................................................................................... 93
4.2.3.3 Peptide concentration in liquid samples. ......................................................................................... 93
4.2.3.4 Migration rate. ................................................................................................................................ 93
4.2.3.5 Nucleic acid concentration in dry samples...................................................................................... 93
4.2.3.6 Total peptide concentration in dry samples .................................................................................... 94
4.2.3.7 Relative energy consumption .......................................................................................................... 94
4.2.3.8 Molecular weight peptide distribution. ........................................................................................... 94
4.2.3.8.1 Initial and Final hydrolysates. ................................................................................................... 94
4.2.3.8.2 Recovery fractions. ................................................................................................................... 95
4.2.3.9 Amino acid composition ................................................................................................................. 96
4.2.3.10 Total lipid content and fatty acid composition .............................................................................. 96
4.2.3.11 Antioxidant activity ...................................................................................................................... 97
4.2.3.12 Glucose uptake bioactivity ............................................................................................................ 97

Results and discussion ............................................................................................................................. 98

Conclusion .............................................................................................................................................. 112

Acknowledgements ........................................................................................................................................ 113
Atteinte des objectifs et avancement des connaissances................................................................................. 114

Transition contextuelle ................................................................................................................................... 117

Résumé ........................................................................................................................................................... 118
Abstract .......................................................................................................................................................... 119
Introduction ........................................................................................................................................... 120
Materials and methods .......................................................................................................................... 121

5.2.1.1 Chemicals ..................................................................................................................................... 121

5.2.1.2 Milt herring hydrolysate ............................................................................................................... 122
5.2.1.3 Electrodialysis cell configuration .................................................................................................. 122

5.2.2.1 pH and conductivity. ..................................................................................................................... 123

5.2.2.2 Nucleic acid concentration in dry samples.................................................................................... 124
5.2.2.3 Peptide migration rate in liquid sample and final peptide concentration in dry powder. .............. 124
5.2.2.4 Amino acid composition ............................................................................................................... 124
5.2.2.5 Peptide sequences identification ................................................................................................... 125
5.2.2.6 Antioxidant activity ...................................................................................................................... 126

IX
 5.2.2.7 Glucose uptake bioactivity ............................................................................................................ 126
5.2.2.8 Inflammation. ................................................................................................................................ 126

Results and discussion ........................................................................................................................... 127

Conclusion .............................................................................................................................................. 139

Acknowledgements ........................................................................................................................................ 139
Atteinte des objectifs et avancement des connaissances................................................................................. 140

Discussion générale ........................................................................................................................................ 141

Conclusion générale ....................................................................................................................................... 143

X
Liste des tableaux
Tableau 1-1 : Composés à haute valeur présents dans les co-produits de poisson (Rustad et
al.2).......................................................................................................................................... 8
Tableau 1-2 : Peptides issus d’hydrolysats enzymatiques de hareng de l'Atlantique (Clupea
harengus). NI : Valeur non indiquée. ................................................................................... 18
Tableau 1-3 : Critères pour le diagnostic du MetS pour différentes organisations. H: homme,
F: femme, IDF: International Diabetes Federation, WHO: World Health Organization, AHA:
American Heart Association, EGIR: European Group for Insulin Resistance. .................... 21
Tableau 1-4 : Séquences peptidiques identifiées inhibitrices du DPP-IV dans des peaux de
poisson. ................................................................................................................................. 31
Tableau 1-5 : Études in vivo utilisant des hydrolysats de poisson sur l’évolution de
paramètres impliqués dans le développement du MetS. ...................................................... 34
Tableau 1-6 : Avantages et inconvénients des méthodes chromatographiques et baro-
membranaires........................................................................................................................ 45
Tableau 1-7 : Séparation de peptides et/ou de fractions bioactives par électrodialyse avec
membranes d’ultrafiltration. NI : non indiqué. ..................................................................... 55

Table 3-1 :Chemical composition of the herring milt hydrolysate (HMH) products .......... 68
Table 3-2: Effect of the HMHs supplementation after 8 weeks on the body characteristics
(mean ± SEM, * p< 0.05 chow vs HFHS, # p< 0.05 HFHF vs HMH1). ............................. 71

Table 4-1: Chemical composition of the herring milt hydrolysate ...................................... 90

Table 4-2:Final peptide and nucleic acid concentration in powders after EDUF separation,
n=4, mean ± standard deviation (SD). Values followed by different letters in a column are
significantly different p < 0.05 (Tukey test). ...................................................................... 100
Table 4-3:Total and free amino acids composition of herring milt hydrolysate and recovery
fractions after EDUF separation, n=3, mean ± SD. Values of total AA follow by different
capital letters are significantly different. Values of free AA follow by different t ............ 105
Table 4-4: Fatty acid composition of initial (IH) and final hydrolysates (FH) after EDUF
treatment, n=6, mean ± SD. Different letters indicated significant difference p < 0.05 (t-test),
*indicated significant difference p < 0.01 (t-test). ............................................................. 107
Table 4-5: ORAC capacity (µmol TE/g) for each fraction, n=3, different letters indicate
significant difference (p < 0.05, Tukey test). ..................................................................... 109

Table 5-1: Migration rate, final peptide and nucleic acid percentage in powders, n=4 ±SD.
Values followed by different letters are significantly different (p<0.05, Tukey test). ....... 129
Table 5-2: Total and free amino acids composition of herring milt hydrolysate and recovery
fractions after EDUF separation, n=2, mean ± SD. ............................................................ 131
Table 5-3: ORAC values, n=3 ±SD. Values followed by different letters are significantly
different (p<0.05, Tukey test). ............................................................................................ 134
Table 5-4: Peptide sequences characteristics identified in C50 and C20. ............................ 138

XI
Liste des figures

Figure 1-1 : Utilisation des produits de la pêche dans le monde (ventilés par volume), 1962-
2016 (tiré de FAO20). .............................................................................................................. 6
Figure 1-2 : Principaux co-produits de poisson (d’après Rustad et al.2). ND : non définis .. 8
Figure 1-3: Biosynthèse des AGPI ω-3 (tiré de Bergé et Barnathan44). .............................. 12
Figure 1-4: Schéma d'illustration des sites de coupures des protéases................................ 16
Figure 1-5 : Les deux voies principales de la signalisation à l’insuline (tiré de Miranda et
al.91). ..................................................................................................................................... 22
Figure 1-6: Changements phénotypiques du tissu adipeux et son rôle dans le développement
d'une inflammation chronique (tiré de Ouchi et al.98). ......................................................... 24
Figure 1-7: Actions des AGPI dans la résistance à l'insuline et le développement des MCV
(D'après Clarke SD137).......................................................................................................... 28
Figure 1-8 : Mécanismes d’action de l’enzyme convertissant l'angiotensin sur la régulation
de la pression sanguine (Tiré de Li et al., 2004)172 .............................................................. 37
Figure 1-9: Les différentes membranes utilisées en filtration baro-membranaire (d'après
Bazinet et Firdaous199). ......................................................................................................... 43
Figure 1-10 : Schéma d'électrodialyse conventionnelle (d’après Strathmann, 2010)202 ..... 46
Figure 1-11 : Formation de gradients de concentration en électrodialyse (d’après Bazinet,
2004)201 ................................................................................................................................. 47
Figure 1-12: Configurations possibles d'EDUF pour la récupération A) des peptides
anioniques, B) des peptides cationiques et C) des peptides anioniques et cationiques
simultanément (d'après Poulin et al.,2006 et Firdaous et al., 2009)203, 204............................ 48

Figure 3-1 :Hepatic lipid composition in mice fed with HFHS diet with or without HMHs
supplementation. Dashed line represents the chow group, * p< 0.05 chow vs HFHS. ........ 72
Figure 3-2: Impact of HMH supplementation in mice fed with HFHS on glucose and insulin
tolerance. A) Glycemic curve during oGTT, B) Insulin production during oGTT, C)
Glycemic curve during ITT. * p< 0.05 Chow vs HFHS, ## p< 0.01 HFHS vs HMH2, $ p<
0.05 HFHS vs HMH ............................................................................................................. 73
Figure 3-3: A) Beta-diversity of gut microbiota in mice between groups after 8 weeks
observed by means of Principal coordinates analysis (PcoA) on an unweighted UniFrac
distance matrix. B) Alpha-diversity of gut microbiota between groups before and after the
experimentation by measuring the Shannon reciprocal index. ............................................. 74
Figure 3-4: The statistical significance of differentially abundant bacteria between the two
distinct biological conditions was measured using Linear Discriminant Analysis Effect Size
(LDA). Black bar: HFHS control, white bar: Chow group, grey bar: HMH supplementations
groups, A) Chow vs HFHS, B) HFHS vs HMH1, C) HFHS vs HMH2 and D) HFHS vs
HMH3. .................................................................................................................................. 75
Figure 3-5: Glucose uptake capacity A) without insulin; B) with insulin in L6 cells
stimulating by HMHs at three concentrations (1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml), n=6, mean ±
SEM)..................................................................................................................................... 76
Figure 3-6 : Nitric oxide production in culture media after inflammation induction by LPS
in J774 mice macrophages stimulating by HMHs at three concentrations (1µg/ml, 1ng/ml
and 100pg/ml), n=6, means± SEM, *p<0.05, **p<0.01. ..................................................... 76
XII
Figure 4-1: Configuration of the peptide separation by electrodialysis with ultrafiltration
membrane cell; P+: cationic peptides, P-: anionic peptides, P-/+: neutral peptides, AEM:
anion-exchange membrane, CEM: cation-exchange membrane, UF: ultrafiltration membrane
.............................................................................................................................................. 92
Figure 4-2: Evolution of the peptide concentration (µg/ml) in recovery fractions after EDUF
treatment at pH 7 and 5.6 V/cm during 240min, n=4. .......................................................... 99
Figure 4-3:Molecular weight peptide distribution of A) initial and final hydrolysates by
GPC-FPLC B) anionic recovery fractions by RP-UPLC C) cationic recovery fractions by RP-
UPLC; n=3, mean ± SD. ..................................................................................................... 102
Figure 4-4 : Glucose uptake capacity A) without insulin; B) with insulin in L6 cells
stimulating by herring milt hydrolysate or recovery fractions after EDUF separation at two
concentrations (1µg/ml and 1ng/ml), n=9, mean ± standard error of mean (SEM). **
significant difference with the control (vehicle) at p < 0.01 (Dunnett test). ...................... 111

Figure 5-1: EDUF configuration; P+ cationic peptides, P- anionic peptides, P+/- neutral
peptides. .............................................................................................................................. 123
Figure 5-2: Peptide migration of recovery fractions during EDUF, n=4 ± SD. ................ 128
Figure 5-3 Glucose uptake activity for the A) basal way, B) Insulin stimulation, n=8 ± SEM
p>0.05 (One-way ANOVA). .............................................................................................. 135
Figure 5-4: Nitric oxide production in culture supernatant after inflammation induction by
LPS in J774 mice macrophage, n=6-10, means± SEM, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
(Dunett test). ....................................................................................................................... 137
Figure 5-5: Nitric oxide production in culture supernatant after inflammation induction by
LPS in J774 mice macrophage, n=6, means± SEM, *p<0.05 (Dunett test). ...................... 138

XIII
Abréviations

Afin de simplifier la lecture de ce document, des abréviations usuelles en anglais

seront utilisées dans les parties en français.

Abréviation française English abbreviation

AA Acides aminés AA Amino acids
AG Acides gras ACE Angiotensin-converting-Enzyme
AGMI Acides gras monoinsaturés AEM Anionic exchange membrane
AGPI Acides gras polyinsaturés AMPK AMP-activated protein kinase
AGS Acides gras saturés BGS Bovine growth serum
AI Indice athérogène CAT Catalase
ARA Acide arachidonique CEM Cationic exchange membrane
CA Acétate de cellulose DHA Docosahexaenoic acid
DH Degré d’hydrolyse DPPH 1,1dephenyl-2pircyk hydrazyl
DPP-IV Dipeptidyl peptidase-IV DPP-IV Dipeptidyl peptidase-IV
DT2 Diabète de type 2 EDUF Electrodialysis with ultrafiltration
membrane
ED Electrodialyse EPA Eicosapentaneoic acid
EDUF Electrodialyse avec membranes FA Fatty acids
d’ultrafiltration
GPx Glutathion peroxydase FAO Food and Agriculture Organization of
United Nations
IC50 Concentration inhibitrice médiane FBS Foetal bovine serum
IL Interleukine GLUT4 Glucose transporter type 4
LPS Lipopolysaccharide GLP-1 Glucagon-like-peptide-1
MCV Maladies cardiovasculaires GPR-120 G-protein coupled receptor 120
MDA Malondialdéhyde HDL High density lipoprotein
MEA Membrane échangeuse d’anions HFHS High fat high sucrose
MEC Membrane échangeuse de cations HMH Herring milt hydrolysate
MEI Membrane échangeuse d’ions IC50 Half-maximal inhibitory
concentration
MetS Syndrome métabolique IL Interleukin
PB Peptides bioactifs iNOS Inducible nitric oxide synthase
PES Polyéthersulfone IR Insulin receptor
pI Point isoélectrique IRS-1 Insulin receptor substrat 1
PM Poids molécualires
PVDF Polyvinylidène fluoride ITT Insulin tolerance test
SOD Superoxyde dismutase LDL Low density lipoprotein
TG Triglycérides MetS Metabolic syndrome
UF Ultrafiltration MW Molecular weight
ω-3 Oméga-3 MWCO Molecular weight cut-off
ω-6 Oméga 6 NF-κB Nuclear factor kappa B
NO Nitric oxide
oGTT Oral glucose tolerance test
ORAC Oxygen radical absorbance capacity
PES Polyethersuflone
PI-3K Phosphatidylinositol-3-kinase
PPAR Peroxisome proliferator-activated
receptor
PUFA Polyunsaturated fatty acid

XIV
 Abréviation française English abbreviation
PVDF Polyvinylidene fluoride
ROS Reactive oxygen species
SD Standard deviation
SEM Standard error of the mean
SREBP Sterol regulatory element-binding
proteins
TBARS Thiobarbituric acid reactive
substances
TG Triglycerides
TNF Tumor necrosis factor
USD United States dollar
UF Ultrafiltration
VLDL Very low density lipoprotein
ω-3 Omega-3

Acides aminés :

Ala, A : Alanine
Arg, R : Arginine
Asp, D : Acide aspartique
Cys, C : Cystéine
Glu, E : Acide glutamique
Gly, G : Glycine
His, H : Histidine
Iso, I : Isoleucine
Leu, L : Leucine
Lys, K : Lysine
Met, M : Méthionine
Phe, F : Phénylalanine
Pro, P : Proline
Ser, S : Sérine
Thr, T : Thréonine
Trp, W : Tryptophane
Tyr, Y : Tyrosine
Val, V : Valine

XV
 « Dans la vie, rien n’est à craindre,
tout est à comprendre»
Marie Curie (1867-1934)

XVI
Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de thèse, Laurent Bazinet, de m’avoir
offert cette opportunité de réaliser ces travaux au sein de son équipe. Merci aussi pour ton
soutien et ta disponibilité qui ont été précieux pendant ces trois années, de même que la
confiance que tu m’as accordée et qui m’a permis d’avancer sur ce projet. J’aimerais aussi te
remercier pour tes nombreux conseils et de m’avoir si souvent rappelé de prendre du recul
afin de recentrer le sujet et d’éviter de m’éparpiller sur les petits détails. Enfin tu m’as fait
découvrir le domaine des sciences des aliments et tu as partagé avec moi ta passion, j’ai
énormément appris à tes côtés.

Je remercie aussi mon co-directeur Erwann Fraboulet pour son aide dans ce projet et
ses précieux conseils d’un point de vu plus extérieur qui m’ont souvent permis de voir plus
loin dans l’aboutissement de cette thèse. Merci aussi pour ta disponibilité, surtout les
dernières semaines, et nos discussions qui m’ont permis d’approfondir ce travail de trois ans.
Ton soutien et tes encouragements m’ont toujours redonné confiance et l’envie de continuer
dans cette voie et pour tout cela un grand merci. Enfin, tes connaissances scientifiques et ta
maitrise du sujet industriel ont aussi permis la réussite de ce travail collaboratif et son
évolution.

J’aimerais aussi remercier notre partenaire industriel Ocean NutraSciences Inc. et son
directeur Gilles Desjardins de nous avoir fait confiance dans la réalisation de ce projet. Merci
aussi pour ton aide et ta collaboration dans cette thèse, mais aussi pour le partage de tes
connaissances sur les produits marins. Tu as permis l’aboutissement d’un travail aux objectifs
académiques mais aussi industriels, tout en nous faisant confiance. Merci, sans Ocean
NutraSciences Inc. ce projet n’aurait jamais eu lieu.

Je remercie aussi les membres du jury, Lucie Beaulieu, Charles Lavigne et Romain
Kapel d’avoir accepté d’évaluer cette thèse.

Je remercie aussi André Marette et toute son équipe pour leur accueil dans leur
laboratoire et le partage de leurs connaissances. Merci à Geneviève Pilon et Vanessa Houde
d’avoir aussi bien supervisé le projet in vivo ainsi que les techniciennes de laboratoire Joanie

XVII
Dupont-Morissette, Jenny Rancourt-Mercier, Jacinthe Julien et Christine Dallaire pour leur
aide sur le projet. Bien sûr, un énorme merci à Bruno Marcotte pour m’avoir tout appris sur
la culture cellulaire. Merci pour ton soutien, d’avoir toujours répondu à toutes mes questions
qui étaient souvent nombreuses, mais aussi pour ton aide lors de mon projet. Merci à vous
tous pour votre bonne humeur quotidienne et votre accueil si chaleureux.

Je remercie aussi toute mon équipe pour leur soutien technique mais aussi moral
pendant ces trois ans. Merci pour vos nombreux conseils qui ont permis à ce projet d’évoluer.
J’aimerais remercier Jacinthe Thibodeau pour sa bonne humeur et son positivisme depuis le
premier jour de notre rencontre. Tu as toujours été présente pour moi au niveau professionnel
mais aussi personnel et au cours de ces trois ans tu es devenue une amie, une confidente mais
aussi un peu une « maman » par intérim. Sans toi, mon expérience au Québec aurait été très
différente. Merci pour tout.

Bien sûr aussi un énorme merci à tous mes amis que j’ai rencontré au Québec et sans
qui cette expérience aurait été beaucoup moins sympathique, Agathe, Steffen, Mathou,
Valentine, Jean-Philippe, Valentin, Isabelle, Clément, Dominique, Marco et Frédérique.
Merci à vous tous pour votre bonne humeur et d’avoir partagé d’aussi bon moments pendant
ces trois années.

Enfin, merci du fond du cœur à ma famille qui malgré les quelques kilomètres qui
nous ont séparés, m’a toujours soutenue et a été présente pendant tout ce temps. Un merci
spécial à ma sœur qui a pris du temps pour lire une partie de ce document. Merci à vous d’être
toujours là et de m’avoir donné confiance dans les moments de doutes. Enfin, le meilleur
pour la fin, je remercie ma douce moitié qui a été là dès le début et m’a supportée pendant
les bons et aussi les mauvais moments (surtout les dernières semaines de rédaction). Merci
de la confiance que tu m’as donnée et aussi de m’avoir suivie dans ce pays froid et enneigé.
Je suis fière de toi et de ce que tu as accompli ici avec moi, merci pour tout.

XVIII
Avant-propos

Cette thèse se divise en six chapitres. Le premier est une revue de littérature présentant
le contexte de ces travaux, les différentes problématiques et les principales recherches faites
sur ce sujet. Ainsi, elle comporte trois parties, la première présente les enjeux liés à
l’augmentation de la consommation de poisson et aux principales utilisations des co-produits
générés. La seconde partie se consacre au syndrome métabolique et à l’action de composés
bioactifs présents dans le poisson (acides gras polyinsaturés et peptides) sur certaines
fonctions physiologiques impliquées dans son développement. Enfin, la dernière partie de
cette revue de littérature présente les avantages et les inconvénients des principales
techniques de fractionnement utilisées de nos jours pour la séparation d’hydrolysats
peptidiques, ainsi que l’utilisation de l’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration pour
la production de fractions peptidiques bioactives. De ce chapitre, découlera l’hypothèse de
travail de cette thèse et les différents objectifs permettant d’y répondre. Les chapitres trois,
quatre et cinq sont sous forme d’articles scientifiques afin de répondre aux objectifs
précédents. Enfin, une discussion générale des différents résultats et une conclusion de ces
travaux concluront cette thèse.

Les chapitres un, deux et la discussion générale sont rédigés en français alors que les
chapitres trois, quatre et cinq sont en anglais. Des abréviations usuelles en anglais sont
cependant utilisées dans les parties en français afin de faciliter la compréhension et la lecture
des parties.

Le premier article présenté dans le chapitre trois, s’intitule «Use of herring milt
hydrolysate for the improvement of the metabolic syndrome: in vitro and in vivo
experiments» et est en révision finale pour être soumis dans le journal «Food Research
International». Les auteurs sont Rachel Durand, Erwann Fraboulet, Geneviève Pilon,
Vanessa P. Houde, Thibaut Varin, André Marette et Laurent Bazinet. Le chapitre quatre
présente le deuxième article, publié dans le journal «Separation and Purification Technology
210 (2019) 431-441» et intitulé «Simultaneous double cationic and anionic molecule
separation from herring milt hydrolysate and impact on resulting fraction
bioactivities.» Les auteurs sont Rachel Durand, Erwann Fraboulet, André Marette et Laurent

XIX
Bazinet. Le dernier article présenté dans le chapitre cinq est en cours de révision et d’attente
pour un brevet industriel. Il s’intitule «Screening for metabolic syndrome application of a
fish by-product hydrolysate after its separation by electrodialysis with ultrafiltration
membrane» et les auteurs sont Rachel Durand, Erwann Fraboulet, Andreé Marette et
Laurent Bazinet.

XX
Introduction

Les habitudes alimentaires des sociétés occidentales ont radicalement changé depuis
ces cinq dernières décennies. En effet, la demande en produits transformés n’a jamais été
aussi forte. Cependant, la transformation des aliments par l’industrie agroalimentaire
engendre d’importants volumes de déchets, dont la plupart peuvent être considérés comme
des co-produits. Les produits de la mer et notamment le poisson, sont reconnus pour leurs
effets bénéfiques sur la santé humaine et leur consommation a fortement augmenté,
engendrant de nombreux co-produits1. En effet, en moyenne, seulement 40% du poisson
seront destinés à la consommation humaine alors que les 60% restant seront écartés et
représentent autant de co-produits2. Ces derniers peuvent être la tête, les arêtes, la peau ou
les organes reproducteurs (laitance, gonades) et contiennent des molécules actives pour la
santé humaine comme des acides gras polyinsaturés, des protéines ou des vitamines. De nos
jours, ils restent cependant principalement utilisés pour l’aquaculture comme farine et huile
de poisson et ont de faibles valeurs ajoutées. L’utilisation généralisée et la valorisation des
co-produits de poisson sont donc aujourd’hui des enjeux économiques et environnementaux.

L’augmentation de la consommation en gras et en sucre dans les sociétés occidentales

a conduit au développement du syndrome métabolique (MetS, «metabolic syndrome»),
définis comme l’ensemble de plusieurs disfonctionnements : dyslipidémie, hyperglycémie,
résistance à l’insuline, obésité viscérale, hypertension et inflammation, touchant aujourd’hui
20% de la population canadienne3. De plus, ce désordre métabolique augmente le risque de
développement du diabète de type 2 par deux et par cinq le risque de maladies
cardiovasculaires4. La prévention et le traitement du MetS sont donc devenus des enjeux
majeurs pour les services de la santé mondiale. Cependant, des études ont montré que
l’utilisation de composés actifs de poisson, comme des acides gras polyinsaturés et des
peptides, permettait l’amélioration de certains paramètres physiologiques impliqués dans le
développement du MetS en améliorant la sensibilité à l’insuline, diminuant la dyslipidémie
et l’inflammation5-10. Or, la laitance de poisson, co-produit de l’industrie de transformation
des produits de pêche, est une matière première riche en ces composés et sa valorisation pour
la santé humaine augmenterait ainsi sa valeur ajoutée.

1
 La partie protéique des co-produits de poisson peut être valorisée par hydrolyse
enzymatique ou chimique afin d’extraire des molécules d’intérêts comme des peptides
bioactifs. Cependant, les bioactivités des peptides sont liées à leur poids moléculaire et leur
séquence en acides aminés. Des études ont ainsi montré que la séparation et la concentration
des peptides bioactifs suivant leurs caractéristiques physico-chimiques permettait
d’augmenter leur activité par rapport à l’hydrolysat initial11, 12
. De nos jours, les deux
techniques principalement utilisées sont les méthodes baro-membranaires et
chromatographiques. Cependant, elles présentent certaines problématiques comme le
colmatage et une baisse de sélectivité pour les premières et des coûts importants et
l’utilisation de solvant pour les secondes. Ainsi le développement de nouveaux procédés de
séparation des hydrolysats est un enjeu important pour la valorisation ultérieure des co-
produits de poisson pour la santé humaine. L’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration
est une méthode de séparation des composés suivant leur charge et leur poids moléculaire13.
Cette technique polyvalente et sélective a permis de générer des fractions peptidiques
bioactives pour la santé humaine : antibactérienne, captation du glucose, anticancéreuse,
antihypertensive14-18. Cependant l’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration n’a encore
jamais été utilisée pour la séparation d’un hydrolysat complexe regroupant des peptides, des
lipides et des acides nucléiques. De plus, cette méthode permet l’utilisation de plusieurs
membranes ayant des tailles de pores différentes afin d’avoir une séparation des peptides en
plusieurs classes de poids moléculaires simultanément19. Cette polyvalence de
l’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration devrait permettre la production de fractions
peptidiques aux caractéristiques diverses qui sont importantes pour la recherche de composés
bioactifs.

L’objectif principal de cette thèse était donc de déterminer des allégations biologiques
liées à l'amélioration des fonctions physiologiques du MetS lors de l'assimilation
d'hydrolysats de laitance, et l’effet de leur fractionnement par électrodialyse avec membranes
d’ultrafiltration sur la production de fractions bioactives. Dans un premier temps, des essais
sur des souris ont été effectués afin d’analyser l’impact d’une supplémentation à base
d’hydrolysat de laitance de hareng sur le développement de certains désordres métaboliques
associés à une diète riche en gras et en sucre. Dans un second temps, deux de ces hydrolysats
ont été séparés grâce à l’utilisation d’une nouvelle configuration d’électrodyalyse avec

2
membranes d’ultrafiltration permettant un double fractionnement simultané des composés
anioniques et cationiques. Différentes bioactivités ont été testées in vitro : captation du
glucose, antioxydante et antiinflammatoire. Finalement, les séquences peptidiques des
fractions ayant démontré un effet positif sur certains paramètres physiologiques ont été
identifiées lorsque possible.

3
CHAPITRE 1 : Revue de littérature

Les produits marins

Les produits marins représentent toutes les sources halieutiques exploitées par
l’homme : les poissons, les crustacés, les mollusques et les algues. Cependant, le poisson
reste une source alimentaire majeure pour de nombreuses populations et représente 17% des
protéines animales consommées dans le monde20. Ainsi, cette thèse s’intéressera à
l’utilisation de cette ressource et notamment à l’un des poissons les plus pêchés au Québec,
le hareng de l’Atlantique (Clupea harengus). Dans cette partie, l’utilisation et la
consommation du poisson au niveau mondial seront présentées ainsi que son intérêt pour la
santé humaine. La production de co-produits de poisson ainsi que leurs principales voies de
valorisation seront aussi détaillées. Enfin, cette thèse portant sur l’utilisation potentielle de la
laitance de hareng de l’Atlantique pour la santé humaine, la valorisation actuelle de ce co-
produit sera abordée dans ce document.

Le poisson : une denrée importante

Intérêt de la consommation de poisson

Depuis ces dernières années les consommateurs ont pris conscience de l’étroite
relation entre une alimentation saine et leur santé. Il est maintenant documenté qu’une
alimentation équilibrée, grâce à la consommation de certains aliments, permet l’apport
quotidien d’énergie mais aussi l’amélioration de la santé humaine21-23. Les produits
halieutiques, comme le poisson, font partie des aliments recommandés par les nutritionnistes,
afin de prévenir les maladies chroniques comme le diabète ou les maladies
cardiovasculaires24.

Cette prise de conscience de la population, a mené à une augmentation de la

consommation mondiale de poisson d’environ 1,5% par année, atteignant 20,2
kg/personne/an en 201520. Cet engouement est dû à la qualité nutritionnelle des produits,
mais aussi à leurs vastes choix au niveau gustatif et texturant. Le poisson est une denrée
importante dans le régime alimentaire et permet l’apport d’éléments essentiels comme les
protéines, les lipides, les minéraux ou les vitamines. En effet, la teneur en protéine dans la

4
chair, est en moyenne de 22% (w/w) indépendamment des espèces, représentant 17% des
protéines animales consommées dans le monde20, 25. Les protéines des produits halieutiques
sont reconnues comme étant plus digestes que celles de la viande et leur teneur en acides
aminés essentiels est en général également un peu plus élevée1. Les lipides, autres composés
essentiels dans l’alimentation, sont plus variables selon les espèces de poisson : les poissons
maigres ayant une teneur en lipide inférieure à 1% et les poissons gras présentant une
concentration supérieure à 10%. De plus, ils contiennent trois acides gras essentiels : l’acide
linoléique, l’acide linolénique et l’acide arachidonique. En effet, ne pouvant être synthétisés
par l’homme, leur apport dans l’alimentation est vital pour le bon fonctionnement du
métabolisme.

Production et utilisation du poisson : contexte global

En 2016, d’après l’Organisation des nations unies pour l’alimentation et l’agriculture

(Food and Agriculture Organization of United Nations, FAO) la production halieutique
mondiale a atteint une valeur record de 171 millions de tonnes, grâce notamment à
l’augmentation de la production par l’aquaculture, représentant 47% des captures
mondiales20. La pêche de capture s’élevait à 90,9 millions de tonnes en 2016 pour une valeur
commerciale estimée à 130 milliards de dollars américains (USD, «United State dollar»)20.
La Chine reste le principal pays producteur avec plus de 15 millions de tonnes, suivie par
l’Indonésie (6,1 millions de tonnes) et les États-Unis (4,8 millions de tonnes)20. Le Canada
se positionnait en 2016 au 20ème rang mondial des pays producteurs, représentant un volume
de capture de 800 milles tonnes pour une valeur de 3,8 millions USD26. Le poisson et les
produits à base de poisson font partie des aliments les plus échangés au niveau mondial.
Ainsi, 35% de la production mondiale de poisson ont été échangés au niveau international en
2016, représentant une valeur d’exportation de 152 milliards USD20. Au Canada,
l’exportation de poisson de capture représentait en 2016 20% de sa production (157 mille
tonnes) pour une valeur de 5 milliards USD26. Ainsi, le commerce des produits halieutiques
est une source importante pour le produit intérieur brut des gouvernements, mais aussi dans
le secteur de l’emploi. En effet, au Canada 77 mille personnes travaillaient dans le secteur lié
à la pêche en 2017, dont 28 mille dans la transformation des produits halieutiques26.

5
 En 2016, la majeure partie de la production de poisson a été destinée à la
consommation humaine directe (88%), sous forme de produits vivants/frais/réfrigérés (45%),
congelés (31%), préparés et mis en conserve (12%) et enfin séchés/salés/fumés/saumurés
(12%). La majeure partie de la production affectée à des usages non alimentaires, a été
utilisée pour la production de farine et d’huile de poisson (figure 1-1)20.

Figure 1-1 : Utilisation des produits de la pêche dans le monde (ventilés par volume), 1962-2016
(tiré de FAO20).

Le hareng de l’Atlantique (Clupea harengus)

Le hareng de l’Atlantique (Clupea harengus) est la sixième espèce la plus pêchée au

monde, avec en 2016 1,6 millions de tonnes débarquées à travers le globe, dont 140 mille
tonnes au Canada, faisant du hareng l’espèce la plus pêchée dans le pays20. En effet, c’est
une espèce endémique des côtes Atlantiques du Canada, avec une zone de capture s’étendant
des côtes sud-ouest de la Nouvelle-Écosse, au sud du golfe du Saint-Laurent et sur les côtes
est et ouest de Terre-Neuve-et-Labrador. Le hareng est un petit poisson pélagique mesurant
entre 20 et 25cm de long, vivant en banc dans les eaux profondes en journée puis près de la
surface la nuit pour se nourrir. Au Canada, le hareng de l’Atlantique est principalement pêché
au printemps et en été. Cependant, la période de fraye du hareng pouvant être au printemps
ou en automne, la pêche de cette espèce est interdite au printemps depuis 1994 dans la Baie
de George et de Port-au-Port afin de maintenir des niveaux de stocks sains27. Faisant partie
de la famille des poissons gras, le hareng est aussi bien utilisé pour la consommation humaine

6
que pour la production de farine et d’huile de poisson. En effet, le hareng est depuis
longtemps connu pour son fort potentiel nutritionnel, notamment dans l’apport d’acides gras
polyinsaturés (AGPI), comme les omégas-3 (ω-3) acides eicosapentaénoïques (EPA,
«eicosapentaneoic acid») ou acides docosahexaénoïques (DHA, «docosahexaenoic acid»)28,
29
.

Co-produits de poisson : utilisation et valorisation

Les co-produits de poisson désignent les parties du poisson écartées pour la

consommation directe après leur transformation2. Ainsi ces co-produits s’ajoutent aux 19
millions de tonnes de poisson de capture destinées à la non-consommation humaine (figure
1-1)20. L’industrie agroalimentaire marine produit de nombreux déchets organiques dont les
co-produits, pouvant représenter jusqu’à 60% du poisson initial suivant l’espèce (arêtes,
peau, tête, viscères, gonade…) (figure 1-2)2, 30. Cependant, ces déchets ont un réel impact
environnemental et économique dans notre société et leur traitement et leur utilisation est une
étape importante. Au Québec, les déchets organiques représentent environ 4 millions de
tonnes métriques/an. Or, d’après le Plan d’action 2011-2015 sur la gestion des matières
résiduelles émis par le Ministère du Développement Durable, de l’Environnement et des
Parcs (MDDEP), l’enfouissement des déchets organiques sera banni à partir de 2020. Ainsi,
le secteur agroalimentaire devra trouver de nouvelles solutions afin d’utiliser au mieux ses
déchets. De plus, les co-produits de poisson sont riches en composés à hautes valeurs, comme
les protéines et les lipides (Tableau 1-1), leur valorisation représente donc une source de
diversification économique potentiellement très intéressante pour de nombreuses
communautés2.

7
 Figure 1-2 : Principaux co-produits de poisson (d’après Rustad et al.2). ND : non définis

Cependant, la valeur économique de ces co-produits dépend de la voie de valorisation

choisie. Ainsi, une valorisation de masse va permettre l’utilisation de grandes quantités ayant
une valeur finale plutôt faible alors qu’une valorisation de niche permet une utilisation à très
haute valeur ajoutée mais en plus faible quantité.

Tableau 1-1 : Composés à haute valeur présents dans les co-produits de poisson (d’après Rustad et
al.2)
Protéine Lipide Autre
Haché de poisson Huiles marines Calcium
Surimi AGPI et oméga 3 (DHA, EPA) Taurine
Isolats protéiques Phospholipides Colorants - Astaxanthine
Gélatine/collagène Vitamines Composés bioactifs
Hydrolysats protéiques Cholestérols
Peptides bioactifs Squalène
Enzymes
Protamines

8
 Valorisation de masse

1.1.2.1.1 Farine et huile de poisson

La farine et l’huile de poisson restent les ingrédients les plus nutritifs et digestes pour
les poissons d’aquaculture, c’est pourquoi ils sont majoritairement utilisés dans ce domaine20.
Brièvement, les farines de poisson sont obtenues après mélange et chauffage de la matière
première, permettant la coagulation des protéines. Après une étape de séparation
liquide/solide par pressage ou centrifugation, (i) les gâteaux de presse sont séchés, afin
d’obtenir une poudre homogène de protéines, (ii) alors que la fraction liquide sera valorisée
en huile. La farine et l’huile de poisson sont principalement produites à partir de petits
poissons pélagiques, comme le hareng, l’anchois, le chinchard ou la sardine. Cependant, les
co-produits sont de plus en plus utilisés dans ces procédés, du fait de leur variété et de leur
faible coût, ils représentaient ainsi 25 à 35% des farines et huiles de poisson produites en
201620. Depuis quelques années, des alternatives à la farine et l’huile de poisson sont
recherchées, afin de limiter la surexploitation des petits poissons pélagiques pour
l’aquaculture. Des substituts à base de plantes sont utilisés, principalement pour les poissons
omnivores et herbivores mais leurs utilisations restent restreintes pour les carnivores, dû à
leur plus haute demande en protéines (entre 40-55% de la diète)31. De plus, les demandes en
AGPI des poissons carnivores, et spécifiquement des poissons marins, sont importantes, c’est
pourquoi en 2010 80% des huiles et 63% des farines de poisson étaient utilisées pour
l’aquaculture31.

1.1.2.1.2 Pulpe et isolat de protéines

La transformation des produits de poisson est un procédé produisant de grands

volumes de co-produits. L’opération de filetage va permettre de récupérer les filets de
poisson pour la consommation humaine, mais va également produire des co-produits
contenant encore de la chair et notamment des protéines32. Afin de valoriser ces déchets, la
chair va être retirée mécaniquement par pressage des co-produits à travers des perforations
permettant l’élimination de la peau et des arêtes, et l’obtention d’une pulpe de poisson haché2,
33
. Cette pulpe de poisson va servir pour la confection de nombreux produits alimentaires
intermédiaires et pour la préparation de plats cuisinés. Elle va aussi pouvoir être lavée afin

9
de retirer les protéines sarcoplasmiques et les composants participant à la dénaturation des
protéines durant la congélation, afin d’obtenir du surimi de poisson2.

Une autre voie de valorisation de masse des protéines de poisson est la production
d’isolats protéiques de poisson. En effet, ce processus va permettre le traitement de poissons
entiers éviscérés et/ou de co-produits directement. Ces isolats font référence à des produits
contenant au moins 90% de protéines de muscle (myofibrillaires), concentrées par la
technique de «pH shift»2. Les protéines myofibrillaires vont pouvoir être solubilisées à de
faibles forces ioniques et à de faibles ou hautes valeurs de pH, puis précipitées à leur point
isoélectrique (pH 5.5)34, 35
. Les isolats protéiques vont avoir une plus haute valeur
économique que la pulpe et le surimi de poisson grâce à leurs propriétés fonctionnelles plus
importantes, notamment émulsifiantes et gélifiantes34. Ces deux propriétés sont
principalement dues à la présence de myosine dans les isolats protéiques de poisson. Sa
capacité émulsifiante est expliquée par la présence de résidus hydrophobes dans la région
globulaire et de groupes polaires dans la tige fibreuse, faisant de la myosine la protéine
musculaire la plus émulsifiante34. De plus, cette protéine est aussi responsable de la formation
de gels lors du chauffage36.

Valorisation de niche

1.1.2.2.1 Gélatine et collagène marin

La gélatine est obtenue à partir de l’hydrolyse partielle du collagène qui est la protéine
majoritaire du tissu conjonctif. C’est une protéine soluble ayant de nombreuses propriétés
fonctionnelles, telles que moussante, émulsifiante, filmogène et surtout la capacité de liaison
avec l’eau. Cela fait de la gélatine une protéine très utilisée dans l’industrie agroalimentaire
(texture, mâche, stabilisation de mousse, texture crémeuse, gélification), dans l’industrie
pharmaceutique (implant, perfusion, encapsulation, pansement, expanseur de volume
plasmique) et dans la cosmétique (hydratant et texturant)37, 38. Les principales sources de
gélatine sont la peau de porc (46%), le cuir de bovin (29%) et les os (23%). Cependant, la
préoccupation des consommateurs envers ces matières premières a incité les industriels à
trouver de nouvelles sources37. Les restrictions alimentaires de certaines religions,
l’augmentation du végétarisme et l’inquiétude envers l’encéphalopathie spongiforme bovine
ont soulevé de nombreux questionnements sur la gélatine de mammifère et ont permis l’essor
10
de nouvelles matières premières comme les co-produits de poisson37, 38. La gélatine de
poisson est extraite à partir de la peau, des arêtes et des nageoires, principalement par
traitement acide ou basique à des températures entre 45°C et 60°C, permettant le clivage des
liaisons croisées covalentes inter et intramoléculaires37. Les propriétés fonctionnelles de la
gélatine sont en étroite relation avec la matière première et les paramètres de la méthode
d’extraction (pH, température, temps) qui vont influencer la longueur du polypeptide
obtenu39. Ainsi, la gélatine obtenue à partir de poissons d’eau froide va avoir une plus faible
force de gel à 10°C que celle extraite de poissons d’eau chaude qui va se rapprocher de la
gélatine de mammifère38. De plus, la température de fusion de la gélatine va aussi se
différencier suivant l’espèce de poisson. Ainsi, les poissons d’eau froide auront une
température de fusion plus faible que ceux d’eau chaude (proche de celle des mammifères)37,
38
. La biodiversité marine permet donc d’obtenir des produits aux propriétés différentes,
élargissant ainsi leur champs d’utilisation : micro-encapsulation et produits réfrigérés pour
la gélatine de poisson d’eau froide ; produits stockés à température pièce pour la gélatine de
poisson d’eau chaude37.

De plus, les nouveaux procédés d’extraction et de pré-traitement comme l’hydrolyse

enzymatique, les ultrasons et les ultra hautes pressions permettraient de réduire le temps
d’extraction de la gélatine ainsi que les volumes d’eau utilisés39.

1.1.2.2.2 Lipides marins

Les lipides sont des composés importants pour la nutrition humaine et ils sont
notamment indispensables au bon déroulement de nombreuses voies métaboliques. Ils sont
divisés en deux classes suivant leur structure et leur rôle dans l’organisme. Ainsi les lipides
neutres, majoritairement composés de triacylglycérols, sont des réserves énergétiques et
l’oxydation de leurs acides gras (AG) va permettre la production d’adénosine-triphosphate
(ATP). Les lipides polaires majoritairement composés de phospholipides, sont des lipides de
structure et constituent la double couche membranaire des cellules. Les AG sont composés
d’un acide carboxylique attaché à une chaine carbonée dont le nombre de doubles liaisons va
définir leur degré d’insaturation : saturés (AGS), monoinsaturé (AGMI) et polyinsaturés
(AGPI). De nombreuses études épidémiologiques ont présenté les effets bénéfiques des
AGPI, en particulier des oméga-3 (ω-3), sur la prévalence des maladies cardiovasculaires

11
dans les populations ayant une diète riche en produits marins40-43. En effet, les poissons sont
connus pour leur forte teneur en AGPI, pouvant représenter entre 25% et 40% des lipides
totaux, et notamment en EPA (20:5 n3) et en DHA (22:6 n3)44. Les variations de
concentration en AGPI sont dues à leur rôle physiologique au sein des organismes.
L’insaturation des AGPI leur confère une température de cristallisation plus basse et permet
ainsi de maintenir la fluidité des membranes cellulaires dans les eaux froides. De ce fait, les
poissons des eaux froides auront une concentration en AGPI plus importante que les
populations des eaux chaudes. De plus, les poissons gras comme le hareng, vont avoir une
importante concentration en lipides dans tous leurs tissus, alors que pour les poissons maigres
comme la morue (Gadus sp), les lipides seront majoritairement présents dans des organes de
stockage comme le foie.

De ce fait, l’intérêt pour les huiles de poisson pour la santé humaine a fortement
augmenté et les huiles de hautes qualités riches en AGPI représentent un marché important
pour les industriels. En effet, les mammifères étant incapables de convertir l’acide linoléique
(C18:2 n6) en acide α-linolénique (C18:3 n3), leur apport dans le régime alimentaire est
indispensable au bon fonctionnement de l’organisme et en font des AG essentiels (Figure 1-
3). De plus, la conversion de l’acide α-linolénique en EPA puis en DHA est très faible chez
l’être humain (entre 0,2% et 8% pour l’EPA et 0% et 4% pour le DHA). De ce fait, le régime
alimentaire, spécifiquement en poissons gras, reste la plus importante source d’AGPI ω-3
pour l’être humain.

Figure 1-3 : Biosynthèse des AGPI ω-3 (tiré de Bergé et Barnathan44).

12
 De nos jours, le principal procédé d’extraction lipidique des co-produits de poisson
se fait en milieu aqueux à hautes températures. Cependant, la présence d’insaturations dans
les AG les rend plus sensibles et augmente le risque d’oxydation des AGPI. La qualité de
l’huile de poisson va dépendre de sa concentration en AGPI et surtout de sa stabilité à
l’oxydation. Ainsi, une extraction à des températures plus faibles (60°C - 70°C) ou pendant
un temps plus court permettra de conserver un maximum d’AGPI dans les huiles finales45.
De plus, des études ont montré que le temps de procédé et la fraicheur de la matière première
influençaient aussi sur la qualité finale de l’huile28, 46
. Enfin, des nouvelles techniques
d’extraction lipidique comme les hydrolyses enzymatiques pourraient augmenter le
rendement et la qualité des huiles finales45, 47, 48.

Depuis plusieurs années, les bienfaits des AGPI et notamment du DHA et de l’EPA
sur la prévention des maladies cardiovasculaires ont largement été étudiés (voir section
1.2.2.2). Cependant, ces composés ont montré d’autres activités sur la santé humaine, comme
des effets antiprolifératifs de cellules cancéreuses, reportées dans plusieurs revues de
littératures49, 50. Plusieurs mécanismes d’actions du DHA et EPA ont pu être démontrés,
comme l’apoptose des cellules grâce à l’augmentation de protéines pro-apoptotiques,
l’induction du stress oxydant avec la formation importante d’espèces réactives à l’oxygène
(ROS, «reactive oxygen species») dans les cellules cancéreuses suite à la peroxydation
lipidique du DHA et la réduction de la production de la prostaglandine E2, un médiateur
lipidique induisant la croissance des cellules cancéreuses49-53. Des études ont aussi révélé la
corrélation entre un régime alimentaire riche en poisson ou AGPI et la diminution de
développement de désordres psychiatriques comme la dépression, la maladie d’Alzheimer et
la schizophrénie54-56.

1.1.2.2.3 Les peptides bioactifs

Production des peptides de poisson bioactifs

Les aliments fonctionnels sont définis par Santé Canada comme étant des aliments
conventionnels fournissant des avantages physiologiques ou réduisant les risques de maladies
chroniques, au-delà de leurs fonctions nutritionnelles de base57. Depuis ces vingt dernières
années, il y a un intérêt majeur des scientifiques et des industriels pour les aliments
fonctionnels, et notamment pour la production de peptides bioactifs (PB), qui résultent de

13
 l’hydrolyse d’une protéine initiale. Ce sont des séquences d’acides aminés (généralement
entre 2 et 20), ayant des propriétés bénéfiques pour la santé humaine25, 30. La recherche en
agroalimentaire sur la production, la concentration et la caractérisation de ces PB, représente
un véritable enjeu économique, écologique et sociétale58. Les protéines de poisson sont
classées en trois groupes :

• Les protéines sarcoplasmiques (15 à 35% des protéines totales) présentent dans la
sarcoplasme regroupant généralement des enzymes liées à la production d’énergie comme la
créatine kinase ou l’aldolase25.
• Les protéines myofibrillaires (65 à 75% des protéines totales), sont des protéines de structure,
principalement composées de la myosine et de l’actine. Elles sont solubles à de hautes
concentrations en sels25.
• Les protéines du stroma ou tissu conjonctif (3% des protéines totales) composées
essentiellement de collagène. Elles sont les moins solubles25.

Cependant, la valeur nutritionnelle et l’activité biologique des PB dépendent de

nombreux paramètres. La production des PB est donc devenue un réel enjeu pour les
industriels58. Pour cela, deux techniques principales d’hydrolyses peuvent être utilisées :
chimique ou enzymatique. Ces deux méthodes vont permettre la rupture des liaisons
peptidiques et donc la libération d’acides aminés (AA) libres ou de peptides.

1.1.2.2.3.1.1 Hydrolyse chimique

L’hydrolyse chimique utilise des acides (l’acide chlorydrique, HCl) pour une
hydrolyse acide ou des bases (l’hydroxyde de sodium, NaOH ou l’hydroxyde de potassium
KOH) pour une hydrolyse alcaline. Ces deux procédés ont largement été utilisés dans le
passé, dû à leur facilité, leur rapidité et leur faible coût59. Cependant, certains AA sont très
sensibles à ces substances. Ainsi, les acides détruisent le tryptophane et transforment les
fonctions amides de la glutamine et de l’asparagine en acide, menant à la formation de
glutamate et d’aspartate. Quant à l’utilisation de bases, cela dégrade la sérine, la thréonine et
la cystéine. De plus, l’hydrolyse chimique est souvent couplée avec de hauts pH et
températures. Il s’agit donc d’un procédé difficile à contrôler, menant souvent à la production
de peptides aux compositions en AA et aux propriétés biologiques variables59. De plus, la

14
perte de nombreux acides aminés essentiels conduit à la formation d’hydrolysats de faibles
qualités nutritives et fonctionnelles. Ainsi cette technique est de moins en moins utilisée, sauf
pour la production d’hydrolysats concentrés en peptides à faibles valeurs ajoutées59.

1.1.2.2.3.1.2 Hydrolyse enzymatique

L’hydrolyse enzymatique utilise comme catalyseur de réaction des enzymes qui sont
spécifiques au type de substrat à hydrolyser (lipides, glucides, protéines…)59. Ainsi pour la
production de PB, les enzymes utilisées sont des protéases qui rompent les liaisons
peptidiques entre les AA (figure 1-4). Elles vont donc libérer des polypeptides, des peptides
de différents poids moléculaires (PM) et des AA libres. Ces protéases sont produites
naturellement par de nombreux organismes vivants, comme les animaux (trypsine, pepsine),
les plantes (papaïne, bromélaine) ou les microorganismes (Alcalase® et Flavourzyme®).
Cependant, les industriels utilisent souvent des mélanges d’enzymes, afin d’augmenter le
nombre des sites de coupures60, 61
. En effet, deux types de protéases existent : les
exopeptidases qui rompent les groupements carboxyles (carboxyle peptidase) ou amines
(amino peptidase), situés à l’extérieur de la chaine peptidique, libérant des AA libres ; et les
endopeptidases qui coupent les liaisons peptidiques à l’intérieure de la chaîne, libérant des
peptides de compositions et PM différents59 (figure 1-4). Pendant l’hydrolyse, un certain
nombre de paramètres vont influencer l’obtention de PB, tels que la concentration et la nature
de l’enzyme, la valeur du pH, le temps de réaction, la température et le ratio
enzyme/substrat59-65. Kristinsson et Rasco61 ont démontré que le choix de l’enzyme influait
sur la cinétique de la réaction enzymatique. Ainsi, la Corolase7089® présentait la meilleure
vitesse de réaction suivi de la PCE (pyloric caeca extract), la Flavourzyme®, la Corolase PN-
L® et l’Alcalase®. Ces paramètres influencent aussi le degré d’hydrolyse de la solution (DH,
% de liaisons peptiques hydrolysées), étroitement lié aux activités biologiques et
fonctionnelles des peptides finaux62, 64, 66, 67. Klompong et al.62, ont réalisé une hydrolyse
enzymatique de Sélar à bande dorée (Selaroides leptolepis) par deux enzymes (Alcalase® ou
Flavourzyme®). Les auteurs ont ainsi montré les relations entre le DH final, le type de
protéase utilisé et les activités antioxydantes/fonctionnelles obtenues (capacité émulsifiante
et solubilité). En effet les fractions présentant le plus fort DH (25%), amélioraient la solubilité
de la solution, due à la présence de peptides de faibles PM pour les deux types d’enzymes.

15
La capacité émulsifiante était quant à elle augmentée par les fractions aux plus faibles DH
(5%), suivant l’enzyme.

Endopeptidase

NH2 COOH

Amino peptidase Carboxyle peptidase

Figure 1-4 : Schéma d'illustration des sites de coupures des protéases.

Pour les activités biologiques, les relations semblent plus subtiles, mais dépendent
fortement du type d’enzyme et du DH. En effet, Klompong et al.62 reportaient une plus forte
activité de chélation des métaux par les fractions générées par la Flavourzyme au DH le plus
fort (25%). L’optimisation de ces paramètres est donc une étape cruciale pour les industriels
afin de pouvoir au mieux générer des PB de manière fiable et reproductible. La recherche
d’enzymes va donc permettre aux industriels d’identifier les meilleures protéases produisant
des PB aux activités biologiques intéressantes et rentables. En fin de procédé les enzymes
doivent être inactivées pour la mise sur le marché des PB. Pour cela, plusieurs techniques
peuvent être utilisées : l’inactivation thermique (les températures sont augmentées jusqu’à
80-90°C pendant 10 minutes pour un hydrolysat de poisson), l’inactivation par le pH
(diminution par l’ajout d’acide suivant l’enzyme utilisée) ou la filtration par membrane59.

Ainsi, la meilleure maîtrise de l’hydrolyse avec l’utilisation d’enzyme, fait de ce

procédé le principal utilisé pour la production de PB. De plus, l’importante biodiversité du
milieu marin et le riche choix des enzymes ont permis la production de nombreux PB
présentant des bioactivités très diverses : antioxydante, anticancer, antihypertenseur,
antibactérien30, 63, 68
. Ainsi, les PB de poisson peuvent être utilisés dans l’industrie
agroalimentaire comme conservateurs mais aussi dans l’industrie nutraceutique pour
améliorer certains paramètres physiologiques pour la santé humaine. Cette dernière
application des PB de poisson sera détaillée dans la section 1.2.3.

16
 Peptides d’hareng de l’Atlantique
Comme vu précédemment, les hydrolysats de poisson peuvent avoir des activités
biologiques variées et complexes. Ces dernières vont dépendre de la composition en AA et
du PM des PB. Ainsi la matière première reste cruciale dans l’obtention de PB de poisson.
Le hareng de l’Atlantique étant un poisson gras avec une teneur importante en AGPI ω3, il
est principalement utilisé pour la production de farine mais surtout d’huile. En effet, les
chercheurs se sont principalement focalisés sur l’extraction d’huile de hareng, très recherchée
du fait de sa grande qualité28. Néanmoins, très peu de publications scientifiques ont valorisé
le potentiel des peptides contenus dans ces co-produits. Le tableau 1-2 présente la littérature
traitant de PB issus d’un hydrolysat enzymatique de hareng de l’Atlantique (Clupea
harengus). Dans leur étude, Slizyte et al.69 présentaient une augmentation de l’activité
antioxydante (inhibition du taux d’oxygène catalysé par le fer) par deux hydrolysats
enzymatiques de hareng. Cependant, de récentes études ont été faites sur l’effet de l’ajout
d’hydrolysat de hareng dans la diète de rat Zucker fa/fa sur certains paramètres impliqués
dans le syndrome métabolique comme la dyslipidémie, l’hypertension et les fonctions rénales
(Tableau 1-2)70, 71
. De plus, Pampanin et al.72 ont révélé la présence de PB issus de
l’hydrolyse enzymatique de la peau et de co-produits de hareng, répertoriés dans les bases de
données. Ainsi, certains PB présentaient des motifs liés aux activités antioxydante,
antimicrobienne, cardioprotectrice et immunomodulatrice. Dans leur étude sur des rats
Wistar nourris avec une diète riche en gras dont la fraction protéique était remplacée par un
hydrolysat de hareng, Pilon et al.73 ont reporté une diminution de l’expression des cytokines
TNFα et IL6 dans le tissu adipeux par rapport aux animaux nourris avec de la caséine.
L’hydrolysat de hareng, permettait donc de réduire l’inflammation induite par une diète
obésogène. Un grand intérêt a aussi été porté sur les activités fonctionnelles (émulsifiante et
moussante) des hydrolysats de hareng, dû à la présence de nombreuses molécules
amphiphiles74. Cependant, l’activité émulsifiante reste souvent inférieure à celle de l’œuf ou
du soja, qui sont aujourd’hui majoritairement utilisés dans les procédés agroalimentaires75.
De plus, leur goût et leur odeur prononcés, permettent d’envisager leur incorporation
seulement dans des matrices alimentaires marines. Ainsi, les co-produits d’hareng
représentent des sources de matières premières intéressantes pour la production de PB.

17
Tableau 1-2 : Peptides issus d’hydrolysats enzymatiques de hareng de l'Atlantique (Clupea
harengus). NI : Valeur non indiquée.
Partie de Degré Activité biologique /
Enzyme Références
l'organisme d'hydrolyse (%) fonctionnelle
Emulsifiante
Poisson entier Alcalase® 36 Liceaga et al.74
Moussante
Mélange Alcalase® 24
d'arrêtes, peau, Papaïne + Antioxydante Slizyte et al.69
17
tête et viscères bromélaine
Poisson entier 13
Corps (sans la Emulsifiante,
13
tête) Alcalase® adsorption des gras, Sathivel et al.75
Tête 18,3 antioxydante
Gonade 10,1
Poisson entier Protamex® NI Intérêt nutritionnel Beaulieu et al.76
Alcalase® 44,7 Solubilité
Muscle Hoyle et Meritt77
Papaïne 43,4 Intérêt nutritionnel
Milieu de culture
Poisson entier Protamex NI Beaulieu et al.78
bactérien
Mélange tête,
Papaïne + Drotningsvik et
viscères et NI Dyslipidémie
bromélaine al.70
dorsale
Mélange tête,
Papaïne + Fonctions rénales et Drotningsvik et
viscères et NI
bromélaine inhibiteur ACE al.71
dorsale
Poisson entier Protamex® NI Anti-inflammatoire Pilon et al.73

1.1.2.2.4 Laitance de poisson

La laitance de poisson représente l’organe reproducteur (gonade) des individus mâles.

C’est un co-produit de l’industrie agroalimentaire, obtenu après une opération de filetage des
poissons. C’est une matière première complexe contenant des protéines, de l’ADN et des
lipides. En effet, dû à son rôle dans la reproduction, la laitance de poisson est riche en ω-3 et
notamment en DHA et EPA principalement sous forme de phospholipides79, 80. La fraction
protéique de la laitance est connue pour sa composition importante en protamine, un peptide
cationique d’environ 5kDa (66% Arg, point isoélectrique de 12-13) permettant la compaction
de l’ADN82. La protamine du hareng, nommée clupéine, est utilisé sous trois formes :
clupéine YI (séquence peptidique : ARRRR SSSRP IRRRR PRRRT TRRRR AGRRR R),
clupéine YII (PRRRT RRASR PVRRR RPRRV SRRRR ARRRR) et clupéine Z (ARRRR

18
SRRAS RPVRR RRPRR VSRRR RARRR R)81. Elle est notamment utilisée pour des
applications médicales (antagoniste de l’héparine, agent de libération de l’insuline injectable
et antibactérien)82. Cependant, malgré cette composition intéressante pour la nutrition
humaine, la laitance de poisson se retrouve souvent mélangée avec les autres co-produits et
utilisée pour la production d’huile de poisson. L’utilisation de nouvelles méthodes de
détection et de séparation lors des opérations de filetage pourrait cependant augmenter la
valeur de cette matière première. Ainsi, Guttormsen et al.83 utilisaient un système de
traitement d’image pour séparer automatiquement les laitances après leur détection à une
longueur d’onde de 785nm, permettant une collecte plus rapide et moins coûteuse.

Peu d’études ont été réalisées pour évaluer l’impact de la laitance de hareng sur la
santé humaine. Bjørndal et al.84 ont montré in vivo, la capacité anti-inflammatoire de la
laitance de hareng entière (75% des protéines de la diète) sur des souris génétiquement
modifiées exprimant le gène TNFα («tumor necrosis factor α») et nourries avec une diète
riche en gras. Le niveau d’AGPI ω-3 dans le foie et dans le tissu adipeux blanc était augmenté
avec la diète supplémentée en laitance de hareng, alors que le niveau ω-6 était diminué,
permettant un changement du ratio ω-6/ω-3 (3,6:1 à 1,5:1 pour le foie et 14:1 à 5:1 dans le
tissu adipeux). À notre connaissance, aucune étude n’a été réalisée sur l’hydrolyse
enzymatique de la laitance de hareng et sur son utilisation pour la santé humaine.

En résumé, les co-produits de poisson sont une source importante de molécules

actives pour la santé humaine et leur valorisation optimale est un enjeu économique et
écologique pour les gouvernements. Cependant, un des freins dans leur valorisation est leur
qualité. En effet, les produits marins sont sensibles et leur dégradation est rapide et peuvent
être un possible risque pour la santé humaine (contamination par des pathogènes). Ainsi, une
bonne gestion des co-produits de poisson permettrait d’augmenter leur utilisation pour la
nutrition ou la santé humaine en plus de répondre aux exigences des réglementations
environnementales.

En effet, plusieurs molécules ont pu être identifiées et ont démontré des activités
biologiques intéressantes et importantes dans le traitement de certaines maladies comme le
syndrome métabolique (MetS). Ainsi, la valorisation des co-produits de poisson pour la santé
humaine est devenue un secteur d’activités en croissance. La section suivante fera l’état des
19
connaissances sur les activités biologiques de deux familles de composés (les AGPI ω-3 et
les PB) sur le développement de certains paramètres impliqués dans le MetS.

Le syndrome métabolique et les composés bioactifs marins

Depuis plusieurs années, le MetS est devenu un important problème de santé au
niveau mondial et notamment dans les pays développés dû à la diète occidentale (riche en
gras et en sucre)85, 86. En effet, sa prévalence aux États-Unis était entre 34% et 39% de 2002
à 2013 et de 19% au Canada3, 87, 88. En Europe, la situation est plus diverse selon les pays et
le MetS affectait 18% de la population au Danemark alors qu’il en affectait 30% en Espagne
en 201289. Le MetS est défini par la présence de plusieurs facteurs (dyslipidémie,
hyperglycémie, résistance à l’insuline, obésité viscérale) présentés dans le tableau 1-3.
Cependant, les critères de diagnostic du MetS présentent des variabilités suivant le sexe,
l’ethnie et l’âge des patients (Tableau 1-3). De plus, les personnes atteintes par le MetS
présentent deux fois plus de risques de développer un diabète de type 2 (DT2) et cinq fois
plus de risques de développer des maladies cardiovasculaires (MCV)4.

Des études épidémiologiques ont montré que les diètes riches en poisson permettaient
de réduire les MCV40, 43, 90
. De plus, la section précédente présentait la diversité des
molécules actives retrouvées dans les co-produits de poisson. Ainsi, dans cette section et pour
la suite du document, seulement les AGPI et les PB marins seront discutés.

20
Tableau 1-3 : Critères pour le diagnostic du MetS pour différentes organisations.
Critères IDF WHO AHA EGIR
Taux élevés de ≥ 150 ou ≥ 175 ou
≥ 150 ou traitement ≥ 150
triglycérides (mmol/L) traitement traitement
Faibles concentrations
< 40 H < 35 H < 35 H
de HDL-cholestérol < 39
< 50 F < 39 F < 39 F
(mmol/L)
Glycémie à jeun ≥ 100 ou
≥ 100 ou traitement ≥ 100 ≥ 100
(mg/dl) traitement
Obésité (tour de taille ≥ 94 H ≥ 90 H ≥ 120 H ≥ 94 H
en cm) ≥ 80 F ≥ 85 F ≥ 88 F ≥ 80 F
Pression artérielle ≥ 130/85
≥ 130/85 ≥ 140/90 ou
systolique/diastolique ≥ 140/90 ou
ou traitement traitement
(mmHg) traitement
Glycémie à jeun
Résistance à
Obésité viscérale + ou résistance à
Nombre de facteurs ≥3 l’insuline + 2
2 autres critères l’insuline + 2
autres critères
autres critères
H: homme, F: femme, IDF: International Diabetes Federation, WHO: World Health Organization,
AHA: American Heart Association, EGIR: European Group for Insulin Resistance.

Définition du syndrome métabolique et des désordres

métaboliques associés

Résistance à l’insuline, obésité et diabète de type 2

L’obésité viscérale est l’une des principales causes du développement du MetS. En

effet, l’augmentation du tissu adipeux viscéral va altérer son métabolisme en diminuant la
captation du glucose, augmentant celle des lipides et le stockage du gras91. De plus, la
libération d’AG libres du tissu adipeux via la lipolyse des triglycérides (TG), va entraîner
une résistance à l’insuline92. L’insuline est une hormone clef dans la régulation du glucose,
activant son transport dans les cellules et son stockage en glycogène ou lipide dans les tissus.
Elle joue aussi un rôle important dans la suppression de la lipolyse et donc la diminution de
la production d’AG libres93.

21
Figure 1-5 : Les deux voies principales de la signalisation à l’insuline (tiré de Miranda et al.94).

Cette hormone est produite par les cellules bêta du pancréas puis libérée dans le sang
où elle va pouvoir être captée et fixée par des récepteurs spécifiques (récepteur à l’insuline,
IR, «insulin receptor») présents sur les cellules (principalement dans le foie, les muscles et
le tissu adipeux) (figure 1-5)93. L’insuline va activer la voie de signalisation de la
phosphatidylinositol-3-kinase (PI-3K) permettant la translocation du transporteur de glucose
GLUT4 («glucose transporter type 4») et donc la captation du glucose dans la sang94. La
captation du glucose peut aussi s’effectuer par une voie non-insuline dépendante, la protéine
kinase adénosine monophosphate-dépendante (AMPK, «adénosine monophosphate-
activated protein kinase»). Une fois la résistance à l’insuline en place dans l’organisme, le
glucose ne va plus pouvoir être éliminé et la production de glucose hépatique ne va plus être
inhibée, résultant en une hyperglycémie chronique. En réponse, il va s’établir une
hyperinsulinémie : les cellules bêta du pancréas vont augmenter leur sécrétion d’insuline. À
long terme, le pancréas ne sera plus capable de produire de l’insuline afin de contrer
l’hyperglycémie et le DT2 va alors se développer.

Maladies cardiovasculaires et dyslipidémie

Le MetS est aussi défini par la mise en place d’une dyslipidémie caractéristique
présentant un taux élevé de lipoprotéines de très basse densité (VLDL «very low density
lipoprotein») riche en triglycérides (TG), une diminution du cholestérol riche en

22
lipoprotéines à haute densité (HDL, «high density lipoprotein») et un changement des
lipoprotéines de basse densité (LDL, «low density lipoprotein») en particules plus petites et
denses94. Ce phénotype particulier est aussi nommé «phénotype des lipoprotéines
athérogènes» et est notamment associé à un risque de développement de MCV95. En présence
de résistance à l’insuline, la lipolyse dans les adipocytes n’est plus inhibée, permettant la
libération excessive d’AG libres, transportés par la suite dans le foie et les muscles. Cela va
aussi activer la lipogenèse dans le foie, augmentant la concentration en TG principalement
sous forme VLDL94. Finalement, sous l’action de la protéine de transfert des esters de
cholestérol, les TG des VLDL vont être échangés pour les ester de cholestérol des HDL et
LDL. Cet enrichissement en TG de ces lipoprotéines va favoriser leur lipolyse par la lipase
hépatique, réduisant ainsi la concentration en HDL et la taille des LDL les rendant plus
denses et plus athérogènes94.

Le MetS est souvent associé aux MCV, et plusieurs études ont montré que la
prévalence du MetS était deux fois plus élevée dans des cohortes présentant des MCV
majeures96. Une méta-analyse a rapporté que les patients présentant des caractéristiques du
MetS mais sans DT2 avaient une plus forte prévalence de maladie coronarienne que ceux
atteints seulement de DT297. De plus, cette augmentation de risque de MCV a souvent été
associée au phénotype de dyslipidémie athérogène et notamment à la présence de LDL plus
petits et denses98, 99. En effet, une fois installées sous l’endothélium vasculaire, ces particules
vont être oxydées favorisant le développement de l’athérosclérose100.

L’inflammation dans le syndrome métabolique

Il est maintenant reconnu qu’en plus de stocker l’énergie, le tissu adipeux agit aussi
comme un organe endocrinien, libérant ainsi différentes substances bioactives (adipokines).
L’augmentation de la masse adipeuse va permettre l’établissement d’un désordre
métabolique, dans lequel la balance adipokines anti- et pro-inflammatoires va être déréglée,
contribuant au développement d’une inflammation chronique101. L’hypertrophie des
adipocytes va provoquer l’infiltration des macrophages en forme de couronne et le
changement de leur phénotype de type M2 en type M1 (figure 1-6). Ces derniers vont alors
produire des cytokines pro-inflammatoires (TNF et interleukine IL-6), exprimer la voie de

23
l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS «inducible nitric oxide synthase») et générer des
ROS101, 102.

Figure 1-6 : Changements phénotypiques du tissu adipeux et son rôle dans le développement d'une
inflammation chronique (tiré de Ouchi et al.101).

La production de ces cytokines pro-inflammatoires est aussi corrélée avec le

développement d’une résistance à l’insuline. En effet, elles vont pouvoir activer les voies de
signalisation C-JUN N-terminal kinase et le facteur nucléaire kappa B (NF-κB, «nuclear
factor kappa B») qui vont alors bloquer la voie de signalisation de l’insuline PI-3K par la
phosphorylation de la sérine du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1, «insulin receptor
substrat 1») et la diminution de son expression103.

De plus, l’activation de la voie iNOS a aussi été associée à la perturbation du transport

du glucose résultant de la résistance à l’insuline104, 105. En effet, il a été démontré par Perreault
et Marette104 que des souris dépourvues du gène iNOS et soumises à une diète riche en gras,
ne développaient pas de résistance à l’insuline et amélioraient leur tolérance au glucose par
rapport à leurs congénères sauvages. L’induction d’iNOS affecterait directement la voie de
signalisation PI-3K par une diminution de la phosphorylation de la tyrosine d’IRS-1 et donc
une baisse du transport du glucose dans les cellules musculaires104.

24
 Impact du microbiote intestinal sur le syndrome métabolique

Depuis plusieurs années, l’étude du microbiote intestinal est devenue un enjeu majeur
dans la compréhension du développement du MetS. En effet, les intestins humains
contiennent en moyenne 100 milliards de germes (bactéries, virus et champignons)
principalement représentés par les bactéries106. À l’heure actuelle, 28 phylums ont pu être
identifiés, les principaux étant les Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobactéries et
Proteobactéries106. Le développement des techniques de séquençage et de métagénomique,
a permis l’analyse du microbiote humain et la compréhension de son rôle dans le
fonctionnement métabolique de l’hôte. En effet, le microbiote intestinal va pouvoir agir
directement sur plusieurs propriétés fonctionnelles : la modulation du système nutritif de
l’hôte et son absorption énergétique (production de vitamines, fermentation d’aliments),
développement du système immunitaire et protection de pathogènes107, 108. Le microbiote va
produire un certain nombre de métabolites qui vont être transportés aux organes cibles et
interagir sur le métabolisme de l’hôte. Certains auteurs parlent même de communication entre
le microbiote et l’hôte109. Le régime alimentaire va être un élément majeur dans la mise en
place du microbiote et sa diversité. Des études sur le changement d’une diète végétarienne à
une diète occidentale ont montré un bouleversement de la diversité du microbiote chez des
souris110. De plus, ces altérations agissaient rapidement au sein de l’organisme avec une
augmentation des Bacteroides, Clostridiales et Bilophila et une diminution des Firmicutes,
Roseburia, Bifidobacterium et Eubacterium111, 112. Cette adaptation du microbiote par rapport
au régime alimentaire de l’hôte va donc directement impacter sur sa physiologie. Ainsi la
mise en place d’un microbiote spécifique chez les personnes obèses, appelé dysbiose, est
caractérisé par la diminution des Bacteroidetes et l’augmentation des Firmicutes.113, 114. Des
souris ‘sans germes’ nourries avec une diète riche en gras et en sucre (diète HFHS, «high fat
high sucrose») ne développaient pas d’obésité et de désordres métaboliques, mais en ont
développé après transplantation avec un microbiote d’individus obèses115, 116. Ces études
démontrent ainsi que le microbiote intestinal est un facteur affectant la prédisposition de
l’hôte à développer une obésité. Les espèces bactériennes du microbiote d’individus obèses
vont alors être capables de capter et stocker plus d’énergie lors de la diète favorisant ainsi le
développement de l’obésité117. Cette capacité plus importante de stockage d’énergie est due
à la production d’AG à chaînes courtes par l’hydrolyse et la fermentation de polysaccharides

25
dans la diète118. Les principaux sont l’acétate, le propionate et le butyrate. Ces derniers vont
influencer des fonctions métaboliques de l’hôte. De plus, l’importante production de
lipopolysaccharide (LPS) par les bactéries Gram négatives du microbiote va entraîner le
développement d’une inflammation ainsi qu’une résistance à l’insuline119. Cette dysbiose
bactérienne est aussi caractérisée par une faible diversité bactérienne, corrélée avec une
augmentation générale de l’adiposité, une résistance à l’insuline, une dyslipidémie et un
phénotype pro-inflammatoire120.

Rôle des acides gras polyinsaturés dans le développement du

syndrome métabolique

Le régime alimentaire est un facteur majeur dans le développement du MetS et

certains aliments vont avoir une influence bénéfique ou néfaste sur le métabolisme. Bien que
la consommation excessive de gras permette le développement du MetS, les AGPI vont eux
présenter des effets positifs pour santé de l’organisme.

Acides gras polyinsaturés et la résistance à l’insuline

Plusieurs études ont reporté une relation entre le nombre d’insaturation des AG dans
le plasma ou le muscle et l’augmentation de la sensibilité à l’insuline121-123. Borkman et al.122
démontraient qu’un enrichissement en AGPI des phospholipides du muscle squelettique
d’hommes sains était positivement corrélé (r = 0.76, p= 0.002) avec une augmentation de la
sensibilité à l’insuline. Ces études confirmaient ainsi la modulation possible des AGPI sur
l’insuline. Dans leur étude sur des rats Wistar, Storlien et al.8 montraient que le remplacement
de 6% de gras saturé par de l’huile de poisson dans une diète riche en gras, permettait de
maintenir une action identique de l’insuline que le groupe sous diète végétarienne. L’huile
de poisson prévenait ainsi le développement d’une résistance à l’insuline dans le foie et le
muscle des rats en améliorant l’oxydation du glucose induite par l’insuline ou la glycolyse,
mais également en changeant le stockage du glycogène du tissu adipeux au muscle
squelettique. Aussi sur des rats mâles Wistar nourris avec une diète riche en gras, Taouis et
al.124 reportaient des effets différents entre les ω-3 et ω-6 suivant le tissu étudié (foie ou
muscle). Pour les deux classes d’AGPI, aucune amélioration de la signalisation de la voie
IRS-1/PI-3k était observée dans le foie. Cependant, seule la diète enrichie en ω-3 permettait

26
la restauration de la phosphorylation de la tyrosine de IRS-1 dans le muscle, ainsi que le
maintien d’une activité normale de PI-3K et GLUT4 comparable au groupe contrôle124. En
effet, le muscle est un tissu important dans l’homéostasie du glucose et le développement
d’une résistance à l’insuline. Lors d’une hyperinsulinémie, la captation du glucose par les
cellules musculaires compte pour 75% de son utilisation par l’organisme entier125.

Cependant, les méta-analyses sur l’étude d’une supplémentation en ω-3 sur

l’incidence du DT2 présentent des conclusions différentes. Bien que certaines réfutent l’effet
bénéfique des AGPI, d’autres mettent en avant des effets significatifs des ω-3 sur la résistance
à l’insuline dans des sous-groupes (ethnicité, antécédents)126-128. Les études cliniques chez
l’homme ont aussi démontré l’importance de la composition en gras du régime alimentaire
sur la sensibilité à l’insuline129-131. Dans leur étude sur des individus obèses ou en surpoids,
Derosa et al.130 ont montré qu’une supplémentation en AGPI ω-3 de 3g/jours réduisait
significativement les valeurs HOMAR-IR (évaluation du modèle d'homéostasie de la
résistance à l'insuline), d’insuline à jeun et de la glycémie après 18 mois de traitement.

Les effets des AGPI sur la sensibilité à l’insuline ne sont pas encore bien connus, mais
ces derniers vont pouvoir impacter directement la fluidité des membranes cellulaires qui
jouent un rôle central dans le bon fonctionnement des fonctions physiologiques. La
composition en AG et le nombre d’insaturation des phospholipides composant cette bicouche
lipidique, jouent un rôle crucial dans sa fluidité et dans l’expression des voies
métaboliques132, 143. En effet, une concentration importante en AGS mène au développement
d’une structure rigide et l’augmentation des AGPI va permettre une meilleure fluidité de la
membrane cellulaire132, 133. Ainsi, dans l’étude KANWU, Vessby et al.134 démontraient qu’un
régime alimentaire riche en AGS diminuait la sensibilité à l’insuline chez des individus sains.
De plus, la relation entre la concentration en AGPI, notamment en DHA et EPA, des
membranes cellulaires et l’amélioration de l’action de l’insuline a été démontrée dans
différents tissus135-137. L’activité du récepteur à l’insuline va donc être ainsi directement
impactée par la fluidité membranaire, ainsi que son affinité avec l’insuline en circulation132.
De plus, l’activation par le DHA ou l’EPA du récepteur 120 couplé aux protéines G (GPR-
120, «G-protein coupled receptor 120»), va permettre l’augmentation de la translocation du
GLUT4 vers la membrane cellulaire et donc activer le transport du glucose du plasma vers

27
la cellule (figure 1-7)138. De plus, la régulation de la transcription des gènes impliqués dans
la lipogenèse et l’oxydation des AG, par l’activation du récepteur activé par les proliférateurs
de peroxysome (PPAR, «peroxisome proliferator-activated receptor») et des protéines de
liaison aux éléments de régulation du stérol (SREBP-1, «sterol regulatory element-binding
proteins-1»), va aussi permettre l’amélioration de la sensibilité à l’insuline par les AGPI
(figure 1-7)131, 139-141. L’ingestion d’huile de poisson entraînait une réduction de 75% de
SREBP dans le foie des rats, diminuant ainsi la synthèse des AG142.

Figure 1-7 : Actions des AGPI dans la résistance à l'insuline et le développement des MCV (D'après
Clarke SD140)

Prévention de la dyslipidémie et des maladies cardiovasculaires

L’effet des AGPI sur les maladies cardiovasculaires et particulièrement des ω-3 a été
étudié dans de nombreuses études à travers le monde143-147. Les études épidémiologiques de
Sinclair en 1944 étaient les premières à corréler les faibles taux de MCV dans les populations
Arctiques et leur importante consommation de poisson et d’AGPI ω-3148. Les mêmes
conclusions ont aussi été faites par Bang et Dyerberg40, 42, 149 sur la population Inuit qui
présentait un faible taux de TG plasmatiques corrélé à un faible risque d’infarctus du
myocarde. Une méta-analyse regroupant 25 études différentes reportait qu’une faible
concentration en AGPI était significativement marquée par une augmentation du risque de

28
développement de maladies coronariennes150. Des études aléatoires contrôlées ont été
réalisées afin d’analyser le bienfait des AGPI sur les MCV. Les trois principales sont DART
(Diet And Reinfarction Trial), JELIS (Japan EPA Lipid Intervention Study) et GISSI
(Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell’Infarto miocardico). La première
réalisée, DART a mis en avant qu’une consommation hebdomadaire de poisson gras
(300g/semaine) permettait de réduire de 29% les risques de mortalité par maladie
coronarienne chez des hommes ayant eu un infarctus du myocarde151. Les études GISSI et
JELIS quant à elles, analysaient plus spécifiquement l’effet du DHA ou EPA sur les risques
de mortalité par MCV. Ces deux études montrent elles aussi l’effet protecteur des AGPI ω-
3152-154.

Comme expliqué précédemment, la dyslipidémie athérogène est un facteur important

dans le développement de MCV. Dyerberg et al.41 ont mis en évidence que la consommation
de poisson par les populations Eskimo, permettait de réduire leurs taux de TG, VLDL, LDL
et d’augmenter leur concentration en HDL, limitant ainsi les MCV. De nombreuses études
ont ainsi confirmé la prévention de l’hypertriglycéridémie par les AGPI ω-3 chez des
individus sains ou non, par la régulation des gènes impliqués dans la synthèse et l’oxydation
des AG (figure 1-7)143, 155-157. De plus, les AGPI ont aussi montré des effets sur la régulation
de la pression artérielle qui est un des paramètres dans la définition du MetS143, 146, 158. Une
récente méta-analyse regroupant 36 études a aussi mis en avant une diminution de 27% du
risque de développement d’hypertension chez des individus consommant régulièrement du
poisson159.

Effet des acides gras polyinsaturés sur l’inflammation

Les AGPI ω-3 vont aussi pouvoir agir sur le développement de l’inflammation. L’une
de leur principale action, notamment pour le DHA et l’EPA, va être la réduction de la
synthèse d’eicosanoïdes à partir de l’acide arachidonique (ARA)160, 161. En effet, l’ARA
contenu dans les membranes cellulaires est le substrat majoritaire pour la production
d’eicosanoïdes comme les prostaglandines, les thromboxanes et les leucotriènes qui vont
pouvoir moduler l’intensité ou la durée de la réponse inflammatoire160, 161. En effet, elles sont
considérées comme de puissants médiateurs pro-inflammatoires permettant notamment la
production des cytokines IL-6 et TNF160. Or, le remplacement de l’ARA par le DHA ou

29
l’EPA, grâce à l’ingestion d’huile de poisson, va permettre la production d’eicosanoïdes
moins inflammatoires. De plus, les AGPI ω-3 sont des ligands naturels des PPARs qui, une
fois activées, vont pouvoir inhiber la production de molécules pro-inflammatoires160, 162. De
plus, il a aussi été démontré que l’activation du GPR-120 par le DHA ou l’EPA permettait
d’inhiber la voie pro-inflammatoire TNFα dans le tissu adipeux138.

Les poissons gras, et notamment le hareng, sont une source importante d’AGPI ω-3
qui assurent le bon fonctionnement du métabolisme. Ces molécules ont aussi des actions
bénéfiques et permettent de réduire les risques liés au développement du MetS. Cependant,
les études épidémiologiques faites sur les populations Arctiques, établissaient une corrélation
entre la consommation de poisson et la diminution de MCV ou du DT2. Comme le montre
la revue de littérature, le poisson est aussi composé d’autres molécules pouvant être
bénéfiques pour la santé humaine. Cela soulève l’hypothèse que d’autres composés actifs
sont présents dans le régime alimentaire de ces populations. En effet, les protéines de poisson
ont aussi été étudiées sur le développement de maladies cardiométaboliques. L’incorporation
de protéines de cabillaud dans la diète d’individus en surpoids permettait d’améliorer
significativement la sensibilité à l’insuline163. L’amélioration du métabolisme du glucose
ainsi qu’une diminution de la concentration en cholestérol LDL, étaient aussi enregistrés chez
des patients en surpoids supplémentés en protéines de cabillaud (500mg/jours)164. Cependant,
plusieurs études ont démontré que les peptides issus de d’hydrolysats étaient plus actifs que
les protéines mères5, 6, 165
. Ainsi, la recherche d’hydrolysats et de PB de poisson sur la
prévention du développement du MetS est en augmentation.

Hydrolysats et peptides de poisson actifs pour le syndrome

métabolique

Rôle des hydrolysats et des peptides bioactifs de poisson dans la

sensibilité à l’insuline

Les hydrolysats de poisson sont connus pour leurs diverses applications

(antioxydante, antimicrobienne, anticancer), mais depuis quelques années, des études ont
démontré leur utilisation potentielle pour la prévention du développement du MetS. En effet,
l’évolution a permis le développement d’une importante biodiversité des organismes marins

30
aux caractéristiques uniques pouvant présenter des propriétés bénéfiques sur la santé
humaine. Ainsi, différentes sources de protéines ont pu être identifiées pour la production
d’hydrolysats modulant la sensibilité à l’insuline (Tableau 1-5). Certains hydrolysats de
poisson permettent aussi la modulation de la prise de poids chez des rats soumis à une diète
HFHS, souvent accompagnée d’une réduction du tissu adipeux6, 7, 9, 10, 165
. Les auteurs
expliquent ces résultats non seulement par la présence de PB de satiété permettant la
diminution de la prise alimentaire, mais aussi par l’activation de l’oxydation des AG dans le
tissu adipeux viscéral par des PB6, 166. Liaset et al.166 ont rapporté que la taurine et la glycine,
comprises en forte concentration dans un hydrolysat de lieu noir, permettaient la production
d’acide biliaire menant à l’oxydation des AG.

Tableau 1-4 : Séquences peptidiques identifiées inhibitrices du DPP-IV dans des peaux de
poisson.NI : non indiqué.
Source des peaux de Masse IC50
Séquence Référence
poisson (Da) (µM)
IPGDPGPPGPPGP 919,53 65,4
Tilapia (Oreochromis
LPGERGRPGAPGP 1026,58 76,8
niloticus)
GPKGDRGLPGPPGRDGM 1358,76 89,6 Wang et
SPGSSGPQGFTG 862,32 101,6 al.171
Flétan (Hippoglossus
GPVGPAGNPGANGLN 1021,42 81,3
stenolepis)
PPGPTGPRGQPGNIGF 1261,44 146,7
Hatanaka et
Peau de poisson (NI) GPHyp NI 2510
al.173
Saumon de l'Atlantique GPAE 372,4 49,6 Li-Chan et
(Salmo salar) GPEA 300,4 41,9 al.174
PP NI 4343,48
GF NI 1547,15
Saumon de l'Atlantique GPVA NI 264,74 Neves et
(Salmo salar) GGPAGPAV NI 8139,11 al.172
R NI 110,44
Y NI 75,15

La sécrétion de l’insuline par le pancréas est aussi activée par la «glucagon-like-

peptide-1» (GLP-1) en réponse au glucose. Cependant, cette hormone peut être dégradée par
la dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV). Ainsi plusieurs inhibiteurs du DPP-IV ont été identifiés
dans des hydrolysats de poisson. Harnedy et al.170 ont montré qu’une seule dose d’hydrolysat

31
de merlan bleu (Micromesistius poutassou) chez des souris saines permettait l’amélioration
de la tolérance au glucose grâce à la stimulation de la production d’insuline. De plus, les
auteurs ont aussi évalué in vitro une augmentation de la sécrétion de GLP-1 et une inhibition
de DPP-IV (IC50 : 1,28mg/ml), révélant la présence de PB dans l’hydrolysat. Plusieurs
séquences peptidiques inhibitrices du DPP-IV ont pu être identifiées dans diverses sources
d’hydrolysats de poisson et notamment dans des peaux de poisson, riches en collagène
(Tableau 1-4). Wang et al.171 ont ainsi identifiés six séquences de deux hydrolysats différents.
De plus, les hydrolysats de peau de poisson d’eau chaude (Tilapia, Oreochromis niloticus)
montraient une activité inhibitrice plus importante que ceux d’eau froide (Flétan du
Pacifique, Hippoglossus stenolepis), révélant l’importance de la source protéique dans la
production de PB. Neves et al.172 ont aussi identifié plusieurs séquences peptidiques
inhibitrices du DPP-IV dans des hydrolysats de peau de saumon de l’Atlantique (Salmo
salar). Cependant, les auteurs ont aussi montré que les AA Arg et Tyr présentaient des
activités plus importantes seuls (IC50 de 110,44 et 75,15 µM respectivement) plutôt que les
séquences de plusieurs AA. Ainsi la présence de certains AA semble importante pour
l’activité inhibitrice du DPP-IV. Comme le montre le tableau 1-4, les séquences identifiées
présentaient souvent le motif Gly-Pro, répété plusieurs fois dans certains cas, et leur
placement en début ou fin de séquences montraient les activités les plus fortes.

Le tableau 1-5 présente plusieurs hydrolysats de poisson qui permettaient la

modulation du métabolisme du glucose, en diminuant sa concentration dans le plasma et en
améliorant sa tolérance chez des rats obèses 5, 7, 167, 168. Ces effets bénéfiques ont pu être mis
en relation avec une amélioration de la production ou la signalisation de l’insuline. Chevrier
et al.9 ont ainsi montré que le remplacement de 50% de caséine par un hydrolysat de saumon,
permettait l’inhibition de la voie mTORC1/S6K1/IRS et donc une meilleure signalisation de
l’insuline dans le foie. Les auteurs ont aussi mis en évidence une amélioration de la tolérance
au glucose chez les souris obèses ainsi qu’une augmentation de la captation du glucose in
vitro dans des cellules musculaires L6. La glycémie postprandiale est aussi modulée par les
enzymes de digestion des glucides. L’enzyme α-amylase va réduire les glucides en
oligosaccharides qui vont ensuite être digérés en maltose puis en glucose dans le tube digestif.
L’inhibition de cette enzyme a montré une diminution de l’absorption du glucose et donc une
diminution de la glycémie postprandiale chez les patients diabétiques169. Plusieurs études

32
évaluant l’effet hypoglycémique d’hydrolysats de poisson ont ainsi mesuré une inhibition de
l’activité de l’α-amylase, ceci pouvant expliquer la diminution de concentration de glucose
dans le plasma (Tableau 1-5)5, 7, 167, 168.

33
Tableau 1-5 : Études in vivo utilisant des hydrolysats de poisson sur l’évolution de paramètres impliqués dans le développement du MetS.
Source hydrolysat Protéine Modèle Diète Durée Dose Activité Référence
Plasma : ↓α-amylase activité,
lipase activité, Glc, HbA1c, TC,
Rat Wistar TG, LDLc ; ↑Ins, HDLc Ben Salma-
Poulpe (Octopus 400mg/
Muscle alloxenique NI 30 jours Foie : ↓TC, TG, LDLc ; ↑Gly Ben Salem et
vulgaris) kg
mâle al.5
↓ AUC oGTT
↓ AI
Poisson Gobi Plasma: ↓α-amylase activity, Glc
Rat Wistar 10 400mg/
(Zosterisessor Muscle HFHF Foie : ↓Gly, MDA ; ↑CAT, GPx, Nasri et al.7
mâle semaines kg
ophiocephalus) SOD, GSH
Plasma : ↓α-amylase activité,
Rat Wistar
Blennie-basilic 400mg/ lipase activité Glc, HbA1c, TC,
Muscle alloxenique Std 3 semaines Ktari et al.167
(Salaria basilisca) kg TG, LDLc ; ↑HDLc
mâle
Foie : ↓TC, TG, LDLc ; ↑HDLc
Plasma : ↓α-amylase activité, Glc,
TC, TG, LDLc, VLDLc ; ↑HDLc
Sardinelle Rat Wistar Hypercal 10 400mg/ Jemil et al.6,
Muscle Foie : ↓Gly, MDA ; ↑CAT, GPx, 168
(Sardinella sp.) mâle -orique semaines kg
SOD, TC, TG
↓AI, GPc
Merlan Bleu
Souris NIH 100mg/ Harnedy et
(Micromesistius Muscle NI 1 jour ↓ AUC oGTT ; ↑Ins
Swiss kg al.170
poutassou)
25% ↓GPc
Saumon de
Souris des Plasma : ↓TG ; ↑HDLc, PHl
l'Atlantique (Salmo Muscle HF 6 semaines Vik et al.10
C57BL/6J protéine Foie : ↓ fatty acid synthase, TG,
salar)
s AGMI ; ↑PHl, AGPI ω-3
Plasma : ↓TC, TG, LDLc, VLDLc
Poisson Gobi ; ↑HDLc
Rat Wistar 10 400mg/
(Zosterisessor Muscle HFHF Nasri et al.165
mâle semaines ml Foie : ↓TC, TG
ophiocephalus)
↓AI, GPc

34
Tableau 1-5 : Études in vivo utilisant des hydrolysats de poisson sur l’évolution de paramètres impliqués dans le développement du MetS
(suite).
Source hydrolysat Protéine Modèle Diète Durée Dose Activité Référence
Hareng de
l'Atlantique (Clupea 25% ↑ GPc
AIN-
harengus) et Co- Rat Zuker des Plasma : ↑TG, AGMI ; ↓LDLc, Drotningsvik
93G 4 semaines
saumon de produits fa/fa mâle protéine HDLc, AGPI ω-6 et al.70
diète
l'Atlantique (Salmo s Tissu adipeux : AGPI ω-3
salar) (seulement pour le saumon)
↓GPc, AUC oGTT
50%
Saumon de Plasma : ↓TG, glycérol, NEFA
Co- Souris LDLr-/- 12 des Chevrier et
semaines protéine Tissu adipeux : ↓IL-1β, IL-6, IL-
l'Atlantique (Salmo HF
produits /ApoB100/100 al.9
salar) 12, TNFα, TNFγ
s
Foie : ↓mTORC1/S6K1/IRS1
Saumon du Plasma : ↓ Glc à jeun, MDA,
Pacifique Rat SD mâle + TNFα ; ↑SOD, GSH
Peau HF 4 semaines 3g/kg Zhu et al.175
(Oncorhynchus STZ
Pancréas : ↓ apoptose
kern)
Tilapia Rat Sprague- 5012- ↓AUC oGTT
750mg/
(Oreochromis Peau Dawley mâle Rat 30 jours Plasma : ↓DPP-IV activité ; ↑ Wang et al.171
kg
niloticus) + STZ Diète GLP-1, Ins
100% ↓GPc, eWAT
Saumon de
Rats Wistar des Tissu adipeux : ↓IL-6, TNFα
l'Atlantique (Salmo NI HF 4 semaines Pilon et al.73
salar)
mâle protéine Plasma : ↑taux d’infusion du
s glucose
↓ : Diminution, ↑ : augmentation, AI : indice athérogène, AUC : air sous la courbe, CAT : catalase, eWAT : tissu adipeux epididymal. Glc : glucose, Ins :
insuline, Gly : glycogène, GPc : gain de poids corporel, GPx : glutathion peroxydase, GSH : glutathion réductase, HF : riche en gras, HFHF : riche en gras
et en fructose, MDA : malondialdéhyde, NI : non indiqué, oGTT : test de tolérance du glucose par voie orale, PHl : phospholipide, SOD : superoxyde
dismutase, Std : standard, TC : total cholestérol, TG : total triglycéride.

35
 Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson cardioprotecteurs

La dyslipidémie est un paramètre important dans le développement de MCV qui est

reconnue comme un facteur de risque pour les patients atteints de MetS. Des hydrolysats de
poisson ont montré des habilités à réduire les TG et TC dans le foie et le plasma de modèles
murins obèses (Tableau 1-5). De plus, la diminution de cholesterol LDL, VLDL et
l’augmentation de HDLc ont aussi été rapportés par différentes études (Tableau 1-5). Tous
les mécanismes d’actions des PB de poisson sur la dyslipidémie ne sont pas encore connus,
mais quelques études ont pu en identifier. Vik et al.10 ont montré que le remplacement de
25% des protéines par différents hydrolysats de saumon chez des souris obèses modulait le
métabolisme des lipides dans le plasma et le foie. La réduction des TG serait expliquée par
la répression de la lipogenèse (baisse de l’expression des gènes Fas et Acaca) et par
l’activation de l’oxydation des AG (augmentation de l’activité CPT-1)10. La modulation des
TG a aussi été enregistrée avec l’utilisation d’un hydrolysat de lieu noir qui permettait la
production d’acide biliaire chez des rats, induisant ainsi l’oxydation des AG166. Ainsi,
plusieurs auteurs ont montré que l’amélioration de la dyslipidémie chez des modèles murins
obèses permettait une diminution de l’indice athérogène (ratio TG/HDL), et donc une
diminution du risque de MCV5, 6, 165.

De plus, des hydrolysats de poisson ont aussi montré des effets sur la pression
artérielle notamment par l’inhibition de l’enzyme convertissant l'angiotensine I (ACE,
«angiotensin-converting-enzyme»). L’ACE est une enzyme cruciale dans la régulation de la
pression artérielle périphérique. Elle permet la conversion de l’angiotensine I en octapeptide,
vasoconstricteur très puissant, l’angiotensine II. Son inhibition permet la vasodilatation
(hypotensive) des vaisseaux, et donc la diminution de la pression artérielle (figure 1-8). De
plus l’ACE agit aussi sur la dégradation de la bradykinine, un peptide permettant la réduction
de la pression sanguine176. Des inhibiteurs de l’ACE ont été isolés dans différents hydrolysats
de poisson : thon (Thunnus sp), saumon (Salmo salar), seiche (Sepia officinalis), bonite
(Scombridae sp), sardine (Sardina pilchardus) et colin d’Alaska (Theragra
chalcogramma)63, 177-182
. Nasri et al.183 ont mesuré dans un hydrolysat de gobie
(Zosterissessor ophiocephalus), un important pourcentage d’acides aminés aliphatiques
(isoleucine, leucine, méthionine) qui seraient impliqués dans l’activité inhibitrice de l’ACE.

36
Les études ont ainsi montré l’influence de la composition en AA des peptides inhibiteurs sur
leur interaction avec les sites actifs de l’ACE184, 185
. Ainsi l’activité inhibitrice de tri-
dipeptides était liée à la présence de tryptophane, phénylalanine, tyrosine ou proline en
position C-terminal et d’AA branchés en position N-terminal185. La taille du peptide est
également un paramètre important dans l’activité inhibitrice de l’ACE. Ainsi, les peptides de
faibles poids moléculaires (di ou tripeptides) pourraient se lier plus facilement avec le site
actif de l’enzyme, le rendant inaccessible184, 186.

Figure 1-8 : Mécanismes d’action de l’enzyme convertissant l'angiotensin sur la régulation de la

pression sanguine (Tiré de Li et al., 2004)176

Des études in vivo ont aussi été menées afin d’évaluer l’activité antihypertensive de
différents hydrolysats de poisson. La supplémentation du peptide Met-Ile-Phe-Pro-Gly-Ala-
Gly-Gly-Pro-Glu-Leu (à 10mg/kg) provenant d’un hydrolysat de sole jaune (Limanda
aspera) chez des rats présentant une hypertension, permettait une réduction de 11% de la
pression artérielle. De plus, cet effet était maintenu pendant toute l’expérience (9h) et était
similaire au contrôle chimique (Captopril®)187. Des résultats similaires ont aussi été obtenus
avec un peptide (Gly-Leu-Pro) de peau de saumon du Pacifique (Oncorhynchus keta) et de
thon (Thunnus sp) (Gly-Asp-Leu-Gly-Lys-Thr-Thr-Thr-Val-Ser-Asn-Trp-Ser-Pro-ProLys-
Try-Lys-Asp-Thr-Pro) chez des rats hypertendus à une dose de 20mg/kg et 10mg/kg
respectivement180, 188. De plus, dans toutes ces études, une unique dose a été administrée aux
rats, montrant l’efficacité des peptides de poisson. Une étude chez des individus présentant

37
de l’hypertension a montré que l’administration d’un peptide d’hydrolysat de sardine
(Sardina pilchardus) (Val-Tyr, 3mg/100g de boisson), permettait la diminution significative
de la pression artérielle systolique et diastolique ainsi que l’augmentation de l’angiotensine
I dans le plasma189.

Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson anti-inflammatoires

Le développement du MetS est accompagné d’une inflammation chronique. Un

hydrolysat de saumon du Pacifique (Oncorhynchus keta) a montré une inhibition in vitro de
la production d’oxyde nitrique (NO) ainsi que de molécules pro-inflammatoire (TNFα et IL6)
dans des macrophages stimulés par LPS190. Cette réaction anti-inflammatoire était dose
répondante, avec une inhibition maximale à 500µg/ml (réduction de 66%, 68% et 85% des
concentrations de NO, TNFα et IL6 respectivement). De plus, l’expression des gènes codant
pour la protéine iNOS et des cytokines TNFα et IL6 étaient aussi réduit par l’hydrolysat de
saumon190. Cet effet anti-inflammatoire était aussi observé par la réduction d’un œdème
induit par l’injection de carraghénane dans la patte de souris supplémentées pendant 14 jours
avec l’hydrolysat (300mg/kg)190. L’activité anti-inflammatoire a aussi été mesurée dans
différents hydrolysats de poisson. Un hydrolysat de co-produits de poisson plat présentait un
effet anti-inflammatoire de manière dose répondante (de 50 à 200µg/ml) dans des
macrophages stimulés par LPS. Comme pour l’étude précédente, l’hydrolysat induisait une
diminution de la production de NO et des cytokines TNFα, IL6, ainsi qu’une réduction de
l’expression des gènes codant pour les protéines iNOS et COX2. Ces effets anti-
inflammatoires étaient en partie dû à la suppression de la voie de signalisation NF-κB191. Des
résultats similaires ont aussi pu être observés sur des cellules humaines (kératinocyte,
ostéoblaste et chondrocyte) grâce à l’utilisation d’un hydrolysat de collagène de poisson et
d’hippocampe (Hippocampus kuda)192, 193. Hirose et al.194 ont aussi enregistré une diminution
de l’expression des gènes TNFα et IL6, associée à une réduction de l’infiltration de
macrophages M1 dans le tissu adipeux de souris obèse (diète HFHS) supplémentées par un
hydrolysat de saumon. L’infiltration des macrophages de type M1 dans le tissu adipeux est
un paramètre important dans le développement de l’inflammation chronique chez les patients
atteints de MetS. Chevrier et al.9 ont aussi enregistré une diminution de l’infiltration de
macrophages dans le tissu adipeux de souris LDLr-/-/ApoB100/100 grâce à l’incorporation

38
d’hydrolysat de saumon dans la diète (Tableau 1-5). De plus, une diminution des cytokines
IL1β, IL6, IL12, TNFα et TNFγ était aussi enregistrée dans le tissu adipeux viscéral. Les
auteurs expliquaient ces résultats par la présence de PB de faible poids moléculaires. Des
conclusions similaires ont été reportées dans une étude chez des rats Wistar nourris avec une
diète obésogène contenant des hydrolysats de différents poissons. Ainsi les auteurs
enregistraient une diminution des cytokines IL6 et TNFα dans le tissu adipeux des groupes
nourris avec un hydrolysat de maquereau, de hareng, de saumon et de bonite. Cependant,
seul l’hydrolysat de saumon permettait une réduction de la prise de poids des rats ainsi que
l’inhibition de l’activation de l’enzyme iNOS dans des macrophages stimulés par LPS73.

Hydrolysats et peptides bioactifs de poisson antioxydants

La génération de ROS entraîne un stress oxydatif chez les cellules qui vont alors se
protéger grâce à l’action d’antioxydants (enzymatiques ou non)25. Cette réaction peut être
initiée suite à une maladie (diabète, cancer), à un environnement stressant (polluants), ou à
la dégradation des lipides (peroxydation)25, 195. En effet, la production de ROS va être la
première cause de la peroxydation des lipides membranaires et de la formation de
malondialdéhyde (MDA). Les membranes cellulaires vont alors être plus perméables, et des
transporteurs membranaires vont être inactivés par le MDA196. Pour maintenir leurs fonctions
vitales, les cellules vont produire des molécules antioxydantes comme la catalase (CAT), la
superoxyde dismutase (SOD), la glutathion péroxydase (GPx) et la glutathion réductase. Il a
ainsi été montré que les personnes obèses présentaient des concentrations en enzymes
antioxydantes (CAT, SOD, GPx) plus faibles que les personnes minces196.

Les peptides antioxydants peuvent présenter plusieurs actions pour réduire le stress
oxydant. Ainsi, pour déterminer la capacité antioxydante d’un hydrolysat, il est généralement
nécessaire d’analyser plusieurs systèmes radicaux suivant l’action recherchée, comme le
1,1dephenyl-2pircyk hydrazyl (DPPH) «free scavenging, hydroxyl radical scavenging», et
les substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS, «thiobarbituric acid reactive
substances»)63. Par exemple, dans leur étude, Bougatef et al.197 ont étudié la capacité
antioxydante d’un hydrolysat de sardinelle (Sardinella aurita) sur trois tests différents : (i) le
DPPH qui mesure l’habilité d’une substance antioxydante à donner un proton afin de réduire
le radical ; (ii) l’inhibition de l’oxydation de l’acide linoléique (peroxydation) et (iii) le

39
pouvoir réducteur qui mesure l’habilité d’un antioxydant à donner un électron ou un
hydrogène afin de chélater le Fe3+ en Fe2+. Ainsi les auteurs ont identifié cinq séquences
peptidiques présentant des capacités de réduction du DPPH : Leu-Ala-Arg-Leu, Gly-Gly-
Glu, Leu-His-Tyr, Gly-Ala-Trp-Ala et Gly-Ala-Leu-Ala-Ala-His. De plus les séquences
contenant un résidu His présentaient les plus fortes activités, expliquées par la capacité de
chélation et de piégeage des radicaux par le noyau imidazole de cet acide aminé197. En effet,
l’activité antioxydante des peptides est dépendante de leur séquence en AA. Ainsi, Girgih et
al.198 ont reporté une augmentation des valeurs de DPPH et d’ORAC (capacité d'absorption
des radicaux oxygénés, oxygen radical absorbance capacity) avec l’utilisation de fractions
peptidiques issus d’un hydrolysat de cabillaud (Gadus morhua) contenant des AA
hydrophobes et capables de donner des électrons (AA chargés négativement). De plus,
certains acides aminés peuvent aussi directement éliminer les ROS dans le milieu, comme
l’arginine, la citrulline, la glycine, la taurine et l’histidine199. Des études in vivo ont aussi
montré l’action bénéfique d’hydrolysats de poisson sur le stress oxydatif de rats obèses7, 200.
Nasri et al.7 ont mesuré une augmentation des activités enzymatiques de la CAT, SOD et
GPx, et la réduction du taux de MDA chez des rats nourris avec une diète HFHS supplémenté
en hydrolysat de poisson Gobi (Zosterisessor ophiocephalus) (Tableau 1-5).

Ainsi, les AGPI et les PB de poisson ont démontré des effets bénéfiques sur le
développement du MetS par différentes actions (diminution de la résistance à l’insuline, de
l’inflammation, du stress oxydant, de la dyslipidémie et des MCV). Bien que les huiles de
poisson purifiées puissent être directement administrées, la production de PB nécessite une
étape de fractionnement et de concentration. En effet, leurs activités biologiques sont
dépendantes de leur composition en AA et de leur PM12.

Procédés de séparation et de purification des hydrolysats

de poisson
Les hydrolysats de poisson sont des mélanges complexes, contenant de nombreux PB
différents, nécessitant une étape de concentration et de purification25. Les deux techniques
majoritairement utilisées, seront présentées dans cette section ainsi que leurs avantages et
inconvénients. De plus, la technique de l’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration

40
 (EDUF), utilisée au sein du laboratoire du Dr Laurent Bazinet pour le fractionnement
d’hydrolysats, sera présentée, ainsi que son application pour la production de PB.

Deux techniques majoritaires : chromatographiques et baro-

membranaires

Les techniques chromatographiques

Les méthodes chromatographiques séparent les composés d’un mélange par

entraînement, au moyen d’une phase mobile (liquide ou gaz) et d’une phase stationnaire
(solide ou liquide). Ces techniques utilisent les propriétés physico-chimiques des solutés,
ainsi que leur affinité avec la phase mobile et/ou stationnaire. De ce fait, les molécules
interagissant avec la phase stationnaire seront donc les dernières éluées et inversement, celles
ayant le plus d’interactions avec la phase mobile seront les premières éluées. Ainsi, un certain
nombre de techniques chromatographiques ont pu être développées pour la séparation
d’hydrolysat, en s’appuyant sur les propriétés d’interactions entre les peptides et les éluants.
De nos jours, il existe trois grandes familles de séparation peptidique par chromatographie :

• Séparation suivant le PM des peptides : la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)195.

La phase stationnaire est un milieu composé de billes sphériques possédant des pores de
tailles spécifiques. Les peptides plus petits (faible PM) vont diffuser à l’intérieur des pores
et seront donc retenus plus longtemps dans la phase, pour être élués et détectés en UV-visible
en dernier. Alors que les gros peptides (haut PM) vont pouvoir traverser la phase plus
rapidement et être détectés en premiers. De nombreuses colonnes existent suivant les tailles
des molécules à séparer. Les plus utilisées pour les PB marins sont la Superdex Peptide HR
10/30 (Pharmacia, gamme de séparation de 7000 à 100Da)201 et la Séphadex G-25195.
Cependant, cette technique ne permet pas une séparation efficace des peptides de faible PM,
elle reste principalement utilisée pour analyser les profils de poids moléculaires201.
• Séparation suivant la charge des peptides : la chromatographie échangeuse d’ions58. Comme
son nom l’indique, il s’agit d’un échange entre la partie chargée du composé à séparer et celle
de la phase stationnaire. Cette dernière est souvent sous forme de résine, (dextran, cellulose
ou acrylamide) à laquelle sont greffées des molécules chargées négativement (échangeuse à

41
 cations, groupe sulfopropyle et carboxyle) ou positivement (échangeuse à anions, dérivés
d’amines).
• Séparation suivant la polarité des peptides : la chromatographie en phase liquide à haute
performance (HPLC), la chromatographie en phase liquide à ultra performance (UPLC) et la
chromatographie en phase liquide rapide des protéines (FPLC)58, 177. Ces méthodes reposent
sur les mêmes principes, mais diffèrent suivant leur résolution et leur capacité de traitement.
En phase normale, la phase stationnaire est formée d’un gel de silice très polaire, la phase
mobile sera donc un éluant apolaire. Les peptides polaires seront donc élués et détectés en
derniers. Au contraire, en phase inverse (RP-HPLC), des chaînes linéaires de carbones
apolaires sont greffés au gel de silice, la phase mobile sera donc dans ce cas, un éluant polaire.
Ces techniques sont très utilisées du fait de leur efficacité de séparation, ainsi que pour la
production et l’identification de PB marins.

Ainsi, suivant les différentes techniques utilisées, les PB présents dans un hydrolysat
complexe vont pouvoir être séparés sélectivement suivant leurs paramètres physiques ou
chimiques. Cependant, malgré leur haute performance, les techniques chromatographiques
restent très peu utilisées en industries agroalimentaire, dû notamment au faible volume
d’injection possible et à leur coût élevé. De plus, l’utilisation de solvants (chloroforme,
acétone, éthanol, méthanol, benzène, dichlorométhane etc.) comme éluant pour les
techniques HPLC ou pour le renouvèlement des résines pour les méthodes de
chromatographies échangeuses d’ions, est aussi un frein pour leur utilisation (Tableau 1-6).
Cependant les techniques chromatographiques sont largement utilisées comme procédés de
pré-traitement pour l’identification des séquences peptidiques de PB.

Les techniques baro-membranaires

Les techniques baro-membranaires séparent les composés d’un mélange suivant leur
PM, grâce à l’utilisation de membranes de filtration et d’une force motrice (pression ou/et
charge)202. Suivant les PM des molécules filtrées et la force motrice, quatre classes de
filtrations baro-membranaires peuvent être utilisées (figure 1-9) :

• La microfiltration : est principalement utilisée dans l’industrie comme pré-traitement pour

les filtrations subséquentes, afin de retirer les particules de haute taille (> 0.1µm). La pression

42
 est utilisée comme force motrice afin de séparer les molécules par l’utilisation de membranes
poreuses. Les tailles des pores des membranes varient entre 1 et 10µm203.
• L’ultrafiltration (UF) : est une technique largement utilisée dans l’industrie agroalimentaire,
et notamment laitière pour la concentration de composés. Comme pour la microfiltration, la
pression est utilisée pour faire circuler des composés à travers des membranes poreuses (entre
1 et 50nm). L’UF va être principalement utilisée pour enrichir en PB des hydrolysats
protéiques203.
• La nanofiltration (NF) : est une méthode très utilisée pour la séparation de PB issu
d’hydrolysats complexes. En effet, contrairement à l’UF et la microfiltration, la séparation
des composés lors de la NF va être régulée par leur taille mais aussi par des répulsions
électrostatiques avec la membrane203.
• L’osmose inverse : contrairement aux méthodes précédentes, l’osmose inverse utilise des
membranes sélectives perméables seulement à l’eau. Ainsi, les composés vont être séparer
par diffusion. L’osmose inverse est donc utilisée principalement dans les domaines de
traitement des eaux et de concentration de produits.

Figure 1-9 : Les différentes membranes utilisées en filtration baro-membranaire (d'après Bazinet et
Firdaous203).

Ainsi, les techniques d’UF et NF sont principalement utilisées pour la production de

PB. Plusieurs études ont montré l’efficacité de ces méthodes pour le fractionnement et/ou la
concentration de PB issus d’hydrolysats de poisson76, 202, 203. Bourseau et al.11 ont étudié la

43
séparation et la concentration de PB de deux hydrolysats de cabillaud différents (Prolastin et
MariPepC) par UF (4000Da) et NF (300Da). Les profils des PM des peptides obtenus étaient
dépendant des membranes utilisées pour le fractionnement. Ainsi, les plus petits peptides
(PM< 300Da) étaient retrouvés dans le perméat de la NF, alors que le retentât d’UF contenait
des peptides aux PM supérieurs à 750Da. Cependant, le PM moyen de la population initiale
de peptides dans l’hydrolysat, est un facteur important dans le choix des membranes. Ainsi,
les auteurs préconisaient que le seuil de coupure des membranes devait être choisi entre le
PM le plus abondant et le PM du plus gros peptide présent, afin d’avoir une meilleure
sélection. De plus, le matériau des membranes est aussi un paramètre important pour la
séparation sélective de PB : polytetrafluoroéthylène, polyéthersulfone (PES), polysulfone,
polyvinylidène fluoride (PVDF), acétate de cellulose (CA). En effet, sur la séparation d’un
hydrolysat de cabillaud, Picot et al.12 ont montré que la séparation de PB suivant leur taille
était difficile pour certaines classes de PM proches. De plus, les auteurs enregistraient une
augmentation de l’activité biologique CGRP-like (Calcitonin gene-related peptide receptor)
dans les fractions de perméat d’UF (10 fois supérieur à l’hydrolysat initial). Pour les activités
antioxydantes aucun changement n’a été enregistré, celles-ci étant plus dépendantes de la
séquence en AA des peptides que de leur PM. Les auteurs préconisaient donc la sélection de
membrane ayant une sélectivité aux groupements aromatiques12.

De plus, les techniques baro-membranaires sont confrontées aux phénomènes de

polarisation de concentration et de colmatage qui vont réduire la performance des traitements
(résistance, diminution de la sélectivité, Tableau 1-6), augmenter leur demande en énergie et
apporter des coûts de nettoyage des membranes. Brièvement, les larges molécules vont être
rejetées et leur diffusion au sein de la membrane étant plus lente, cela va créer une
accumulation de composés à la surface des membranes204. Une différence de concentration
va alors se créer à la surface des membranes, il s’agit de la polarisation de concentration qui
est l’étape initiale pour la formation du colmatage204. Alors que la polarisation de
concentration est un phénomène réversible, le colmatage lui est défini comme irréversible.
Le colmatage va pouvoir se développer à la surface de la membrane (colmatage externe)
et/ou directement à l’intérieur des pores (colmatage interne)204. Bourseau et al.11 ont montré
une baisse du flux de filtration pour les deux membranes (UF : 100 à 20 Lm-2 h-1, NF : 120 à

44
 8 Lm-2 h-1). Les auteurs l’expliquaient par l’augmentation de la pression osmotique et de la
résistance hydraulique au niveau de la couche limite, dû à la présence de colmatage.

Tableau 1-6 : Avantages et inconvénients des méthodes chromatographiques et bora-membranaires.

Techniques chromatographiques Techniques baro-membranaires

Grand volume de traitement

Avantages Haute sélectivité
Faibles coûts
Utilisation de solvant
Colmatage
Inconvénients Faible quantité de traitement
Diminution de la sélectivité
Coûts importants

L’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration

Principe de l’électrodialyse

L’électrodialyse (ED) est un procédé de séparation électrochimique, dans lequel les

composés chargés sont séparés suivant leur charge, par application d’un champs
électrique205. Il fait intervenir deux d’électrodes (anode et cathode) grâce auxquelles les
charges électriques vont circuler via des membranes échangeuses d’ions (MEI) de
permsélectivités différentes. Ainsi deux familles de MEI sont utilisées dans l’ED :
• Les membranes échangeuses d’anions (MEA), chargées positivement, vont permettre le
passage des espèces chargées négativement (anions).
• Les membranes échangeuses de cations (MEC), chargées négativement, vont permettre le
passage des espèces chargées positivement (cations).

45
Figure 1-10 : Schéma d'électrodialyse conventionnelle (d’après Strathmann, 2010)206

En ED conventionnelle, les membranes vont être empilées dans des cellules puis
répétées (figure 1-10). Deux types de transports vont majoritairement avoir lieu lors de l’ED.
L’électromigration des ions qui est dû à l’application d’un courant électrique. Les charges
vont donc être attirées par l’électrode de charge opposée. Ainsi les cations vont traverser le
compartiment en direction de la cathode chargée négativement et à contrario, les anions vont
traverser le compartiment en direction de l’anode chargée positivement. Des compartiments
vont donc être enrichis en espèces ioniques (les concentrats), alors que d’autres vont en être
appauvris (les diluats) (figure 1-10)206. Le second transport est la diffusion dû à la mise en
place d’un gradient de concentration aux interfaces des MEIs.

Cependant, l’ED peut être limitée par deux phénomènes : la concentration de

polarisation et la densité de courant limite. Au sein d’une MEI, le nombre de transport des
contre-ions est proche de 1 et celui des co-ions est proche de 0, alors que dans la solution
diluée/concentrée ces valeurs sont plutôt identiques206. Cette différence de concentration
entre la membrane et les solutions, forme des gradients de concentrations au niveau de
l’interface de la membrane/solution, nommé couche limite (δ)205. Afin de maintenir un
courant constant, la migration ionique va se faire rapidement, et donc la concentration de
contre-ion sera plus faible au sein de cette couche limite (figure 1-11)205, 206. La concentration
de polarisation mène à l’accumulation d’ion à la surface de la membrane du compartiment
concentré. Inversement, cela mène à l’épuisement d’ions du compartiment dilué, jusqu’à

46
atteindre une valeur proche de 0 à la surface de la membrane, cela détermine la densité du
courant limite205, 206
. Afin de maintenir le courant, il se produira une dissociation des
molécules d’eau en H+ et OH- au niveau de la couche limite205. Le transport d’ions entre les
solutions diluées et concentrées va alors tendre vers 0.

Figure 1-11 : Formation de gradients de concentration en électrodialyse (d’après Bazinet, 2004)205

L’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration

1.3.2.2.1 Un procédé sélectif et polyvalent

Comme nous avons pu le voir précédemment, les techniques conventionnelles de

fractionnement et de concentration de PB, comme les procédés baro-membranaires ou
chromatographiques, présentent des avantages mais aussi des inconvénients (Tableau 1-6).
Le développement de nouvelles techniques de fractionnement et de concentration est donc
devenu un enjeu économique majeur dans la production de PB. Dans ce contexte,
l’ElectroDialyse avec membranes d’UltraFiltrations (EDUF), processus hautement sélectif
et écologique, représente une nouvelle alternative dans le fractionnement d’hydrolysats
complexes. Ce procédé a été développé et breveté par le Dr. Bazinet13 en 2005. Cette méthode
va permettre une double sélection des composés suivant leur taille, grâce à l’utilisation de
membranes d’ultrafiltrations de seuils de coupure différents et suivant leur charge, grâce à
l’utilisation d’un champ électrique13, 202. L’un des avantages de l’EDUF est sa polyvalence.

47
En effet, suivant la charge et la taille du composé, les membranes d’ultrafiltration vont
pouvoir être adaptées mais aussi modulées au sein de la cellule d’électrodialyse. Ainsi
différentes configurations sont possibles suivant les caractéristiques des PB à séparer (figure
1-12).

Ainsi, il va être possible de récupérer seulement les peptides cationiques et/ou

anioniques au sein d’un même module. De plus, plusieurs membranes d’UF peuvent être
utilisés afin d’affiner la séparation des peptides suivant leurs PM. Dans leur étude, Suwal et
al.19 ont utilisé deux membranes d’UF successives (50kDa puis 20kDa) pour la séparation de
peptides anioniques d’un hydrolysat de crabe des neiges (Chionoecetes opilio). L’utilisation
de cette nouvelle configuration permettait la séparation des peptides en deux classes de PM.

Figure 1-12 : Configurations possibles d'EDUF pour la récupération A) des peptides anioniques, B)
des peptides cationiques et C) des peptides anioniques et cationiques simultanément (d'après Poulin
et al.,2006 et Firdaous et al., 2009)207, 208

48
 1.3.2.2.2 Les paramètres d’influences lors de l’électrodialyse avec membranes
d’ultrafiltration

L’EDUF est un procédé de séparation réunissant les méthodes de filtration par

l’utilisation d’UF, et l’ED par l’application d’un courant électrique. Ainsi, plusieurs
paramètres vont influencer la migration des peptides chargés.

Le champ électrique
La migration des peptides chargés lors de l’EDUF est dépendante de leur mobilité
électrophorétique (masse/charge). Ainsi l’intensité du courant impacte directement leur
migration. Poulin et al.210 ont observé que l’augmentation du taux de migration peptidique
était proportionnelle à celle de la force du champ électrique. Ainsi en doublant la force du
champ électrique (de 2,75 à 5,5 V/cm), le transport de peptides au sein de l’EDUF a augmenté
de 3,1 à 6,86g/m2. Les auteurs enregistraient donc un maximum de migration (11.23g/m2) de
peptides cationiques avec une force de champ électrique de 11V/cm.

Le pH
Le pH est un paramètre majeur pour la migration de composés chargés. En effet,
quand le pH de la solution est supérieur au point isoélectrique (pI) de la molécule, cette
dernière sera alors chargée négativement et inversement, quand le pH est inférieur au pI, elle
sera chargée positivement. Ainsi lors de la séparation par EDUF, l’intervention du pH va
pouvoir moduler la migration des peptides. Doyen et al.14 ont montré que le taux de
récupération pour le compartiment anionique était plus important à un pH basique de 9, alors
que le compartiment cationique montrait un taux de récupération plus important à un pH
acide de 3 ou neutre de 6. Cependant, la composition initiale en peptide de l’hydrolysat est
un paramètre important. En effet, les auteurs ont aussi démontré que l’hydrolysat initial de
crabe des neiges séparé par EDUF, était composé de peptides anioniques14. Roblet et al.211
n’enregistraient pas d’augmentation de migration des peptides anioniques avec
l’augmentation du pH lors de la séparation d’un hydrolysat de soja (Glycine max). Les auteurs
expliquaient ce résultat en partie par la population de peptides cationiques plus importante
dans l’hydrolysat initial.

49
 De plus, l’ajustement constant du pH en EDUF va permettre une migration constante
des peptides. En effet, Poulin et al.210 ont montré qu’une fluctuation importante du pH au
sein des compartiments de récupération, pouvait entraîner dans un premier temps, la mise en
place d’un plateau de migration, puis une rétro-migration des peptides vers le compartiment
d’alimentation. Ce phénomène s’explique par les paramètres physico-chimiques des
molécules. Par exemple, quand les peptides cationiques, chargés positivement, vont migrer
vers la cathode, une fois dans le compartiment de récupération, si le pH est au-dessus de leur
pI, ils vont alors pouvoir se charger négativement et migrer vers l’anode. Ainsi, les récentes
études analysant la séparation de PB par EDUF maintenaient le pH des compartiments de
récupération constant afin d’obtenir une migration linéaire14, 16, 17, 212.

La concentration des solutions d’alimentation et de récupération

La composition initiale de l’hydrolysat est un paramètre important pour la séparation
de PB par EDUF, mais sa concentration va aussi impacter sur la migration peptidique. Il a
ainsi été montré qu’une concentration plus importante dans le compartiment initial permet
un taux de migration supérieur dans les compartiments anioniques et cationiques213.
Cependant, la population de l’hydrolysat initial va aussi influencer cette migration. Ainsi, il
a été montré qu’un hydrolysat de crabe des neiges présentait une population de peptides
cationiques plus importante à pH 6 et que sa séparation par EDUF entraînait donc un taux de
migration supérieur dans le compartiment cationique14, 213.

Afin de maintenir une force de champ électrique lors de l’EDUF, la force ionique des
compartiments de récupération va être essentielle. Ainsi, des solutions de chlorure de
potassium (KCl) sont utilisées. Suwal et al.214 ont ainsi montré que l’augmentation de la force
ionique des compartiments de récupération n’impactait pas sur le taux de migration des
peptides d’un hydrolysat de crabe des neiges, mais qu’elle influençait sur la sélectivité des
composés. Ainsi, les auteurs ont mis en évidence que l’utilisation d’une force ionique
importante (5g/l), permettait la concentration en composés cationiques de faibles PM (300-
400Da) dans le compartiment de récupération. En effet, les ions Cl- interagissaient avec la
membrane d’UF en PES, augmentant sa charge négative et donc favorisant le passage des
molécules cationiques214.

50
 Les caractéristiques des membranes
Comme pour les techniques baro-membranaires, les caractéristiques physiques et
chimiques des membranes vont être importantes pour la sélection des PB lors de l’EDUF.
Tout d’abord, le seuil de coupure des UFs va déterminer le PM des peptides récupérés.
Cependant, contrairement aux procédés baro-membranaires utilisant la pression comme force
motrice, en EDUF les composés chargés sont séparés grâce à l’application d’un champ
électrique. Ainsi, pour le même PM, le seuil de coupure des UF en EDUF sera supérieur à
celui des UF en filtration baro-membranaire. Bargeman et al.209 ont ainsi montré que le seuil
de coupure minimal devait être trois fois supérieur au PM de la molécule à séparer afin
d’empêcher les frottements. Les auteurs ont donc mesuré une meilleure migration du peptide
αs2-caséine fragment (183-207) en utilisant des membranes d’UFs de 25kDa et 100kDa.

De plus le matériau utilisé pour les UF va aussi impacter la séparation des PB. Doyen
et al.215 ont montré que l’utilisation de deux membranes d’UF de même seuil de coupure
(20kDa) mais de matériaux différents (CA ou PES), n’influençait pas le taux de migration
peptidique d’un hydrolysat de crabe des neiges, mais influençait la sélectivité des peptides.
En effet, seulement la membrane CA permettait la migration de peptides de hauts PM (>
900Da). Des interactions électrostatiques ou hydrophobes vont ainsi moduler la séparation
des PB en EDUF. En effet, si la membrane et le composé présentent la même charge, une
répulsion va alors avoir lieu216. Le pH de la solution impacte aussi sur la charge de la
membrane. Roblet et al.211 montraient qu’à un pH basique les membranes d’UFs en PES,
étaient principalement chargées négativement, augmentant les répulsions électrostatiques
avec les peptides majoritairement cationiques.

Le colmatage membranaire
Le colmatage est un phénomène connu et important dans les procédés de
fractionnement membranaire. Comme précédemment présenté, les techniques baro-
membranaires vont engendrer du colmatage sur les membranes d’UF dû à l’application d’une
pression. L’utilisation du courant électrique comme force motrice en EDUF va permettre de
réduire l’impact du colmatage des membranes. Des interactions électrostatiques peptide-UF
vont pouvoir avoir lieu en EDUF, mais elles n’impactent pas le taux de migration des

51
 composés211, 214
. Plusieurs études ont ainsi démontré que la séparation d’hydrolysats
complexes par EDUF n’engendrait pas de colmatage des UFs15-17, 212.

Cependant, les MEIs étant des membranes chargées, vont être plus sujettes au
colmatage qui va pouvoir être de différentes natures :
• Colloïdale : les colloïdes sont des agglomérations de particules solides en suspension dans le
milieu. Il peut s’agir de minéraux argileux, silice colloïdale, oxyde de fer, oxyde
d'aluminium, oxyde de manganèse ou colloïdes organiques217. Ils vont présenter une charge
nette à leur surface qui va adsorber les ions environnants. Ainsi en ED, les colloïdes,
principalement chargés négativement, vont pouvoir interagir avec les charges positives des
MEAs et créer du colmatage217.
• Organique : il va être similaire au précédent, à part que les molécules organiques vont être
dissoutes dans le milieu. Il peut s’agir d’huile, de protéines, de glucides, de substances
aromatiques. Les MEAs vont souvent être plus sensibles au colmatage organique, par
interactions électrostatiques et/ou hydrophobes218.
• Inorganiques : les sels présents dans la solution vont précipiter et se déposer sur ou à
l’intérieur de la membrane. Les ions majoritairement impliqués dans la formation de
colmatage minéral en ED vont être le magnésium, le phosphate, le calcium, le baryum, le
carbonate et le sulfate217.

Séparation de peptide bioactifs par électrodialyse avec

membranes d’ultrafiltration

Plusieurs études ont montré que l’obtention de fractions peptidiques de faibles PM,
suite au fractionnement d’hydrolysat (chromatographie, baro-mambranaire, EDUF),
permettait d’observer une augmentation des activités biologiques12, 17, 197. Comme le présente
le tableau 1-7, différentes sources d’hydrolysats ont été fractionnées par EDUF, permettant
la récupération de fractions et l’identification de séquences peptidiques actives. Langevin et
al.225 ont comparé la séparation d’un hydrolysat de soja (Glycine max) par nanofiltration
(300-500Da) et par EDUF (10kDa) pour l’obtention de fractions antioxydantes. Les auteurs
ont démontrés que le flux de masse était plus important en nanofiltration mais que seule la

52
fraction anionique de l’EDUF permettait d’augmenter la capacité ORAC de l’hydrolysat
initial225.

La séparation d’un hydrolysat de soja (Glycine max) par EDUF avec des UFs de
100kDa a permis la récupération d’une fraction anionique et d’une fraction cationique,
enrichies en peptides de PM inférieur à 1000Da. Les deux fractions présentaient une activité
hypoglycémique in vitro en augmentant la captation du glucose de cellules musculaires. De
plus, par rapport à l’hydrolysat initial, les fractions anionique et cationique augmentaient
cette activité de 22% et 20% respectivement. Les auteurs ont démontré que cette amélioration
du métabolisme du glucose, était dû à l’activation de la voie de captation du glucose non-
insuline dépendante, l’AMPK16. La séparation par EDUF d’un hydrolysat de co-produits de
saumon a aussi permis la production de fractions de récupérations (anionique et cationique)
modulant la captation du glucose in vitro17. Diverses activités biologiques ont ainsi été
reportées grâce à la production de fractions actives par EDUF (Tableau 1-7). L’activité
antibactérienne (Escherichia coli et Listeria innocua) d’un hydrolysat de crabe des neiges
(Chionoecetes opilio) a été détectée dans la fraction de récupération anionique après
séparation par EDUF, alors que l’hydrolysat initial ne présentait pas d’activité pour une
même concentration15. Udenigwe et al.223 ont montré qu’une fraction cationique de graine de
lin riche en Arg obtenue après EDUF, permettait la diminution de la pression artérielle chez
des rats hypertendus. De plus, les valeurs étaient comparables à celles du contrôle
Captopril®. La fraction cationique présentait aussi un effet inhibiteur in vitro de l’ACE de
façon dose-répondante223.

Ainsi, le fractionnement par EDUF d’hydrolysats complexes a permis l’obtention de

fractions actives pour diverses utilisations. De plus, cette méthode de séparation est
polyvalente et a déjà été utilisée sur de nombreuses sources très diverses. Les activités
biologiques des PB étant liées à leur PM et leur séquence en AA, l’EDUF est un procédé
prometteur pour l’obtention de PB actifs, et donc pour la valorisation de co-produits de
poisson. En plus de sa sélectivité, l’EDUF présente aussi l’avantage d’être une méthode de
séparation verte (utilisation d’eau et d’électricité). Cependant elle présente aussi quelques
inconvénients comme l’utilisation de solution de KCl pour la récupération de PB rendant la
consommation directe des fractions difficile (importante concentration en sel). De plus, les

53
taux de migrations des peptides peuvent être faibles dans les fractions de récupération
diminuant ainsi le rendement de l’EDUF.

54
Tableau 1-7 : Séparation de peptides et/ou de fractions bioactives par électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration. NI : non indiqué.

Source Fraction Activité Séquence Référence

Poulin et al.210, 219,
ACE inhibiteur/ opioïde ALPMHIR Bazinet13, Doyen et al.220,
Cationique Suwal et al.221
Poulin et al.207, 210,
Antimicrobien VAGTWY
Bazinet13
Doyen et al.220, Suwal et
ACE inhibiteur IDALNENK
β-lactoglobuline al.221
de lactosérum ACE inhibiteur VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR
bovin ACE inhibiteur/
GLDIQK Doyen et al.220
Hypocholestérolémique
Anionique
Hypocholesteromique IIAEK
Doyen et al.220, Suwal et
Antimicrobien VLVLDTDYKK
al.221
Antimicrobien VAGTWY
Suwal et al.221
Hypocholestérolémique VYVEELKPTPEGDLEILLQK
Protéine blanche
de Luzerne Cationique ACE inhibiteur VW Firdaous et al.208, 222
(Medicago sp.)
Udenigwe et al.223, Doyen
Graine de Lin Antihypertenseur NI
Cationique et al.212
(Linum sp.)
Hypoglycémique NI Doyen et al.212
Hydrolysat
Colza (Brassica Antihypertenseur NI
final He et al.18
napus subsp.)
Anionique Antihypertenseur NI
Hémoglobine
Cationique Antimicrobien NI Vanhoute et al.224
bovine

55
Tableau 1-7 : Séparation de peptides et/ou de fractions bioactives par électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration. NI : non indiqué (suite).
Source Fraction Activité Séquence Référence
Antioxydant NI Langevin et al.225
Graine de Soja Anionique
Hypoglycémique NI
(Glycine max) Roblet et al.16
Cationique Hypoglycémique NI
Co-produit de Hydrolysat
Hypoglycémique NI
saumon de final
Roblet et al.17
l’Atlantique Cationique Hypoglycémique NI
(Salmo salar) Anionique Hypoglycémique NI
Co-produit de Cationique Anticancer NI
crabe des neiges
Doyen et al.14
(Chionoecetes Anionique Antibactérien NI
opilio)

56
 Ainsi, cette revue de bibliographie a montré le potentiel des co-produits de poisson
comme source de molécules bénéfiques pour la santé humaine, dont la prévention de
l’occurrence du MetS, et l’importance d’un procédé de fractionnement sélectif pour la
récupération de PB bioactifs. De plus, l’utilisation d’hydrolysat de hareng pour
l’amélioration de paramètres physiologiques impliqués dans le syndrome métabolique reste
encore peu étudiée. Ainsi, cette présente étude est une première dans ce domaine. Cependant,
la séparation par EDUF d’hydrolysats plus complexes contenant différents composés comme
des acides gras n’a pas été encore reportée. Leur séparation est donc une étape importante
dans cette étude. L’EDUF semble donc être une méthode adaptée pour la séparation
d’hydrolysats de co-produits de poisson et l’obtention de fractions actives, permettant la
valorisation subséquente d’une importante biomasse de faible valeur ajoutée. Ainsi, leur
utilisation pour la santé humaine dans l’industrie des nutraceutiques ou pharmaceutique
permettrait l’augmentation de leur valeur ajoutée et donc la mise en place d’un marché
économique viable pour les industries de la transformation des produits de la pêche.

57
CHAPITRE 2 : Hypothèse et objectifs

La valorisation des co-produits de poisson est une problématique économique,

écologique et sociétale. De nos jours, leur principale valorisation reste une utilisation de
masse à faible valeur ajoutée, notamment pour la production de farine et d’huile de poisson
pour l’aquaculture. Cependant, les co-produits de poisson sont riches en molécules à haute
valeur ajoutée qui peuvent être utilisées pour améliorer la santé humaine. En effet, depuis
plusieurs années, les AGPI et PB de poisson ont démontré des activités biologiques
indispensables pour le traitement du MetS. Les AGPI ont été longuement étudiés pour leur
action sur les MCV, cependant l’activité des PB de poisson sur le MetS reste encore peu
étudiée. La laitance de poisson est un co-produit de l’industrie agroalimentaire, riche en
AGPI et PB. L’utilisation de ce co-produit pour améliorer la santé humaine permettrait
d’augmenter sa valeur ajoutée et de développer un marché économique viable pour les
industries de transformation de poisson. Dans un objectif final d’une application industrielle,
cette thèse est effectuée en utilisant des produits commerciaux (hydrolysat de laitance de
hareng) fournis par une industrie québécoise de valorisation de produits marins afin
d'investiguer si de nouvelles technologies peuvent améliorer l'efficacité biologique des
produits de laitance de hareng et ainsi identifier des allégations commerciales permettant un
positionnement économique distinctif.

À notre connaissance, aucune étude n’a été menée sur l’évaluation des bioactivités
potentielles de différents hydrolysats de laitance de hareng sur des fonctions physiologiques
impliquées dans le développement du MetS ainsi que sur leur fractionnement subséquent. En
effet, les étapes de séparation des hydrolysats semblent déterminantes pour l’activation ou
l’augmentation des activités biologiques. Cependant, les principaux procédés utilisés de nos
jours (méthodes chromatographiques et baro-membranaires) présentent certaines
problématiques de sélectivités et environnementales (colmatage, utilisation de solvant).
Ainsi, le développement de nouvelles techniques de séparation d’hydrolysats est donc crucial
pour la valorisation des co-produits de poisson en composés actifs à haute valeur ajoutée.

58
 Hypothèse de recherche
À la suite des différentes problématiques exposées ci-dessus, l’hypothèse de
recherche de cette thèse est la suivante :

“Les composés bioactifs issus d’hydrolysats de laitance de hareng limitent le développement

du syndrome métabolique et leur séparation par ÉlectroDialyse avec membranes
d’ultrafiltration (EDUF), suite à un double fractionnement selon leur taille et leur charge,
permet d’augmenter les activités biologiques des fractions séparées et d’identifier certaines
des molécules impliquées.”

Objectifs
• Le premier objectif était d’évaluer l’effet bénéfique potentiel de trois produits industriels
d’hydrolysat de laitance de hareng sur certaines fonctions physiologiques associées au
développement du MetS :

- Déterminer si une supplémentation avec différents hydrolysats industriels permet une

modulation bénéfique de certaines fonctions physiologiques associées au MetS chez des
souris nourries avec une diète riche en gras et en sucre.
- Évaluer in vitro les bioactivités de différents hydrolysats de laitance de hareng (captation du
glucose, le stress oxydant et l’inflammation).

• Le deuxième objectif avait pour but d’étudier l’effet d’un fractionnement multiple simultané
par EDUF sur la séparation de composés bioactifs :

- Évaluer la faisabilité d’une nouvelle configuration d’EDUF (utilisation de quatre membranes

d’UF) sur le fractionnement des différents composés présents dans les hydrolysats de laitance
de hareng et les effets sur la composition des fractions de récupérations.
- Analyser l’effet du fractionnement par EDUF sur la production de fractions exerçant une
activité sur la captation du glucose, le stress oxydant et l’inflammation dans des modèles
cellulaires.

59
• Le troisième objectif était de caractériser les profils peptidiques des fractions produites par
EDUF et identifier les peptides bioactifs par des techniques chromatographiques.
- Analyser les profils en acides aminés des fractions obtenues après EDUF.
- Analyser les poids moléculaires des peptides des fractions émises après EDUF.
- Identifier des séquences peptidiques des fractions bioactives par une méthode de
spectrométrie de masse et démontrer leur bioactivité in vitro.

60
CHAPITRE 3 : Utilisation d’hydrolysats de laitance de
hareng pour l’amélioration du syndrome métabolique :
essais in vivo et in vitro.

L’article présenté dans ce chapitre s’intitule :

«Use of herring milt hydrolysate for the improvement of the metabolic syndrome: in
vitro and in vivo experiments.» En révision finale pour être soumis dans le journal «Food
Research International».

Les auteurs sont : Rachel Durand (Candidat Ph.D : planification et réalisation des
expériences, analyse des résultats et rédaction de l’article), Erwann Fraboulet (Codirecteur
de thèse, supervision scientifique, correction et révision de l’article), Geneviève Pilon
(Collaborateur scientifique du projet, correction et révision de l’article), Vanessa P. Houde
(Collaborateur scientifique du projet, correction et révision de l’article), Thibaut Varin
(Collaborateur scientifique du projet, correction et révision de l’article), André Marette
(Collaborateur scientifique du projet, correction et révision de l’article) et Laurent Bazinet
(Directeur de thèse, planification des expériences, supervision scientifique, correction et
révision de l’article).

61
Transition contextuelle
Comme le démontre la revue de littérature, les co-produits de poisson sont riches en
molécules bénéfiques pour la santé humaine et présentent des bioactivités intéressantes pour
limiter le développement du MetS. En effet, les AGPI et PB peuvent améliorer la sensibilité
à l’insuline, réduire l’inflammation, diminuer le risque de MCV et augmenter les activités
antioxydantes. Des hydrolysats de laitance de hareng produits par une entreprise locale
contenant des AGPI, notamment DHA et EPA ainsi que des peptides pourraient améliorer
certaines fonctions physiologiques impliquées dans le MetS. À notre connaissance, aucune
étude n’a évalué l’utilisation de ces produits pour limiter le développement du MetS in vivo
ou in vitro. En effet, ces produits sont vendus par l’entreprise sans allégations scientifiques
et donc l’apport d’une étude in vivo et in vitro démontrant des effets bénéfiques pour la santé
humaine permettrait d’augmenter leur valeur économique. L’objectif de cette étude est donc
d’évaluer les bioactivités potentielles de trois produits industriels d’hydrolysats de laitance
de hareng chez des souris nourries avec une diète riche en gras et en sucre (HFHS), ainsi que
sur différents modèles cellulaires.

62
Résumé
La recherche de composés bioactifs issus d’hydrolysats enzymatiques est en augmentation
depuis ces dernières années, et les co-produits de poisson ont démontré une importante
richesse de molécules actives pour la santé humaine. L’hydrolysat de laitance de hareng
(HMH) est un mélange complexe composé de lipides, nucléotides, minéraux et peptides, mais
n’a jamais été utilisé pour l’amélioration de paramètres impliqués dans le développement du
syndrome métabolique (MetS). Dans ce contexte, trois HMHs industriels ont été testés in
vivo et in vitro afin d’évaluer leurs bioactivités sur MetS.

L’effet des HMHs sur la captation du glucose et l’inflammation a été mesuré in vitro avec
des myocytes L6 et des macrophages. En parallèle, des souris mâles C57Bl/6J ont été
nourries avec la diète contrôle (Chow) ou la diète riche en gras et en sucre (HFHS) pendant
huit semaines. Les souris ont reçu par gavage soit le placébo (eau) ou un des trois HMHs
(HMH1, HMH2 et HMH3), à une dose de 208,8mg/kg (représentant 1g/jour pour l’homme).
L’effet des supplémentations a été étudié sur la tolérance au glucose et à l’insuline,
l’homéostasie lipidique ainsi que sur la diversité du microbiote.

Il a été observé in vitro, que HMH2 à 100pg/ml et HMH3 à 1µg/ml diminuaient

significativement la production d’oxyde nitrique (un marqueur de l’activation d’iNOS) dans
les macrophages stimulés avec du LPS, révélant leur activité anti-inflammatoire. In vivo, la
supplémentation quotidienne de HMH2 et HMH3 a permis l’amélioration de la tolérance au
glucose induite par la diète HFHS. Un meilleur contrôle de la glycémie est important chez
les patients atteints du MetS. Une augmentation de l’apport en énergie totale a aussi été
observée chez les souris supplémentées avec HMH1. La diète HFHS a diminué la diversité
bactérienne du microbiote en comparaison avec la diète Chow. Cependant, la
supplémentation avec HMH2 a permis la protection de la diminution de l’abondance des
Lactobacillus dans le microbiote intestinal des souris.

Pour la première fois, il a été démontré qu’un hydrolysat de laitance de hareng a entraînait
une augmentation de la tolérance au glucose et une modulation du microbiote intestinal chez
des souris, ainsi qu’une activité anti-inflammatoire in vitro.

63
Mots clefs : hydrolysat de laitance de hareng, peptides bioactifs, acides gras polyinsaturés,
syndrome métabolique, tolérance au glucose, microbiote intestinal, Lactobacillus.

64
Abstract
The research of bioactive compounds from enzymatic hydrolysates has increased since the
last decades and fish by-products revealed a high richness in health benefit molecules.
Herring milt hydrolysate (HMH) is a complex matrix composed of lipids, nucleotides,
minerals and peptides, but not really known for its potential use for improving human health.
In this context, three industrial products containing HMHs were tested in vitro and in vivo to
measure their activities on metabolic syndrome.

The effects of HMH on glucose uptake and inflammation were studied in vitro with L6
myocytes and J774 macrophage. In parallel, male mice C57Bl/6J were fed with either the
control chow diet or a high fat high sucrose (HFHS) diet for 8 weeks. They were receiving
either the vehicle (water) or one of the 3 HMH products (HMH1, HMH2 and HMH3) by
daily oral gavage. The dose used was 208.8mg/kg (representing 1g/day for a human). The
impact of HMH supplementation was studied on insulin and glucose tolerance, lipid
homeostasis and microbiota profile.

It was observed, in vitro, that 100pg/ml of HMH2 (p<0.05) and 1µg/ml of HMH3 (p<0.01)
decreased nitrites production (a marker of iNOS activation) in macrophages stimulated with
LPS, revealing their anti-inflammatory effects. In vivo, the daily supplementation of HMH2
and HMH3 in mice improved glucose tolerance induced by the HFHS diet (p<0.05). A better
control of its glycaemia is important for patients with metabolic syndrome. An increase in
total energy intake was also observed for mice fed with HMH1 product (p<0.05). The HFHS
diet decreased the overall microbiota abundance compared to the healthy chow control diet
in mice. Interestingly, the consumption of the HMH2 product partially protects against the
disappearance of lactobacillus species in the gut microbiota (p<0.05).

For the first time, herring milt hydrolysate demonstrated an enhancement of the glucose
tolerance and a modulation of the microbiota in mice, as well as an anti-inflammatory effect
in vitro.

Keywords: herring milt hydrolysate, bioactive peptides, polyunsaturated fatty acids,

metabolic syndrome, glucose tolerance, microbiota, Lactobacillus.

65
 Introduction
The modern society and the western lifestyle allow the emergence of new diseases such as
the metabolic syndrome (MetS) which affects one American on three86, 87. This new major
public health issue is defined by the presence of dyslipidemia, insulin resistance, visceral
obesity and hyperglycaemia, which also increase the risks to develop type 2 diabetes and
cardiovascular diseases4. Moreover, even if a rich diet is one of the main contributors to MetS
development, it is well known that some specific nutrients can provide health benefits. The
consumption of fish has been reported in epidemiological studies to decrease the risk of
developing cardiovascular diseases and type 2 diabetes40, 43, 226.

The presence of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and especially the high concentration of
omega-3 (ω-3) in fatty fish have been associated to these benefits. Indeed, the consumption
of fish oil has been linked to the decrease of the dyslipidemia in diabetic patients but also to
the decrease in triglyceride and LDL-cholesterol levels131, 143. Clinical studies have also
reported the beneficial effect of the ω-3 consumption on the insulin resistance129, 130. Jimenez-
Gomez et al.129 demonstrated that a supplementation with 1.24g/day of ω-3 allowed an
improvement in insulin sensitivity by decreasing plasma insulin, HOMA-IR (HOmeostasis
Model Assessment of Insulin Resistance) and non-esterified fatty acid concentrations. The
improvement of the cellular membrane fluidity by increasing unsaturation in the lipid bilayer
by PUFA consumption, might explain the enhancement of insulin sensitivity135, 136, 138. PUFA
are not the only beneficial compounds in fish responsible of the improvement of MetS. Fish
proteins, which are rich in essential amino acids (AA), have also been linked to the
improvement of insulin sensitivity and glucose tolerance in animal and human studies163, 227-
229
. Recently, the use of fish hydrolysates from various sources, and bioactive peptides have
demonstrated beneficial activities such as the reduction of dyslipidemia, insulin resistance
and the improvement of the glucose tolerance5, 10, 166, 171, 230, 231. Chevrier et al.231 reported
that the replacement of 50% of the protein portion in a high fat diet by a salmon hydrolysate
(Salmo salar), was able to improve glucose tolerance, decrease dyslipidemia and
inflammation in adipose tissue. Ben Slama-Ben Salem et al.5 have studied the effect of an
octopus hydrolysate (Octopus vulgaris) supplementation (400mg/kg) on alloxanic rats and
they reported the improvement of the glucose tolerance with an increase of the insulin

66
concentration in the plasma. Moreover, Harnedy et al.170 shown that one dose of blue whiting
hydrolysate (Micromesistius poutassou) was able to enhance the glucose tolerance and the
insulin concentration in mice. Moreover, food industries produce huge amounts of by-
products and, just for the fish processing, an average of 60% is discarded (heads, viscera,
bones, skin, milt/roe)2. These by-products still contain valuable molecules and might be used
for human nutrition and health. The Atlantic herring (Clupea harengus) is the first caught
species in Canada and the milt (male gonad part) is a by-product of its processing, often
discarded and used for aquaculture26. The fish milt is a mix of proteins, lipids, ADN, minerals
and its use for enhancing the human health allowing to increase its economic value. So, in
the light of these previous studies, complex herring milt hydrolysates mixing PUFA and/or
bioactive peptides, seem promising to improve some parameters involved in the MetS.

The aim of the present study was to evaluate the impact of different complex fish
hydrolysates, from herring milt, in the development of MetS in mice fed with a High Fat
High Sucrose (HFHS) diet.

Materials and methods

Animal experiments

Supplementation

Three industrial products containing herring milt hydrolysate (HMH1, HMH2 and HMH3)
from Ocean NutraSciences (Matane, QC, Canada) were used as supplementation of the High
Fat High Sucrose (HFHS) diet at a dose of 208.8mg/kg. Briefly, herring milt was hydrolysed
with a mix of enzymes (confidential) and separated by ultrafiltration. The permeate
constituted the HMH1, the retentate constituted the HMH2 and the HMH3 was a mix of
HMH2 and astaxanthin. The composition of each product is resumed in table 3-1. Each
supplementation was given daily by orally gavage.

67
Table 3-1 :Chemical composition of the herring milt hydrolysate (HMH) products (dry matter).
HMH1 HMH2 HMH3

Protein/peptide (%) 93.79 48.28 47.0

Lipids (%) - 18.48 26.0

Nucleic acid (%) 7.33 27.30 7

Ashes (%) 12.28 11.55 12

Astaxanthin (ppm) - - 500

Animals and dietary treatment

6 weeks old C57Bl/6j male mice from Jackson Laboratory were separated and housed 1
individual per ventilated cage maintained under 12h daylight cycle and constant temperature.
After 12 days of acclimation with a chow diet (Teklad 2018, Harlan), mice were separated in
5 groups (n=12) and randomly assigned to the different treatments: chow control
supplemented with water (Chow), control high fat high sucrose diet providing 65.5% of
energy supplemented with water (HFHS), diet HFHS supplemented with product HMH1
(HMH1), diet HFHS supplemented with product HMH2 (HMH2) and diet HFHS
supplemented with product HMH3 (HMH3). After 8 weeks of these respective diets, mice
were anesthetized by isoflurane inhalation and the blood was collected by cardiac puncture
and each tissue was weighted and stored at -80°C until further experiments. All the
procedures met the Guidelines for the care and use of laboratory animals and received the
agreement of the Laval University Animal Ethics Committee.

Insulin tolerance test

At week 6 the Insulin Tolerance Test (ITT) was performed. Mice were fasted for 6h and the
t0 glycaemia was measured in the tail with a One Touch Mini Ultra Glucometer (LifeScan).
Briefly, 10µL/g of body weight of a 0.65U/kg insulin solution were injected by intra-
peritoneal. The glycaemia at t5, t10, t20, t30 and t60min was measured in the tail. Blood
samples (60µl were collected at t10min).

68
 Oral glucose tolerance test

Three days before the sacrifice, mice were fasted for 12h and the oral Glucose Tolerance Test
(oGTT) was performed. Briefly, a solution at 1g of dextrose/kg of body weight was given
orally to each mouse and the glycaemia was measured in the tail with a One Touch Mini
Ultra Glucometer (LifeScan) at t0, t15, t30, t60 and t120min. Blood samples (60µl) were also
collected at each time.

Biochemical analysis

The liver triglyceride (TG) was extracted by a chloroform-methanol extraction based on a

modified Folch method232, and measured by an enzymatic reaction with a colorimetric assay
kit (Randox Laboratories, Crumlin, UK). The plasma insulin was analysed using an
ultrasensitive ELISA kit (Alpco, Salem, NH, USA).

Gut microbiota analysis

At week t0 and t8 fresh faecal samples were collected and stored at -80°C. Bacterial DNA
was extracted and purified using a ZymoBIOMICS® DNA Kit (Zymoresearch, Ivrine, CA,
USA), following the instructions of the manufacturer. The composition of the faecal
microbiota was carried out by 16S RNA gene-based profiling as previously described233. All
raw sequences were deposited in the public European Nucleotide Archive server under
accession number PRJEB19783 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19783 ).

In vitro bioactivities

Glucose uptake

The glucose uptake was measured with L6 muscle skeletal cells grown in α-DMEM media
enriched with 10% (v/v) of foetal bovine serum (FBS) in an atmosphere of 5% CO2 at 37°C
as previously described9. The differentiation in myotube was initiated by changing media
with α-DMEM media enriched with 2% (v/v) of FBS. The test was initiated by deprivation
of GBS for 180min and the addition of each product at 1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml of
powder by well for 75min. A stimulation by adding 1 10-5M of insulin was completed during
45min in the half of the plate. After rinsing, a HEPES-buffered solution with 10µM 2-
deoxyglucose and 0.3 µCi/mL 2-deoxy-[3] glucose was added in each well and incubated for

69
8min. After a lysis of cells, radioactivity was measured by scintillation counting (DPM) in
400µL of sample solution.

Inflammation

The potential anti-inflammatory activity of each product was tested in vitro with J774
macrophage cells plated at 15 106 in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) with
10% (v/v) of bovine growth serum (BGS) and 1% (v/v) of penicillin during 24h. Each product
was added at a final concentration of 1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml of powder by well and
incubated 24h. To induce inflammation, lipopolysaccharide (LPS) was added at a final
concentration of 2.5ng/ml by well, being in contact overnight, and the nitrite concentration
was measured in the media as previously described234.

Statistical analysis

To analyse the effect of the HFHS diet on mice, Student’s t tests were conducted between
Chow and HFHS diet. The effects between each HMH diets and the HFHS control diet were
assessed by One Way ANOVA with a post-hoc Dunett. Time point within different groups
for oGTT and ITT were compared with a Two Ways ANOVA with a post-hoc Student-
Newman-Keuls. All statistical analyses for the in vivo part were assessed with SigmaPlot
12.0.

All the statistical tests for the in vitro activities were carried out with SAS software version
9.3 (SAS institute Inc, Cary, NC, USA). One-Way ANOVA were done for the glucose
uptake values and the inflammation values with a post hoc Dunett test to identify the
difference between the samples. The normality and residue homogeneity were controlled by
the Shapiro test and the Levene test respectively.

To assess overall differences of bacterial community structure between treated groups, a

heatmap was first created at the genus level (on taxa having at least 0.1% of total relative
abundance) and then was estimated in terms of alpha-diversity metrics by measuring the
Shannon reciprocal index. Principal coordinates analysis (PcoA) was performed on a
unweighted UniFrac distance matrix using the R phyloseq package in order to measure beta-
diversity235. One-way ANOVA with a post hoc Bonferroni’s test was used to assign

70
significance on alpha-diversity indices. The statistical significance of differentially abundant
bacteria between the two distinct biological conditions was measured using Linear
Discriminant Analysis Effect Size (LDA) with a threshold of 2.5236. All results were
considered statistically significant at p < 0.05.

Results
Physiological effects

The impact of the HFHS diet was first assessed with the physiological data presented in table
3-2. The HFHS diet increased the total weight gain and all the fat masses in mice suggesting
an obesity development in these mice. No impacts of the HFHS diet were reported for the
total energy intake and the liver weight. The HMH supplementations had no impact on any
of these parameters and did not attenuate the obesity development in mice. However, the
HMH1 diet increased the total energy and tended to increase the total weight gain of the
animals (p=0.16).

Table 3-2: Effect of the HMHs supplementation after 8 weeks on the body characteristics (mean ±
SEM, * p< 0.05 chow vs HFHS, # p< 0.05 HFHF vs HMH1).

Chow HFHS HMH1 HMH2 HMH3

2.71 ±
Total weight gain (g) 8.18 ± 0.66 9.71 ± 0.66 7.83 ± 0.60 9.48 ± 0.33
0.23***
Total energy intake 552.41 ± 592.65 ± 635.93 ± 608.37 ± 632.59 ±
(kcal) 29.42 10.76 12.83 # 11.35 11.48
0.93 ±
Visceral fat pad (g) 2.75 ± 0.30 3.20 ± 0.23 2.83 ± 0.22 3.14 ± 0.15
0.05***
Subcutaneous fat pad 0.29 ±
0.69 ± 0.06 0.78 ± 0.06 0.67 ±0.05 0.73 ± 0.03
(g) 0.01***
Brown adipose tissue 0.074 ± 0.092 ± 0.089 ± 0.103 ±
0.099 ± 0.004
(g) 0.003* 0.006 0.005 0.006
Liver (g) 1.05 ± 0.02 0.92 ± 0.08 1.03 ± 0.03 0.99 ±0.03 1.00 ± 0.03

Liver metabolism

The liver is an important organ in the metabolic syndrome, so the impact of HMH
supplementations on the liver metabolism was investigated (Table 3-2, Figure 3-1). No

71
differences were observed for the liver weights. The HFHS diet did not increased the liver
weight compared to the chow diet, but it increased the triglycerides (TG) (17.34 ± 0.91 mg/g
for the chow diet and 40.86 ± 4.59 mg/g for the HFHS diet) and cholesterol (TC) (7.83 ±
0.23 mg/g for the chow diet and 11.91 ± 1.45 mg/g for the HFHS diet) concentrations in the
livers. The HMH supplementations did not decrease the levels of lipids accumulations in the
liver and no difference were observed in comparison with the HFHS control diet.

Figure 3-1 : Hepatic lipid composition in mice fed with HFHS diet with or without HMHs
supplementation. Dashed line represents the chow group, * p< 0.05 chow vs HFHS.

Glucose and insulin tolerance.

The glucose and insulin tolerance were investigated with oGTT and ITT tests (Figure 3-2).
As expected, the chow diet had lower fasting glycaemia and glycemic response during both
tests while all groups fed with the HFHS diet had higher glycemic response. Moreover, a
decrease in the glycaemia was registered for HMH 2 and HMH 3 at time 15min. The insulin
sensitivity was investigated with the ITT test and the insulin production during oGTT test
(Figure 3-2 B-C). All groups fed with HFHS increased insulin production during the oGTT
test and the glycaemia during the ITT test. The HMH supplementation did not improve the
insulin sensitivity in mice.

72
Figure 3-2: Impact of HMH supplementation in mice fed with HFHS on glucose and insulin
tolerance. A) Glycemic curve during oGTT, B) Insulin production during oGTT, C) Glycemic curve
during ITT. * p< 0.05 Chow vs HFHS, ## p< 0.01 HFHS vs HMH2, $ p< 0.05 HFHS vs HMH.

Gut microbiota diversity.

Next, the impact of the HMH supplementations on the microbiota diversity was investigated
after DNA extraction and 16s RNA amplification of the faeces at T0 and T8 weeks. As
expected, the gut microbiota between the chow diet and the HFHS diet were in opposition
after 8 weeks of treatment. Indeed, the Principal coordinates Analysis (PcoA) on unweighted
UniFrac (Figure 3-3 A) shown the separation in two units depending of the diet. Moreover,
the HMH supplementation groups were grouped in a cluster and overlapped to the HFHS
control group. The alpha-diversity metrics was estimated by measuring the Shannon
reciprocal index (Figure 3-3). A decrease of the index was observed with the HFHS diet after
8 weeks, indicating a decrease in the gut microbiota diversity, while the Shannon index for
the chow diet did not change during the experiment. The decrease in gut microbiota diversity

73
for all groups fed with the HFHS diet was also related to a higher Firmicutes to Bacteroidetes
(F/B) ratio due to the increase of the Bacteroidales order. The relative abundance graph also
reported a change in the gut microbiota diversity in all HFHS groups with notably the
increase of the Verrucomicrobiales order.

Figure 3-3: A) Beta-diversity of gut microbiota in mice between groups after 8 weeks observed by
means of Principal coordinates analysis (PcoA) on an unweighted UniFrac distance matrix. B)
Alpha-diversity of gut microbiota between groups before and after the experimentation by measuring
the Shannon reciprocal index.

The impact of the different HMH supplementations was assessed and analyzed with Linear
Discriminant Analysis Effect Size with a threshold of 2.5236 (Figure 3-4). The gut microbiota
diversity of mice supplemented with HMH1 was discriminated from those with the HFHS
diet without supplementation, by an increased presence of Dubosiella and a decreased
occurrence of Ruminoclostridum, Flavonifractor and Tyzzeralla order. The supplementation
with HMH2 allowed the increase of the Lactobacillus population compared to the HFHS
control. Finally, the gut microbiota of mice with HMH2 supplementation, had a higher
population of Anaerotruncus and a lower population of Ruminoclostridum, Tyzzerella and
Romboustia.

74
 A) B)

C)

D)

Figure 3-4: The statistical significance of differentially abundant bacteria between the two distinct
biological conditions was measured using Linear Discriminant Analysis Effect Size (LDA). Black
bar: HFHS control, white bar: Chow group, grey bar: HMH supplementations groups, A) Chow vs
HFHS, B) HFHS vs HMH1, C) HFHS vs HMH2 and D) HFHS vs HMH3.

In vitro glucose uptake and inflammation.

The glucose uptake and anti-inflammatory activities of each HMH supplementations was
also investigated in cells. The glucose uptake was determined in L6 muscle cells with and
without insulin stimulation (Figure 3-5). No modulation of the glucose uptake by cells was
measured for any HMH supplementations at 1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml.

The inflammation was investigated by the LPS induction of nitric oxide (NO) production in
macrophages (Figure 3-6). A decrease of the NO production was measured in macrophages
stimulated by HMH2 and HMH3. Interestingly, this inhibition was measured at two different
concentrations depending on the product; at 100pg/ml with a decrease of 16% for HMH2 and
at 1µg/ml with a decrease of 17% for HMH3.

75
Figure 3-5: Glucose uptake capacity A) without insulin; B) with insulin in L6 cells stimulating by
HMHs at three concentrations (1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml), n=6, mean ± SEM).

Figure 3-6 : Nitric oxide production in culture media after inflammation induction by LPS in J774
mice macrophages stimulating by HMHs at three concentrations (1µg/ml, 1ng/ml and 100pg/ml),
n=6, means± SEM, *p<0.05, **p<0.01.

76
 Discussion
Physiological parameters and liver lipid metabolism.

The aim of this study was to evaluate the supplementation with 3 different products of herring
milt hydrolysate (HMH) on the development of the MetS in mice fed with a HFHS diet. The
MetS is a complex disease defined by the presence of hyperglycaemia, dyslipidemia, visceral
obesity and hypertension4. Some studies have previously reported the beneficial effects of
fish hydrolysates on different parameters involved in the MetS17, 231. In this study the HFHS
diet increased the body weight in all groups with notably an increase of all fat tissue. Several
studies reported the development of obesity and metabolic disorder in mice fed with HFHS231,
233
. The supplementation with HMH1 significantly increased the energy intake in mice and
seemed to promote the total weight gain versus the HFHS control (Table 3-2). Interestingly,
the fat accumulations were not changed in all HFHS groups supplemented with HMH
products, and so this increase of energy intake by HMH1 did not change the physiological
parameters of the mice. Bjørndal et al.84 also reported a significant weight gain in mice fed
with a HFHS diet with 15% (w/w) of herring milt. Another study using a herring hydrolysate
(100% of the protein part) in rats fed with a high fat diet report any difference of the body
weight gain with the control group73. Other fish hydrolysates have been used to prevent the
MetS development5, 6, 166, 170, 171, 230. Jemil et al.6 have used a hydrolysate from sardinelle
(Sardinella aurita) fermentation in male Wistar rats fed with a HFHS diet and they reported
a decrease of the body weight gain and the epididymal fat with the supplementation. The
authors hypothesized that bioactive peptides in the hydrolysates could act as an appetite
suppressor and consequently down regulated the food intake in rats. Other explanation by
Liaset et al.166 for the reduction of body weight in rats fed with a saithe hydrolysate, was the
increase of bile acids in plasma leading to increased fatty acid oxidation in abdominal adipose
tissue. In the present study, the energy intake was increased but the physiological parameters
were not changed, so it can be hypothesised that HMH1 contains peptides stimulating
appetite. Indeed, unlike HMH2 and HMH3 which are a mix of peptides and lipids, HMH1
contained a majority of small peptides (Table 3.1, 93.7 vs 47-48%).

Dyslipidemia is one of the most important risk factors to develop MetS, cardiovascular
diseases and diabetes. Hypertriglyceridemia is defined as an elevated triglyceride (TG) level
77
in blood (≥ 150mg/dl), resulting in an increase of TG production132, 157. This dysfunction
influences directly high-density lipoprotein (HDL) and low-density lipoprotein (LDL)
concentration which are important markers revealing the coexistence of risk factors such as
132, 237
elevated plasma glucose, hypertension and atherosclerosis . In this study, the HFHS
diet increased the level of TC and TG in the liver by +51.97% and + 135% respectively,
revealing the development of a dyslipidemia (figure 3-1). The daily administration of HMH
products did not impact the hepatic TC and TG concentrations, which were similar to the
HFHS control group. Bjørndal et al.84 reported an increase of the TC and TG levels in the
liver of mice expressing hTNFα fed with 15% of herring milt. They explained the increase
of TC by the initial high presence of cholesterol (17.5% w/w) in the herring milt, but the
increase of TG was unexplained84. Several studies have reported the beneficial effect of fish
hydrolysates from different sources on the dyslipidemia and their lowering effect on TC and
TG in the plasma and/or the liver 5, 6, 10, 165, 166, 230, 238. Vik et al.10 linked the decrease of TG
in the plasma and the liver of mice fed with a high fat diet + 5% of salmon hydrolysate, to
the reduction of the activity of the fatty acid synthase and the expression of lipogenic genes
in the liver. Other authors reported an increase of the VLDL receptor mRNA level with saithe
hydrolysate, increasing the VLDL uptake which might contribute to the reduction of plasma
TC and TG166. All these studies linked the decrease of TC and TG to the presence of small
bioactive peptides in fish hydrolysates. The 3 HMH products contain peptides from herring
milt and the differences in the observations might be due to the absence of peptides able to
reduce the dyslipidemia in mice fed with HFHS. Moreover, the in vivo models and the dose
of fish hydrolysate are also important parameters. In this study, the dose used was
208.8mg/kg in mice, representing 1g/day for a human. The studies previously cited, mostly
used Wistar rats with orally gavage at 400mg/ml or with incorporation directly in the diet (5-
/15% w/w). But peptides are not the only bioactive compounds find in marine biomasses.
Indeed, marine lipids and especially omega-3 polyunsaturated fatty acid (ω-3 PUFA), have
been reported to decrease the TG levels due to their ability to decrease hepatic lipogenesis
by inhibiting gene expression of key enzymes involved in TG-synthesizing (acetyl-CoA
carboxylase-1 and fatty-acid synthase)143, 155. The HMH2 and HMH3 contains ω-3 PUFA
and notably EPA and DHA (see section 4.2.1.2), but no evidence of TG lowering effect was

78
reported in this study. So, in the light of these results, it would be interesting to test HMH
products in a rat model with a higher dose (400mg/kg).

Glucose and insulin sensitivity

The glucose tolerance was tested with the oGTT after 12h of fasting. The HMH2 and HMH3
decreased significantly the glycaemia in mice 15min after the ingestion of a bolus of glucose
by 13.6% and 11% respectively. However, the insulin production during oGTTs was not
increased by HMH supplementation and no improvements were observed during the ITT.
Moreover, no changes in the body weight were reported for all supplementation groups, and
the improvement of the glucose tolerance cannot be explained by weight and/or adipose
tissues losses. Indeed, Chevrier et al.9 also reported a glucose-lowering effect by peptides
from salmon hydrolysate in mice without increase of insulin secretion. The authors explained
this result in part by the reduction of the body weight and also by the inhibition of the
mTORC1/S6K1/IRS pathway which allowed the increase of insulin signaling and glucose
uptake in myocyte and adipocytes231, 239. Moreover, it has been reported that the inhibition of
the mTORC1/S6K1 pathway also reduced the GLUT4 gene expression in adipocytes, an
important glucose transporter239. Several studies have linked the hypoglycemic effect of fish
peptides to their ability to stimulate the insulin secretion by different pathways: DPP-IV
inhibition or stimulation of the incretin hormone GLP-15, 170, 171. In our study, the insulin
secretion was not modulated by HMH products. According to these results, the improvement
of the glucose tolerance by HMH2 and HMH3 might be due to an improvement of the glucose
uptake by cells. Also, ω-3 PUFA and especially EPA and DHA have been reported to
improve the insulin resistance by the up-regulation of GLUT4 genes expression and its
translocation to the cell surface, increasing the glucose transport in the cell138, 240, 241. So, the
improvement of the glucose uptake in cells by HMH2 and HMH3 might be due to the
presence of bioactive peptides inhibiting the mTORC1/S6K1 pathway and/or the presence of
ω-3 PUFA up-regulating GLUT4 expression and its translocation.

Gut microbiota diversity

Since several years the role of the gut microbiota in numerous diseases have been
studied and its implication in the development of the metabolic disorder have been

79
highlighted by several authors107, 242. The ‘microbial organ’ have been associated to obesity,
insulin resistance, energy absorption, glucose and lipid metabolism117, 242-244. Moreover, it is
well known that the diet is an important regulator of the microbiota diversity which is able
to modulate the bacterial diversity and abundance245.

The gut microbiota diversity was measured by DNA extraction in faeces at t0 and t8
for each group followed by 16S RNA sequencing. A decrease of the diversity was observed
for all groups fed with HFHS. These community changes might be explained in part by the
increase of the Firmicutes to Bacteroidetes ratio with the HFHS diet, mainly due to a loss of
the Bacteroidetes population, but these changes are mainly explained by the increase of the
order Verrucomicrobiales. The dysbiosis is a known phenomenon in mice fed with this diet
but also in humans with obesity and/or type 2 diabetes117, 244. Le Chatelier et al.120 have
reported that low bacteria richness was characterized by an overall adiposity, insulin
resistance, dyslipidemia and a more pronounced inflammatory phenotype. Moreover, even if
the change of the F/B ratio is associated with obesity (increase of Firmicutes and decrease of
Bacteroidetes), this observation is contested, and the inverse was also reported117, 244, 246.

The Lactobacillus population was decrease by the HFHS diet compared to chow. While the
abundance of the Lactobacillus was also increased by the HMH2 versus the HFHS group
control. Several species of Lactobacillus have been used as probiotic strains and have shown
beneficial effects for the MetS such as the reduction of body weight and fat tissues and to
improve insulin resistance and dislipidemia242, 247-249
. For example, L. reuteri improved
obesity development in rats showing an increase of GLUT4 gene expression in WAT,
indicating an improvement of the glucose metabolism247. Another strain, L. rhamnosus
enhanced the glucose tolerance in mice fed with a high fat diet. The authors explained this
improvement by a decrease in gluconeogenesis (suppression of G6Pase and PEPCK
expression) and an increase of glucose uptake in the skeletal muscle (GLUT4 mRNA
expression)250. In our study, the glucose tolerance was also enhanced by HMH2 and HMH3
but without an increase in insulin production, highlighting a potential improvement of the
glucose uptake by these products. Thus, it would be necessary to identify more precisely the
specie of Lactobacillus in the present study.

80
 In vitro bioactivities

No modulation of the glucose uptake in L6 muscle cells were reported. The improvement of
the glucose tolerance by HMH2 and HMH3 in mice, may be takes place in other organ than
muscle (liver, adipose tissues).

The nitrite oxide concentrations were decreased by HMH2 and HMH3 (16% and 17%
respectively) revealing their anti-inflammatory effect by inhibiting iNOS activity. Anti-
inflammatory peptides from fish hydrolysate have already been identified. Ahn et al.251
identified the peptide PAY from salmon by-product hydrolysate which decreased the NO
production in LPS-stimulated macrophage and inhibited the production of pro-inflammatory
cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-1β. The presence of small anti-inflammatory peptides
in salmon hydrolysate has also been reported by Chevrier et al.231 which measured a decrease
of the nitrite oxide production in macrophage. However, HMH3 is also composed of
astaxanthin (table 3-1). This carotenoid is well known for its antioxidant activity, but some
studies have also reported its beneficial effect in the inflammation252-254. Lee et al.253 reported
an inhibition of NO production by astaxanthin with an IC50 of 5µM in macrophage stimulated
by LPS. Moreover, astaxanthin was also able to inhibit the expression of COX2.
Consequently, the anti-inflammatory effect of HMH2 might be due to the presence of
bioactive peptides and/or astaxanthin for HMH3.

Conclusion
For the first time, herring milt hydrolysate (HMH) products were used as supplementation to
a HFHS diet in mice to evaluate their potential benefits in the MetS development. The
glucose tolerance was improved by HMH2 and HMH3 without increasing the insulin
production, suggesting an enhancement of the glucose uptake by cells. HMH are complex
mixes in which several compounds might be involved, as bioactive peptides inhibiting the
mTORC1/S6K1 pathway and/or ω-3 PUFA up-regulating GLUT4 expression and its
translocation. Moreover, the protection against the disappearance of the Lactobacillus by
HMH2 might also have contributed to the improvement of the glucose tolerance. However,
other studies are needed to determine the potential bioactivities of HMH products. It would
be interesting to test the products at higher concentration during a longer time. Moreover,

81
analyses in other tissues as the liver or the adipose tissue, seem interesting for the future
studies. Finally, HMH2 and HMH3 also presented an anti-inflammatory activity by
inhibiting the iNOS pathway. Finally, herring milt hydrolysates modulate some parameters
involved in MetS development as the glucose tolerance, the microbiota diversity and the in
vitro inflammation.

Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Research Council of
Canada (NSERC) and the NSERC Industrial Research Chair on «Electromembrane processes
aiming the ecoefficiency improvement of biofood production lines» [Grant IRCPJ 492889-
15 to Laurent Bazinet]. The authors also thanks Joanie Dupont-Morissette, Jenny Rancourt-
Mercier, Jacinthe Julien and Christine Dallaire for their help for the animal study and Bruno
Marcotte for his advises for the cell cultures.

82
Atteinte des objectifs et avancement des connaissances
L’objectif de cette étude qui était d’évaluer les bioactivités potentielles de trois produits
industriels d’hydrolysats de laitance de hareng in vivo et in vitro a donc été atteint. En effet
la supplémentation avec deux produits d’HMH (HMH2 et HMH3) a amélioré la tolérance au
glucose chez des souris obèses. Cependant, la sensibilité à l’insuline n’ayant pas été modulée,
cela soulève l’hypothèse de l’activation d’une autre voie impliquée dans le métabolisme du
glucose. La présence de composés actifs comme les AGPI et les PB a donc permis
l’activation de la captation du glucose par les cellules directement. De plus, le produit HMH2
a permis la prévention de la perte de la population bactérienne de Lactobacillus dans le
microbiote intestinale induite par la diète HFHS. Le microbiote intestinal et la mise en place
d’une dysbiose chez les personnes obèses, sont aussi responsables du désordre métabolique.
Des études ont montré que l’utilisation de probiotiques, comme certaines espèces de
Lactobacillus, permettait d’améliorer la tolérance au glucose. Ainsi, dans cette étude, une
supplémentation à une faible dose (1g/jour) permettrait de limiter certains paramètres
physiologiques impliqués dans le développement du MetS. Cependant, l’action des composés
bioactifs présents dans les produits HMHs reste encore à être étudiée. De plus, HMH2 et
HMH3 ont aussi montré des activités anti-inflammatoires in vitro. Il serait donc essentiel
d’évaluer cette bioactivité in vivo dans des organes cibles comme le foie ou le tissu adipeux.
Ce chapitre a donc permis de répondre au premier objectif intitulé : évaluation de l’effet
bénéfique potentiel de trois produits industriels d’hydrolysat de laitance de hareng sur
certaines fonctions physiologiques associées au développement du MetS.

Ces résultats ont ainsi contribué à l’avancement des connaissances scientifiques sur l’effet
bénéfique sur la santé humaine d’hydrolysats de laitance de hareng. Ils ont ainsi permis de
cibler pour la première fois des bioactivités importantes dans le MetS et d’établir un criblage
pour les recherches futures pour l’utilisation de ces produits. Ainsi la captation du glucose et
l’inflammation semblent être modulées par les composés actifs, AGPI et PB, présents dans
ces matrices complexes.

83
CHAPITRE 4 : Double séparation simultanée de molécules
anioniques et cationiques d’un hydrolysat de laitance de
hareng et impact des activités biologiques des fractions
générées.

L’article présenté dans ce chapitre s’intitule :

«Simultaneous double cationic and anionic molecule separation from herring milt
hydrolysate and impact on resulting fraction bioactivities.» Accepté et publié dans
«Separation and Purification Technology 210 (2019) 431-441».

Les auteurs sont : Rachel Durand (Candidat Ph.D : planification et réalisation des
expériences, analyse des résultats et rédaction de l’article), Erwann Fraboulet (Codirecteur
de thèse, supervision scientifique, correction et révision de l’article), André Marette
(Collaborateur scientifique du projet, correction et révision de l’article) et Laurent Bazinet
(Directeur de thèse, planification des expériences, supervision scientifique, correction et
révision de l’article).

84
Transition contextuelle
Le chapitre précédent a mis en évidence la présence de composés bioactifs (AGPI et PB)
dans différent hydrolysats de laitance de hareng. Cependant, les molécules responsables de
ces bioactivités n’ont pas pu être identifiées dû à la complexité des matrices. De plus, la revue
de bibliographie a révélé l’importance des méthodes de fractionnement d’hydrolysats
peptidiques pour l’identification des PB mais aussi pour l’augmentation et/ou l’activation
d’activités biologiques. En effet, la séquence en AA ainsi que le poids moléculaire des
peptides, sont des paramètres importants pour les activités biologiques. De plus, la séparation
par électrodialyse avec membrane d’ultrafiltration (EDUF) d’hydrolysats marins (crabe des
neiges et saumon), a permis la production de fractions cationiques ou anioniques, présentant
des activités biologiques supérieures à l’hydrolysat initial. Le produit HMH2 contient des
lipides mais aussi des peptides de faible poids moléculaires. Or, il a été démontré que des
peptides de saumon de faibles poids moléculaires (<1kDa), augmentaient la captation du
glucose in vitro. Ainsi, l’objectif de ce chapitre sera d’étudier l’effet d’un fractionnement
multiple par EDUF sur une matrice complexe d’hydrolysat de laitance (HMH2), afin
d’évaluer les bioactivités in vitro et d’identifier si possible les composés actifs. De plus, la
caractérisation chimique de l’hydrolysat initial ainsi que les fractions de récupération
d’EDUF sera aussi réalisée dans ce chapitre.

85
Résumé
L’augmentation de la consommation de poisson est liée à la production de co-produits, riches
en composés à haute valeur ajoutée comme les protéines, les vitamines, les minéraux ou les
lipides. Un hydrolysat de laitance de hareng contenant différentes molécules, a été fractionné
par une nouvelle configuration d’électrodialyse avec membranes d’ultrafiltration (EDUF),
utilisant quatre membranes d’ultrafiltration consécutives et permettant un double
fractionnement simultané des molécules cationiques et anioniques. Quatre fractions ont été
récupérées, chacune concentrée en composés de faible poids moléculaire (< 800Da). De plus,
des acides aminés présents en forte concentration et représentant 20% de l’hydrolysat initial,
ont été concentrés ainsi que des peptides dans des fractions spécifiques. Les fractions
anioniques présentaient une forte concentration en acides aminés acides (Glu et Asp), alors
que les fractions cationiques étaient concentrées en acides aminés basiques (Arg et Lys). De
plus, il a été démontré que l’EDUF a permis la modulation d’activité biologiques, comme
l’augmentation de 27,5% de la captation du glucose par des cellules musculaires L6 par
l’hydrolysat final et l’augmentation de 214% de l’activité antioxydante par une des fractions
anioniques. L’EDUF semble être un procédé effectif pour la production de fractions
présentant des bioactivités utiles pour la prévention de plusieurs maladies comme le
syndrome métabolique.

Mots Clefs : électrodialyse, membranes d’ultrafiltration, hydrolysat de laitance de hareng,

fractions peptidiques anioniques et cationiques, activité antidiabétique, activité antioxydante.

86
Abstract
The increase in fish consumption, over the last twenty years, is linked to by-product
production, rich in valuable compounds such as proteins, vitamins, minerals or lipids
(omega-3). Milt herring hydrolysate, containing of different molecules, has been fractionated
by electrodialysis with ultrafiltration membrane (EDUF) in a new configuration using four
ultrafiltration membranes, allowing a simultaneous and double fractionation of anionic and
cationic molecules. Four fractions were recovered, each were concentrated in compounds of
low molecular weight (< 800Da). Furthermore, free amino acids present at high
concentrations and representing 20% of the initial hydrolysate were demonstrated for the first
time to be concentrated as well as peptides in some specific recovery fractions. Anionic
fractions presented a high population of acidic amino acids (Glu, Asp) whereas cationic
fractions were concentrated in basic amino acids (Arg, Lys). In addition, it was demonstrated
that EDUF allowed the modulation of biological activities, such as an enhancement of 27.5%
in glucose uptake by L6 cells reported for the final hydrolysate and an increase of 214% of
the antioxidant activity of one anionic fraction. EDUF appeared as an effective way to
generate fractions with valuable bioactivities which could be used for the prevention of some
diseases such as metabolic syndrome.

Keywords : electrodialysis, membrane filtration, herring milt hydrolysate, anionic and

cationic peptide fractions, antidiabetic activity, antioxidant activity.

87
 Introduction
Beneficial effects of seafood and specifically fish have been well known since many years,
due to their good balance in essential amino acids and fatty acids1. The increasing fish
consumption by the world population, generates a large quantity of by-products representing
up to 60% of the initial product depending on the type of fish2, 255. These by-products pooled
the head, skin, milt, viscera or bones of fish and contains high value molecules such as
protein, gelatin, peptide, polyunsaturated fatty acids (PUFAs), vitamins or pigments
(astaxanthin)2. Optimizing the utilization of these fish by-products would be an ecological,
economic and social issue. Enzymatic hydrolysis is one of the major way used to promote
fish protein by producing bioactive peptides. Several studies have reported the improvement
of some biological activities by fish peptides such as antioxidant, antibacterial,
antihypertensive or anticancer properties68, 183, 195, 197, 256. Recently, Chevrier et al.9 reported
that small peptides from salmon protein enhance glucose uptake by L6 myocytes and
prevents glucose intolerance, adipose tissue inflammation and dyslipidemia in mice fed with
a high-fat and high-sucrose diet. This suggests that fish peptides could be used in the
prevention of type 2 diabetes and metabolic syndrome.

However, fish hydrolysates are a complex mixture of peptides with different molecular
weights and amino acids composition11, 12. Moreover, peptide bioactivities are linked to both
weight and amino acid (AA) composition, so purification and concentration steps are
required11, 12. Indeed, Picot et al.12 reported an increase of calcitonin-gene-related-peptide
like activity by the permeate fraction after ultrafiltration of a fish hydrolysate. They also
reported that antioxidant activity was mainly depending on amino acid composition12.
Nowadays, pressure driven and chromatographic methods are principally used by industrials.
However, pressure driven technics separate compounds only according to their molecular
weights and are subjected to membrane fouling which limits peptide selectivity11, 12, 257.
Rather, chromatographic processes using physicochemical properties, are very selective but
they consume solvent and can only treat small volume of product. Recently, electrodialysis
with ultrafiltration membranes (EDUF) was used for the separation of several marine protein
hydrolysates15, 17, 214. This green technology allows separation and concentration of bioactive
peptides according to their charges under electric field and their molecular weights (MW)13.

88
This double selection enables a higher selection of peptides. In addition, different molecular
weight cut off (MWCO) of ultrafiltration membranes (UFs) could be used during the process
to increase selectivity. Roblet et al.17 reported the in vitro improvement of glucose uptake by
salmon peptide after electroseparation by EDUF. The authors also demonstrated the capacity
of EDUF to remove inhibiting peptides and/or to concentrate antidiabetic peptides in the final
fraction. Furthermore, EDUF is an ecoefficient process using no solvent except water and
electricity as power.

In this context, the aims of this work were to 1) characterize the composition of milt herring
hydrolysate and its EDUF fractions; 2) evaluate the double and simultaneous separation of
compounds of herring milt hydrolysate by their charges and molecular weights and 3) test
valuables biological efficiencies of this fishery by-product on different in vitro experiments
(glucose uptake and antioxidant activity) in order to increase the value of herring milt
hydrolysate.

Materials and methods

Material

Chemicals

Sodium sulphate (Na2SO4) was purchased from Laboratoire MAT (Québec, QC, Canada),
potassium chloride (KCl) from ACP Inc (Montreal, QC, Canada), sodium chloride (NaCl)
from VWR international (Montreal, QC, Canada), calcium chloride (CaCl2), HEPES-Na,
magnesium sulfate (MgSO4), 2-déoxy-D-glucose, sodium phosphate monobasic, fluorescein
and 2,2’-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) were obtained from Sigma
Aldrich (Oakville, ON, Canada) acetonitrile optima® LC/MS, 1.0 M NaOH solutions from
Fisher Scientific (Montreal, QC, Canada), and trifluoroacetic acid from J.T. Baker
(Philipsburg, NJ, USA). Polyvinylidene fluoride (PVDF) filters were obtained from
Chromatographic Specialities Inc (Brockville, ON, Canada). HiClone™ Bovine Growth
Serum (BGS) was purchased from GE Healthcare Life Sciences (Logan, UT, USA), Alpha-
Minimal Essential Medium (α-MEM) was obtained from Invitrogen (Burlington, ON,
Canada). D-2deoxy-[3H] glucose was obtained from Perkin Elmer (Woodbridge, ON,
Canada) and insulin from CHUL’s pharmacy (Québec, QC, Canada). Pierce® BCA Protein

89
Assay and micro BCA Protein Assay from Pierce Biotechnology (Rockford, IL, USA). L6
skeletal muscle cell line, derived from neonatal rat thigh skeletal muscle, was provided by
Dr.A.Klip, Hospital for Sick Children (Toronto, ON, Canada).

Milt herring hydrolysate

The initial hydrolysate (IH) was obtained from Ocean NutraSciences (Matane, QC, Canada).
Briefly, herring milt was hydrolyzed by a mix of enzymes (duration, temperature and
enzymes are confidential). The liquid was then filtrated on ultrafiltration (UF) membranes
(MWCO confidential), the retentate was dried by atomization to obtain a fine powder. The
chemical composition of the herring milt hydrolysate is presented in table 4-1.

Table 4-1: Chemical composition of the herring milt hydrolysate.

Composition in
dry powder Total nitrogen Peptides Nucleic acids Lipids Ashes
(%)

Initial
Hydrolysate
79.27 ± 0.17 48.28 ± 0.44 27.30 ± 3.57 18.48 ± 1.27 11.55 ± 0.20
(g/100g dry
weight)

Electrodialysis material

The electrodialysis cell used for the peptide separation was a MP type cell (100 cm² of
effective area) manufactured by Electrocell AB (Taby, Sweden) configured with one
Neosepta AMX-SB anionic exchange membrane (AEM, Astom ltd, Tokyo, Japan), one
Neosepta CMX-SB cationic exchange membrane (CEM, Astom ltd Ltd, Tokyo, Japan), 2
ultrafiltration membranes with a MWCO of 50 kDa (Synder Filtration, Vacaville, CA, USA)
with an average thickness and conductivity of 0.19 mm ± 0.003 mm and 6.32 mS/cm ± 0.43
mS/cm, and 2 ultrafiltration membranes with a MWCO of 20 kDa (Synder Filtration,
Vacaville, CA, USA) with an average thickness and conductivity of 0.19 mm ± 0.003 mm
and 4.93 mS/cm ± 1.10 mS/cm. The 4 UF membranes were made of polyether sulphone
(PES).

90
 Electrodialysis cell configuration

The separation by electrodialysis was performed by four UF membranes and two ion-
exchange membranes as indicated in figure 4-1. The UF membrane with a MWCO of 20 kDa
placed near the anode was named UF 1 while the one with a MWCO of 50 kDa placed at the
left of the feed solution was named UF 2. The UF membrane with a MWCO of 20 kDa placed
near the cathode was named UF 4 while the one with a MWCO of 50 kDa placed at the right
of the feed solution was named UF 3. The ED configuration presented in figure 4-1 consisted
of six compartments. The central one was the initial hydrolysate (IH) solution composed of
dry milt herring hydrolysate, dissolved to 4% of protein (W/V) in water overnight at 4°C.
Four compartments containing a KCl solution (2g/L), were used for peptide recovery. Two
anionic peptide recovery compartments were formed: the KCl solution placed between the
AEM and UF 1 was named anionic recovery compartment 2 (ARC2) while the KCl solution
located between the UF 1 and the UF 2 was named ARC1. In the same way, two cationic
peptide recovery compartments were formed: the KCl solution placed between the CEM and
UF 4 was named cationic recovery compartment 2 (CRC2) while the KCl solution located
between the UF 4 and the UF 3 was named CRC1. The last compartment contained the
electrolyte solution which circulated between each electrode. It was the first time that such a
complex configuration was used for peptide electroseparation. The solutions were circulated
using six centrifugal pumps and the flow rates were controlled by flow meters at 3L/min for
the ARC1, CRC1 and feed solution, at 0.6L/min for the ARC2 and CRC2 solutions. The
electroseparation was performed at a constant electric field strength of 5.6V/cm during a
period of 4h at a controlled temperature ranging between 10°C and 15°C. The pH of the feed
and KCl solutions was adjusted at 7 with 1.0 M HCl or NaOH and kept constant throughout
the treatment in order to maintain the peptide electromigration214. The conductivity of the 4
recovery solutions was also adjusted with KCl powder at 3000µs per cm and maintained
constant during the treatment to maintain a linear migration of peptides214. After four
repetitions, each compartment was freeze-dried and analyzed to check for the reproducibility
before pooling the same fraction for the four repetitions. 2mL samples of feed and peptide
recovery compartments were collected before applying voltage and at 30, 60, 80, 120 and
240min. Following each treatment, the stack was rinsed with 0.1N HCl solution and 0.1N
NaOH solution.

91
Figure 4-1: Configuration of the peptide separation by electrodialysis with ultrafiltration membrane
cell; P+: cationic peptides, P-: anionic peptides, P-/+: neutral peptides, AEM: anion-exchange
membrane, CEM: cation-exchange membrane, UF: ultrafiltration membrane.

Analyses

pH

A pH-meter model SP20 (Thermo Orion, West Chester, PA, USA) equipped with a VWR
Symphony epoxy gel combination pH electrode (Montreal, QC, Canada) was used to
measure the pH of recovery and feed solutions.

92
 Conductivity

The conductivities of recovery and feed solutions were measured using a YSI conductivity
meter (Model 3100) equipped with a YSI immersion probe model 3252, cell constant K=1
cm-1 (Yellow Springs Instrument CO., Yellow Springs, OH, USA).

Peptide concentration in liquid samples.

The total concentration of peptide into liquid samples of the four recovery fractions (ARC1,
ARC2, CRC1, CRC2) was determined using the microBCA protein assay. The analyses were
conducted as recommended by the manufacturer. Briefly, 25µL of sample were mixed with
200µL of working reagent directly into microplate, and then incubated 2h at 37°C. The
absorbance of solutions was read at 562nm with a spectrophotometer (Thermomax,
molecular Devices, Sunyvales, CA, USA). Finally, the peptide concentration was determined
using calibration curve in the range of 0-40 µg/mL of BSA.

Migration rate.

The final migration rate (g of peptide/m²h) was calculated at the end of the experiment using
Eq (4-1) and using the final amount of peptides (g) determined previously by the microBCA
method, the ultrafiltration membrane surface used for the electroseparation (m²) and the
duration of the experiment (h).

𝑃𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒 (𝑔)
𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑚𝑖𝑔𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑟𝑎𝑡𝑒 = , (4-1)
𝑠𝑢𝑟𝑓𝑎𝑐𝑒 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑒 (𝑚2 )×𝑡𝑖𝑚𝑒 (ℎ)

Nucleic acid concentration in dry samples

The concentration of nucleic acids in dry powder was performed following an extraction by
phenol-chloroform adapted from Chamberland et al.258. Briefly, the powder samples were
mixed with TE buffer (50 mmol/L Tris HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8) and SDS 10% solution
into a microtube. Then ½ volume of phenol was strongly mixed with ½ volume of
chloroform. After centrifugation at 13000g, the supernatant was washed with 1 volume of
chloroform. This step was repeated until a clear solution was obtained. Nucleic acids were
precipitated with 2 volumes of cold ethanol 100% and microtubes were placed 2h at -20°C.
The pellet was recovered after centrifugation at 15000g and washed twice with 1 volume of

93
ice-cold 70% ethanol and dried. After dilution of the pellet, nucleic acids were measured
using a NanoDrop (NanoDrop technologies, Wilmington, Delaware, USA). Nucleic acid
extractions were done in three replicates for each recovery fractions (ARC1, ARC2, CRC1, CRC2)
as well as for initial and final hydrolysate (IH, FH).

Total peptide concentration in dry samples

To obtain the final concentration of peptide in each peptide recovery compartment (ARC1,
ARC2, CRC1, CRC2) as well as in initial (IH) and final (FH) hydrolysates, the total nitrogen
content was measured by combustion of 100mg sample powder using a LECO-FP528 carbon
and nitrogen analyzer (LECO, St. Joseph, Michigan). For each sample the content of nitrogen
coming from nucleic acids was removed and nitrogen concentration obtained in the samples
were converted into peptide percentage by multiplying by a 6.25 factor, the value commonly
used for crude fish proteins15.

Relative energy consumption

The energy consumed (E) in Wh was calculated using Eq (4-2).

𝑡4
E = ∫𝑡0 𝑈(𝑡) 𝐼(𝑡) 𝑑𝑡 (4-2)

Where E is the energy consumed (Wh), U is the voltage (V), I is the current intensity (A) and
dt is the time interval (h).

The relative energy consumption (ER) in Wh/g of peptide represents the energy used to
separate 1g of peptides and was measured at the end of the experiment by dividing the energy
consumed by the total amount of peptides (g) using Eq (4-3).

𝐸
ER = (4-3)
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑎𝑚𝑜𝑢𝑛𝑡 𝑜𝑓 𝑝𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒

Molecular weight peptide distribution.

4.2.3.8.1 Initial and Final hydrolysates.

The molecular weight (MW) distribution was performed for IH and FH by gel permeation
chromatography (GPC) on a Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare, Baie-D'Urfé,

94
Qc, Canada) using a fast protein liquid chromatography system (FPLC Akta Avant, GE
Healthcare, Baie-D'Urfé, QC, Canada). Firstly, according to supplier instructions, the column
was calibrated with proteins of known MW as reference samples. The mobile phase consisted
of 50 mM sodium phosphate buffer containing 150 mM of NaCl at pH 7.0. Bovine serum
albumin (0.650 mg/mL), ribonuclease A (0.200 mg/mL), aprotinin (0.200 mg/mL), and
vitamin B12 (0.050 mg/mL) (Sigma, Oakville, ON, Canada) were mixed together before
injected (0.1 mL) on the column for the calibration. This yielded a near linear correlation
between the retention time and the log of molecular mass of proteins in the range of 67000
kDa and 1355 Da.

Briefly, IH and FH were solubilized at 1mg/mL with the mobile phase and then were injected
(500 µL) on the column. Samples were eluted (isocratic) at a flow rate of 0.8 mL/min.
Proteins were detected by monitoring absorbance at 214 nm.

4.2.3.8.2 Recovery fractions.

Reverse phase ultra-performance liquid chromatography (RP-UPLC) analyses were

performed on recovery fractions using a 1290 Infinity II UPLC (Agilent Technologies, Santa
Clara, CA, USA). The equipment consisted of a binary pump (G7120A), a multisampler
(G7167B), an in-line degasser and a variable wavelength detector (VWD G7114B) adjusted
to 214 nm. Peptides were diluted at 1mg/mL for the ARC1, ARC2, CRC1 and CRC2 solutions.
Solutions were filtered through 0.22µm PVDF filter into a glass vial. The sample was loaded
(10µL) onto an Acquity UPLC CSH 130 1.7µm C18 column (2.1mm i.d.×150mm, Waters
Corporation, Milford, MA, USA). The column was operated at a flow rate of 400µL/min at
45°C. A linear gradient consisting of solvent A (LC-MS grade water with 0.1% formic acid)
and solvent B (LC-MS grade ACN with 0.1% formic acid) was applied with solvent B going
from 2% to 45% in 40 min holding until 42 min, then back to initial conditions until 45min.
Each sample was run in triplicate for statistical evaluation of technical reproducibility.

A hybrid ion mobility quadrupole TOF (time of flight) mass spectrometer (6560 high
definition mass spectrometry (IM-Q-TOF), Agilent, Santa Clara, USA) was used to identify
and quantify the relative abundances of the tryptic peptides. All LC-MS/MS experiments
were acquired using Q-TOF. Signals were recorded in positive mode at Extended Dynamic

95
Range, 2Ghz, 3200m/z with a scan range between 100–3200m/z. Nitrogen was used as the
drying gas at 13.0 L/min and 150°C, and as nebulizer gas at 30psig. The capillary voltage
was set at 3500 V, the nozzle voltage at 300 V and the fragmentor at 400 V. The instrument
was calibrated using an ESI-L low concentration tuning mix (G1969-85000, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, USA). Data acquisition and analysis were carried out using
the Agilent Mass Hunter Software package (LC/MS Data Acquisition, Version B.07.00 and
Qualitative Analysis for IM-MS, Version B.07.00 with BioConfirm Software).

Amino acid composition

The total amino acid composition was determined on each dry recovery fraction (ARC1, ARC2,
CRC1, CRC2), IH and FH by the AccTag amino acid analysis method (Waters, Mississauga,
ON, Canada). This procedure was used for the determination of amino acids resistant to
acidic hydrolysis (including taurine) previously described by Beaulieu et al.259. Briefly, the
amino acids were separated by RP-HPLC and quantified by fluorescence detection. For the
tryptophan, which is an amino acid sensitive to acid hydrolysis, an alkaline hydrolysis was
performed and it was separated by HPLC (Alliance Waters e2695 separation module). Also,
free amino acids were quantified by fluorescence directly in solution after separation by RP-
HPLC.

Total lipid content and fatty acid composition

Lipid content was analyzed using Folch232 extraction method, on initial hydrolysate (IH) and
final hydrolysate (FH) samples only. Indeed, due to low amount of powder and low yield of
lipid recovery in recovery fraction (< 0.5%), lipid analyses were not possible on these
fractions. Briefly, 1g of dry sample was mixed with methanol/chloroform (1:2 v/v). After
separation in two phases, the organic layer was recovered and dried by evaporation using
rotavapor. The final mass of lipid was weighed and the lipid amount was calculated using Eq
(4-4).

𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡(𝑔)
% 𝑙𝑖𝑝𝑖𝑑 = 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝑤𝑒𝑖𝑔ℎ𝑡 (𝑔) × 100 (4-4)

Fatty acids methyl esther (FAMEs) after methylation by sodium methoxide, were analyzed
by gas liquid chromatography (GC-2010 Plus Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). Samples were

96
injected onto capillary column (60m × 0.25mm; 0.25mm film thickness, SGE, Austin, Texas)
and detected by flame ionization. Temperature column was initially set at 60°C for 1 min,
then increased to 190°C at 10°C/min during 15 min and finally increased to 200°C at
5°C/min. Detector was set at 250°C. Standards FAMEs (GLC-502, GLC-607, Nu-Chek Prep,
Elysian, MN) were used in same conditions. Analyses were realized in two replicates.

Antioxidant activity

Antioxidant activity was measured by the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay
on liquid sample at 1mg/mL of peptides in triplicate as described by Wu et al.260 Briefly,
samples were mixed with phosphate buffer at 0.075M (pH 7). Trolox standards were used at
6.25, 12.5, 25 and 50µM. In a microplate, 20µL of samples or Trolox standard were added
with 200µL of fluorescein solution and 75µL of AAPH solution were automatically added in
the fluorimeter (Fluostar OMEGA, BMG Labtech, Ortenberg, Germany) to start the
oxidation reaction. The excitation wavelength was 485nm with an emission wavelength of
520nm. Results were expressed as micromoles of Trolox equivalent per gram of peptide
(µmol TE/g).

Glucose uptake bioactivity

The glucose uptake bioactivity was conducted on L6 skeletal muscle cells grow in α-MEM
media enriched with 10% (v/v) of GBS in an atmosphere of 5% CO2 at 37°C261. Cells were
plated in 24-wells plates at 25000 cells/mL, then their differentiation into myotube was
induced by media change at 2% (v/v) of GBS. Myotubes were deprived of GBS 4h before
the treatment to optimize the glucose uptake by the cells. Each fraction was added at 1µg/mL
or 1ng/mL of total nitrogen for 75 min, then half of the plate was stimulated by insulin at 1
10-5 M for 45min. Glucose uptake assay was performed as described previously234. Briefly,
cells were rinsed with 20nM HEPES buffer and incubated 8 min in HEPES-buffered solution
containing 10µM 2-deoxyglucose and 0.3 µCi/mL 2-deoxy-[3] glucose. Transport solution
was removed and cells were rinsed with 0.9% (v/v) NaCl and lysed with 500µL of 50nM
NaOH. Radioactivity was determined by scintillation counting (DPM) in 400µL of sample
solution. Finally, glucose uptake was calculated in pmol/min.mg of protein (BCA assay)
using Eq (4-5):

97
 𝐷𝑃𝑀 (𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒)
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑢𝑝𝑡𝑎𝑘𝑒 = (4-5)
𝐶×𝐷𝑃𝑀 (2𝐷𝐺)×𝑡

where DPM was the number of disintegrations per minute for the sample (sample) or the
radioactive 2-deoxy-[3] glucose solution (2DG), C is the concentration of protein (mg) of the
sample and t is the incubation time (min). For each sample, at least nine repetitions were
conducted.

Statistical analyses

For each statistical test, the normality and the residues distribution were controlled by SAS
software version 9.3 (SAS institute Inc, Cary