Microbiologie - PDF Version 1

15/09/2009
Licences 3ème année BPE et BPN– SV14B Microbiologie

I) Domaine et histoire
de la microbiologie
II) Manipulations
Techniques microbiologiques
aseptiques,
stérilisation
: applications en écologie et
biotechnologie
III) Méthodes et milieux
de cultures
IV) Identification des

micro-organismes
V) Techniques de
dénombrement
VI) Activités
Dr R. Gros
VII) Génétique Laboratoire d’Ecologie Microbienne
1
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Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie
I.1) Domaine de la microbiologie
I 1 1) Ecologie microbienne
I.1.1)
L'écologie est la science qui étudie les interactions qui existent

entre les êtres vivants et leur milieu
La microbiologie est la science qui étudie les organismes dont la

taille est de l’ordre du micromètre (bactéries, champignons, virus…)
L’écologie microbienne est la science qui étudie les interactions

existantes entre les micro-organismes et leur milieu, entre les micro-
organismes eux-mêmes ainsi qu’entre les micro-organismes et les
organismes supérieurs végétaux et animaux
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Quels sont les objectifs

de l’écologie
l écologie microbienne?
1. Identifier et comprendre la répartition des micro-organismes dans les
différents écosystèmes
2. Quelle est leur abondance relative ?
3. Quelles sont leurs fonctions dans l(es)’écosystèmes(s)?
4. Comment les micro-organismes changent ou transforment

chimiquement et physiquement l’environnement ?
5. Comment survivent-ils ?
6. Qu’est ce qui contrôle leur activité et leur abondance?
7. Quel rôle jouent-ils dans les cycles biogéochimiques ?
3
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O é
Océanographie
hi Limnologie
Li l i
Microbiologie
Pédologie
Ecologie Ecologie microbienne Chimie
Médecine Agronomie
Statistiques
4
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Fondamentaux à Notions importantes à

connaître découvrir ou à approfondir
Rôle dans les cycles

Les différents types nutritionnels biogéochimiques
Le métabolisme
Interactions microbes/milieu
Croissance, production d’énergie, biosynthèse
La génétique microbienne
Interactions biologiques
Relations diversités /
fonctions
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Cycles biogéochimiques : carbone
CO2 Chimioautotrophes
méthanogènes phototrophes
H2O CH4
FERMENTATION
RESPIRATION méthylotrophes
O2
Algues,
Biomasse
Animaux Bactéries,
microbienne NUTRITION NUTRITION
plantes
méthylotrophes
FERMENTATION Excrétion
Mort / dégradation
CH4
NUTRITION méthanogènes
Mort / dégradation
Hétérotrophes
Réserve de
(Minéralisation) C organique
C organique
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Interactions microbes/milieu
Le pH
pH
Acide 0
La température 1 Acidophiles
5 Thermophiles 2 extrêmes
Mésophiles Hyperthermophiles
4 3
sance
4 Acidophiles
Taux de croiss
3
Psychrophiles
2
5
6
1
7 Neutrophiles
0 15 30 45 60 75 90 105 120
8
Température en °C
9
10
Alcalinophiles
11
12
Alcalinophiles
13 extrêmes
Basique 14
7
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La pression La salinité
Barophiles Barophiles Halophiles
faibles extrêmes faibles = bactéries marines
Halophiles extrêmes
Barophiles 5
5 Halophiles
modérés modérées
4
Taux de croissance
ux de croissance
4
3
3 2
1
2
Tau
1bar par 10m 1 2 3 4 5

saturation
1
de profondeur NaCl en moles par litres
200 400 600 800 1000 1200

Pression en bars
Æ Stratégies adaptatives des micro-organismes
Æ Réponse des bactéries à une modification de l'environnement
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Interactions biologiques
Æ Microorganisme/microorganisme
Æ Microorganisme/végétaux
Æ Microorganisme/animaux
Symbiose :
Mutualisme, Commensalisme, Amensalisme
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Diversité/fonctions
Ecosystèmes = très grande hétérogénéité spatiale et temporelle
Niches écologiques nombreuses, habitats variés, ressources
importantes et diverses Æ très grande diversité bactérienne
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3 niveaux de biodiversité
Biodiversité Biodiversité Biodiversité des

génétique spécifique écosystèmes
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Dimensions de la biodiversité
La biodiversité à 3 dimensions :
-Composition (ce qui est présent) Composition Structure
-Structure (organisation des
éléments présents)
-Fonction (processus qui génèrent la
Fonction
biodiversité et affectent la structure
et la composition)
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Les enjeux :
• Recenser et inventorier les ressources biologiques, notamment dans les

milieux extrêmes
•Analyser et expliquer la diversité, prédire son évolution
•Bio-indicateurs
Bio indicateurs (réponse d’un
d un écosystème à un stress)
•Découverte de nouvelles molécules (intérêts biotechnologique et
sanitaire)
•Découverte de nouvelles fonctions (biotransformation, dépollution des
sols)
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I.1) Domaine de la microbiologie
I 1 2) Biotechnologie
I.1.2)
Ensemble des techniques et des procédés qui permettent de tirer profit

des organismes vivants. Une production biotechnologique peut se faire en
se servant d'organismes
d organismes intacts (levures
(levures, bactéries)
bactéries), ou en employant des
substances naturelles produites par des organismes (enzymes)
Choix du microorganisme ou de la communauté, manipulation des

microorganismes, contrôle des paramètres abiotiques et des
interactions biologiques Æ production industrielle
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I.1.2.1) Production et bioconversion de molécules
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I.1.2.2) Sélection et amélioration des souches
Fusion p
protoplastique
p q
Trichoderma hazianum KRL-AG2 Æ fongicide biologique
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Ingénierie génétique - technologie de l’ADN recombinant :

-Modification de l’expression du produit (rendement)
-Conception de protéines et substances
-Expression de gènes dans un autre organisme
Plasmide
VP1 Transcription inverse
Plasmide
recombinant
ARN ADN
VP1 VP1 Transformation
de E. Coli
clones
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I.2) Histoire de la microbiologie
1) Suspicions
Lucrèce (60 av. JC)
Girolamo Fracastoro (1546)
2) Premières observations
Anton van Leeuwenhoek (1676)
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3) Génération spontanée
John Needham (1748)
Lazzaro Spallanzani (1799)
Æ stérilisation
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Louis Pasteur (1861) Æ abandon définitif de la

génération spontanée
g
Æ Conservation, pasteurisation
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4) Transformation de la matière
Theodore Schwann (1837) Æ fermentation alcoolique
Pasteur (1857) Æ fermentation lactique, aérobie,
anaérobie
Sergei Winogradski (1887) Æ Chimiotrophie

Martinus Beijerinck t (1888) Æ fixation de l’azote
atmosphérique
Æ métabolisme, enrichissement, cultures sélectives, gel

de silice
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5) Théorie des infections par les germes

Agostino Bassi (1835) Æ parasitisme
Robert Koch (1876-1887) Æ Rôle des bactéries dans les maladies

Æ culture sur milieu gélosé
Æ Pétri
Æ postulat de Koch
Æ maladie du charbon (anthrax), tuberculose
(bacille de Koch), choléra
Pasteur (1880-1885) Æ vaccins charbon, cholera, rage
Puis tout s’accélère…
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Chapitre 2 : Manipulations aseptiques, stérilisation, conservation
2.1) Définitions normalisées
Stérilisation (AFNOR) : opération qui a pour objet de tuer tous les

micro-organismes contenus dans le milieu. L’état stérile d'un produit
se traduit par la probabilité d'au plus 1 sur 1 million de trouver un
germe viable ou revivifiable sur un produit.
Désinfection : action à visée anti-microbienne qqs le résultat, en

utilisant un produit dont les propriétés conduisent à une réduction
de 99,999% de la flore initiale (milieux inertes)
Décontamination : opération au résultat momentané, permettant de

tuer ou d’inhiber
d inhiber les micro-organismes
micro organismes en fonction des objectifs
fixés (matériel médical)
Antiseptie : opération au résultat momentané, au niveau des tissus

vivants, dans la limite de leur tolérance, permettant de tuer ou
d’inhiber les micro-organismes et virus
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2.2.) Méthodes physiques
1) Action de la température : solution aqueuse mort à

100°C ≠ milieu déshydraté (lipides thermostables 180°C)
Procédés :
•Chaleur Sèche (dénaturation de prot, 180°C-
60min, 160°C-2h)
•Chaleur Humide (dénaturation de prot, 134°C,
18min, 2 bars)
•Tyndallisation
•Pasteurisation (destruction de la presque totalité
de la flore banale, de la totalité de la flore
pathogène conservation des propriétés
pathogène,
organoleptiques
ÆPasteurisation haute T = 85°C-30sec-10°C,
ÆPasteurisation basse T = 70°C-qq minutes,
ÆPasteurisation UHT = 140°C-qq sec puis
refroidissement brutal)
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2) Actions des radiations :

•Rayons électromagnétiques, photoniques et électroniques
(quantité d’énergie cédée d’autant plus grande que la longueur
d’onde est petite)
ÆRayons ionisants (rayons gamma),
ÆRayons UV (photoniques),
ÆRayons électroniques (e-, X)
3) Filtration (10 µm – 5mµ)

4) Centrifugation (5000g)
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2.3.) Méthodes chimiques
Oxydation et dénaturation des protéines (Alcool : 50-70%, H2O2 :

3%, Chlore et dérivés (<3%), Iode, Hg, phénols : 0.5-2%)
Altération de la membrane cytoplasmique (agents liposolubles =

savon, détergents)
Action sur le métabolisme (respiration = fluorures, cyanures; ARN =

bleu de méthylène, violet de gentiane)
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2.4.) Conservation
• Réfrigération
• Conservation entre 4ºC (frigo)
• Méthode qui permet de ralentir le métabolisme bactérien sans tuer les
microorganismes.
• Permet de conserver des cultures bactériennes pendant un court laps de temps
• Congélation et surgélation
• Refroidir rapidement à des T° entre –50 et –95 ºC ( - 18º C pour congélation).
Conservation pour une plus longue période
• Conservation des bactéries et des virus
• Culture microbienne p pure en suspension
p dans un liquide
q
• Aucune activité métabolique ; développement totalement bloqué mais la
plupart des cellules restent vivantes.
• Permet de décongeler la culture et de la faire croître, même après plusieurs
années.
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•Lyophilisation
• Congélation rapide d’une suspension microbienne à des T° entre –54
et -72ºC
72ºC tout en éliminant l’eau par la création d’un vide ce qui donne
une poudre.
• Récipient scellé sous vide.
• Les bactéries sont toujours vivantes mais dépourvues d’activité
métabolique.
• Poudre peut être conservée pendant des années.
• Les bactéries peuvent être ranimées en tout temps par hydratation
avec un milieu nutritif.
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Evaluation des modifications quantitatives, qualitatives et fonctionnelles induites

par la conservation de consortiums bactériens extraits de sols
Objectifs :
Æ Déterminer les conséquences du mode de conservation des consortiums sur

différents paramètres caractéristiques des communautés bactériennes : la
densité, l’activité et la structure génétique
Æ Proposer un mode de conservation compatible avec une utilisation dans des

bio-tests (permettant de préserver les capacités fonctionnelles )
Congélation : mélange de 1 ml d'eau/glycérol (v/v), congélation par immersion dans de

l'azote liquide, conservés à -80°C.
Lyophilisation : azote liquide, lyophilisateur (Modulyo, Edwards), conservation à

température ambiante.
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Culture en milieu riche (Glucose 20 g/L, Extrait de levure 5 g/L, (NH4)2 SO4 3 g/L,
CaCO3 4 g/L, Farine de coton 15 g/L, ZnSO4, 7H2O 0.03 g/L, pH 7).
Paramètres étudiés : dénombrements, capacité de

biotransformation (pesticides), structure génétique
Résultats:
• La congélation est le mode de conservation permettant de minimiser les

modifications de la densité cellulaire
• Les capacités de biotransformation globalement maintenues mais diminuée par les 2

méthodes de conservation.
• La congélation et lyophilisation modifient la structure génétique des consortiums
ÆCongélation = la + appropriée
ÆÉtape de culture post-conservation nécessaire
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2.5.) Manipulations aseptiques
Bec bunsen
Hotte à flux laminaire
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Chapitre 3 : Méthodes et milieux de culture
3.1) Milieux de culture : généralités
Liquides ou Solides
Synthétiques ou Complexes (Empiriques)
Usuels Enrichis Isolements
Non sélectifs Sélectifs et

identification
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3.2) Liquides ou solides
Liquide
Diagnostiques, croissance, productions industrielles
Solide
agar-agar
Gélatine
Sérum de bœuf coagulé (M de Loeffer)
Oeufs entiers coagulés (M de Jensen)
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3.3) Milieux synthétiques
Milieux chimiquement définis

Fréquemment utilisés pour la croissance des autotrophes
Desulfovibrio desulfuricans Na2HPO4 1g

NH4Cl 1g
CaSO4 1g
g
MgSO4 2g
H2Od 1000ml
Yersinia pestis (citrate de Simmons)
KHPO4 1g
NH4H2PO4 1g
Bleu de bromothymol 0,08g
Citrate de sodium 1g
NaCl 5g
MgSO4 0,2g
Agar 15g
pH 7,1
H2Od 1000ml
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3.4) Milieux complexes (empiriques)
• Contiennent des ingrédients dont la composition

chimique est imprécise
– Extrait de levure ( source de C, de vitamine B)
– Extrait de viande ( sucres, composés azotés, vitamines et facteurs de
croissance)
– Peptones ( source de C et d’azote)
d azote)
– Sang (élément nutritif +observation des propriétés hémolytiques de
certaines bactéries)
– Fréquemment utilisé pour les fermentations industrielles (déchets de
l’agro-industrie = mélasse, amidon de maïs, farine de soja)
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3.4.1) Milieux usuels
•Peptones trypsiques, pancréatiques, papaïniques
•Milieux à peptones simples (hétérotrophes, faible exigence = Staphylococcus, enterobactéries,

Pseudomonas, Vibrio, Bacillus)
•Milieux à peptones riches (hétérotrophes, exigence moyenne = Brucella, Streptococcus,
Pasteurella)
Gélose Baird Parker (Identification et numération de Staphylococcus aureus)
-Peptone :............................................ 10,0 g Caractéristiques

-Extrait de viande de bœuf :....................4,0 g - Une base nutritive riche.
-Extrait de levure :...................................2,0 g
- Deux inhibiteurs : Le tellurite de Potassium et le
-Pyruvate de sodium : ...........................10,0 g
-Glycocolle............................................12,0 g chlorure de lithium.
-Chlorure de lithium :................................5,0 g - Trois critères de différenciation :
-Agar-agar :.......................................... 20,0 g La réduction du tellurite en tellure noir.
Émulsion de jaune d'œuf (stérile) : ..........50,0 ml La protéolyse des protéines du jaune d'œuf, se
-Tellurite de potassium (stérile):...............0,1 g traduisant par un halo clair (transparent) autour de la
colonie.
L'hydrolyse, par une lécithinase, des lécithines du jaune
d'œuf qui se traduit par un liseré blanc opaque
(précipité blanc des acides gras).
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3.4.2) Milieux enrichis
• Contiennent des substances organiques complexes ( sang, infusions, extraits de levure).

• Permettent la croissance des bactéries plus exigeantes (apport de facteurs de croissance)
• Neutralise les inhibiteurs contenus dans les peptones
• Neutralise ions superoxydes
• Etude des propriétés hémolytiques. Mélange spécial de peptones : 23 grammes,
amidon : 1 g,
chlorure de sodium : 5 g,
agar : 10 g,
Ex : gélose au sang sang : 50 mL.
Le potentiel hydrogène (pH) est de 7,3.
Bêta (β) : hémolyse complète

(Zone transparente
autour de la colonie)
Alpha (α) : hémolyse

incomplète (partielle)
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3.4.3) Milieux d’isolements
•Isolement
Isolement non sélectif (pas d’inhibiteur spécifique Æ isolement
physique sur milieu usuel, usuels additionnés, enrichis, spéciaux)
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•Isolement sélectif et identification (ajout d’inhibiteur Æ mise en

évidence de propriétés spécifiques = métabolique, enzymatique,
chimique)
hi i )
Micro-
organismes
Inhibiteurs Micro-organismes non-inhibés inhibés
Cristal violet, Eosine,
Sélénite Gram - Gram +
Chloramphénicol,
p , Bactéries
Gentamicine Champignons sensibles
Cycloheximidine Listeria Indéfinie
Azide Streptococcacea Indéfinie

Staphyloccocus micrococcus, Enterococcus, Gram -,
NaCl concentré corynobactéries Streptococcus
• Facilite la distinction entre les colonies de la bactérie recherchée et

les autres colonies présentes sur le même milieu
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Sélection des gram –
Milieu sélectif de Mac Conkey n°3
Peptone Æ source de N
Lactose et rouge neutre Æ fermentation lactique - (rouge),
fermentation lactique + (jaunes ou incolores)
S l bili
Sels biliaires
i n°3,
°3 cristal
i t l violet
i l t Æ inhibition
i hibiti d des gram +
Nacl, agar
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Sélection de Staphylococcus
Milieu de Chapman
•Peptone, extrait de viande de boeuf

•Nacl concentré (75 g/dm3) Æ inhibiteur non total Æ exam
microscopique)
•Mannitol
M it l ett rouge d
de phenol
h l Æ mannitol
it l + (h
(halo
l jjaune)) ou –
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3.4.4) Milieux différentiels Peptone 10

Lactose 10
Eosine 0,4
Milieu EMB (éosine et bleu de méthylène)
Bleu de méthylène 0,065
Hydrogénophosphate 2
Différentes réponses métaboliques Æ distinctions de potassium
Agar 15
sels minéraux, 2 colorants (inhibition des

gram + Æ sélectif des gram-)
Lactose Æ fermentation du lactose
lactose + : colonies violet foncé (E. coli)

lactose - : colonies grisâtres ou incolores
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Chapitre 4 : Identification des micro-organismes
4.1) Caractères morphologiques
Observations macroscopiques
Aspect des colonies par

transparence, réflexion, trans-
illumination oblique
C
Caractères
tè culturaux
lt
Bactéries et levure :
Taille, aspect (forme,
opacité, consistance,
surface, couleur)
Champignons : Taille,
vitesse de croissance,
aspect
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Halobacterium salinarum Entérobactéries Streptomyces Rhizopus
Frankia
Stenotrophomonas maltophilia
Trychophyton rubrum Penicillium notatum
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Observations
microscopiques
Etat frais : mobilité

Frottis colorés : gram, spore, flagelles
Gram - Gram+
Spore au vert
malachite Flagelle de vibrio
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bacille spirille coque vibrio
levure Conidiophore Bifidobacterium

Cyanobactérie
de p
penicillium
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4.2) Caractères physiologiques
1 Bactéries aérobies et anaérobies

1-
2- Températures optimums
3- Sensibilité aux antibiotiques (spectre d’activité)
Pénicilline G : bactéries à Gram positif et aux coques à Gram

négatif
Colistine : bacilles à Gram négatif à l'exception des Proteus
sp., des Providencia sp., des Serratia sp.
Tétracyclines : bacilles et coques, à Gram positif ou à Gram
négatif, aérobies ou anaérobies ou aéro-anaérobies.
Résistance des Enterococcus faecalis
CMI et antibiogramme
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4.3) Caractères biochimiques
ÆFermentation de carbohydrates Æ
acidification du milieu (+/-)
ÆTests métaboliques :
test oxydase (mise en évidence la capacité à

oxyder la forme réduite incolore de dérivés
méthylés du paraphénylène diamine) gram-
test uréase (mise en évidence d’une enzyme

hydrolysant l’urée) proteus
test indole (mise en évidence d’une enzyme

hydrolysant le tryptophane) E. coli
test coagulase (staph patho)
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LES BACILLES GRAM POSITIFS

CULTIVANT EN ATMOSPHERE
AEROBIE
LES ELEMENTS PERMETTANT D’ORIENTER LE

DIAGNOSTIC
» L’aspect morphologique au Gram
» Le résultat du test catalase (H2O2Æ H2O + O2)
» La présence ou non de spores
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Sporulés
BACILLUS
Catalase +
Gros bacilles Non sporulés

LACTOBACILLUS
Catalase -
Catalase + LISTERIA
Cocco bacilles ou
petits bacilles
BACILLES GRAM + Catalase - ERYSIPELOTHRIX
Bacilles en forme de Catalase + CORYNEBACTERIUM

massue ou haltères
Longs bacilles acido-

MYCOBACTERIUM
alcoolo-résistants
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Le Milieu TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Saccharose) (recherche de vibrions)
Source de C et N
Composition
ii
Peptone 10 g Source de C, N, vitamines et
minéraux
Extrait de levure 5g
Citrate de sodium 10 g Inhibiteur car forte concentration (enteroba)
Thiosulfate de sodium 10 g Source de S
Chlorure de sodium 10 g Source minérale, inhibiteur
Bile de bœuf 8g Inhibiteur car forte concentration
Citrate ferrique 1g (enterocoques)
Saccharose 20 g
Indicateur des sulfures
Bleu de bromothymol 0,04 g
Bleu de thymol 0,04 g Source glucidique (sélectif des
Agar (gélose) 13,5 g vibrio)
ED qsp 1 L Indicateur de pH
pH = 8,6
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Lecture
Colonies vertes Î le pH est neutre

ou basique .
Les bactéries ne fermentent pas le
saccharose : SACCHAROSE -
Sans centre noir : H2$ -
Colonies jaune Î le pH est Autres Vibrio
acide .
Les bactéries fermentent le
saccharose en produisant des Colonies avec centre
acides, virage de l’indicateur noir Î précipité de
de pH du vert au jaune: sulfure de fer.
SACCHAROSE + Les bactéries ont produit
Sans centre noir : H2S – de l’H2S : H2S +
Suspicion de Vibrio cholereae (pseudomonas)
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Milieu Hektoen Recherche de Salmonella-Shigella
•Peptone
•Lactose,
L t saccharose
h ett salicine
li i ett bl
bleu d
de bbromothymol
th l Æ S ett S
sont lactose -, saccharose - et salicine – (colonies vertes bleues), les
glucides + apparaissent saumon
•Soufre et Fe III Æ Shigella est H2S- , salmonella peut être H2S - ou +
Æ centre noir)
•Desoxycholate Æ inhibition des gram + et de toutes autres que S et S
•NaCl agar
•NaCl,
Colonie saumon : E. coli, Colonie verte-bleue :

Klebsiella, Enterobacter, Salmonella H2S-, Shigella,
Serratia Providencia
Colonie saumon à centre Colonie verte-bleue à

noir: Citrobacter, Proteus centre noir: Salmonella
vulgaris H2S+, Proteus mirabilis
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API System®
Galéries d'identification
d identification miniaturisées (1968) composées de tests
biochimiques et de bases de données; 16 galeries permettant
d’identifier plus de 550 espèces de la plupart de groupes bactériens:
Gram-
API 20E: Enterobacteriaceae (1 à 2 jours).

API Rapid
R id 20 EE: 4 E
Enterobacteriaceae
t b t i (4h)
(4h).
API 20NE: Gram-negative non-Enterobacteriaceae
(1 à 2 jours)
API CAMPY: Campylobacter (1 jour)
Gram+
API STAPH:
STAPH staphylocoques,
t h l micrococcus
i
(1 nuit)
RAPIDEC STAPH: staphylocoques (2h)
API LISTERIA: Espèces Listeria (1 jour)
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LA GALERIE API 20E
1- Présentation de la galerie
Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin
d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE.
cupule
p
microtube contenant le milieu déshydraté

La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés
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2- Préparation de l’inoculum
1 seule colonie
Prélèvement
d’une
d une souche
isolement pure
5 mL d’ED stérile
Souche pure
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3- Ensemencement de la galerie API 20 E
Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur
stérile pointe appuyée à ll’intérieur
stérile, intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles
Pour certains caractères:
Remplir le tube de suspension et recouvrir

Remplir de suspension le tube et la d’huile de paraffine (anaérobiose)
cupule ADH, LDC, ODC, H2S, URE
VP, GEL
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Les 10 premiers tests activités enzymatiques
ONPG : ortho-nitro-phényl-galactoside; B-galactosidase

ADH : arginine; arginine dihydrolase
LDC : lysine; lysine décarboxylase
ODC : ornithine, ornithine décarboxylase
CIT: citrate de sodium, utilisation du citrate
H2S: thiosulfate de sodium; production d’H2S
URE: urée; uréase
TDA: tryptophane; tryptophane désaminase
IND: tryptophane; production d’indole (tryptophanase)
VP: pyruvate de sodium; production d’acetoïne
GEL: gélose; gélatinase
58
15/09/2009

Les 10 tests oxydation/fermentation des carbohydrates
GLU : glucose
MAN : mannose
INO: inositol
SOR: sorbitol
RHA: rhamnose
SAC: saccharose
MEL: meliblose
AMY: amygdaline
ARA: arabinose
Nitrate reductase
Catalase
Cytochrome oxydase
59
15/09/2009
4- Lecture de la galerie API 20 E

L 10 premiers
Les i tests
t t
Tests négatifs
Tests positifs
En présence de thiosulfate, production de

sulfure d’hydrogène et réduction du citrate
ferriqueÆsulfure de fer (noir)
60
15/09/2009

Les 10 derniers tests
Tests négatifs
Tests positifs
61
15/09/2009

5- Identification de la souche
Résultats de la galerie:
- + + + +
5 2 1 5 7 7 3 5 5
Résultats
é l reportés
é sur la
l fiche
f h d’identification
d d f
Code n°: 5 215 773 (55)
Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code
62
15/09/2009
Chapitre 5 : Méthodes démographiques
1)) Dénombrements indirects

•sur milieux de culture solides
•en milieux de culture liquides
•après filtration
•Marquage enzymatique
2) Dénombrements directs
3) Densité bactérienne par spectrophotométrie
4) Biomasse microbienne
63
15/09/2009
5.1) Numération en milieu solide
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml
64
15/09/2009
∑ Cn
N=
(n1 × v1)d1 + (n2 × v2)d2 +…+ (nn × vn)dn
Cn : nombre de colonie comptées sur les boites retenues

nn : nombre de boite retenu de la n-ième dilution
vn : volume de l’inoculum de la n-ième dilution
dn : valeur de la n-ième dilution
65
15/09/2009
(137+160+36)/[(2×0 1)10-3 +
N (137+160+36)/[(2×0,1)10
N=
(1×0,1)10-4]
0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

N= 333/2,1.10-4
N= 1,58.106 UFC / ml
-3 -4
137 et 160 36 colonies
colonies
66
15/09/2009
5.2) Numération en milieu liquide
Méthode du nombre le
plus probable (NPP) de
germe
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
-3 -4 -5
9 ml
3 3 2 1
67
15/09/2009
2 tubes par dilution 3 tubes par dilution
Nombre Nombre de Nombre Nombre de Nombre Nombre de Nombre Nombre de

caractéristique cellules caractéristique cellules caractéristique cellules caractéristique cellules
000 0.0 000 0.0 201 1.4 302 6.5

001
010
0.5
0.5
001
010
0.3
0.3
202
210
2.0
1.5
310
311
4.5
7.5 Nb caractéristique
011
020
0.9
0.9
011
020
0.6
0.6
211
212
2.0
3.0
312
313
11.5
16.0 = 321
100 0.6 100 0.4 220 2.0 320 9.5
101 1.2 101 0.7 221 3.0 321 15.0
110 1.3 102 1.1 222 3.5 322 20.0
111 2.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0
120 2.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0
Tables de Mac Grady

121 3.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0
200 2.5 121 1.5 232 4.0 332 110.0
201 5.0 130 1.6 300 2.5 333 140.0
210 6.0 200 0.9 301 4.0
211 13.0
212 20.0
220 25.0
221 70.0
222 110.0
15 germes
5 tubes par dilution
dans 1 ml
Nombre Nombre de Nombre Nombre de Nombre Nombre de Nombre Nombre de
caractéristique cellules caractéristique cellules caractéristique cellules caractéristique cellules d’inoculum de
000
001
0.0
0.2
203
210
1.2
0.7
400
401
1.3
1.7
513
520
8.5
5.0 la dilution 10-3
002 0.4 211 0.9 402 2.0 521 7.0
010 0.2 212 1.2 403 2.5 522 9.5
011 0.4 220 0.9 410 1.7 523 12.0
012 0.6 221 1.2 411 2.0 524 15.0
X = 1,5.104 UFT / ml
020 0.4 222 1.4 412 2.5 525 17.5
021 0.6 230 1.2 420 2.0 530 8.0
030 0.6 231 1.4 421 2.5 531 11.0
100 0.2 240 1.4 422 3.0 532 14.0
101 0.4 300 0.8 430 2.5 533 17.5
102 06
0.6 301 11
1.1 431 30
3.0 534 20 0
20.0
103
110
0.8
0.4
302
310
1.4
1.1
432
440
4.0
3.5
535
540
25.0
13.0 UFT (Unité Formant
111 0.6 311 1.4 441 4.0 541 17.0
112
120
0.8
0.6
312
313
1.7
2.0
450
451
4.0
5.0
542
543
25.0
30.0
Trouble)
121 0.8 320 1.4 500 2.5 544 35.0
122 1.0 321 1.7 501 3.0 545 45.0
130 0.8 322 2.0 502 4.0 550 25.0
131 1.0 330 1.7 503 6.0 551 35.0
140 1.1 331 2.0 504 7.5 552 60.0
200 0.5 340 2.0 510 3.5 553 90.0
201 0.7 341 2.5 511 4.5 554 160.0
202 0.9 350 2.5 512 6.0 555 180.0
68
15/09/2009
5.3) Numération après filtration
69
15/09/2009
5.4) Marquage enzymatique
B-D glucuronidase
B-D glucuronidase
4-methylumbelliferyl- 4-methylumbelliferone
B-D-glucuronide
70
15/09/2009
71
15/09/2009
5.5) Dénombrements directs
Marquage fluorescent direct
72
15/09/2009
Acridine orange
Excitation 490nm
DAPI (4',6-DiAmidino-2-
PhenylIndole )
Excitation 370nm,
émission à 460nm
73
15/09/2009
Marquage fluorescent indirect (immunofluorescence)
74
15/09/2009

Exemple
d’application
Ranjard et al.1997
75
15/09/2009
4 type de sols (végétation, caractéristiques physico-chimiques différentes)

Æ pH
Bactéries à la surface et à l’intérieur des agrégats Æ rôle de la structure
Incubation après apport de Hg
PCA et PCA+Hg
Abondance gram- par test enzymatique (L-alanine aminopeptidase)
76
15/09/2009
•Faible
Faible proportion HgR/MT
•Adaptation = augmentation des

HgR après apport expérimental de
Hg
•Augmentation + importante des

HgR si pH acide
•Augmentation + importante des

HgR à l’ext des agrégats =
accessibilité + de gram – (les plus
accessibilité,
résistantes).
77
15/09/2009
5.6) Densité microbienne

Densité bactérienne
DB = concentration de la culture en substances cellulaires (mg/ml)
Il y a proportionnalité, pour une pop bactérienne donnée, entre la densité

optique de la suspension (DO) et la DB = loi de Beer-Lambert
Principe
p
L’absorption de la lumière par une solution obéit à une loi exponentielle (loi de
Beer-Lambert) Æ Relation exponentielle entre la quantité de substance absorbant
la lumière et la quantité de lumière absorbée
Æ La quantité de substance absorbante dépend de l’épaisseur de la solution

traversée et de la concentration. (si 1 cm de solution traversée absorbe 50 % de la
lumière incidente, le centimètre suivant en absorbera 50 % des 50 % restants et
ainsi de suite…).
Si épaisseur constante (cuve de 1 cm d’épaisseur pour la plupart des
spectrophotomètres), la quantité de lumière ne dépend plus que de la
concentration.
78
15/09/2009
La loi de Beer-Lambert exprime cette relation à travers la formule suivante :
10-Klc
I = I0.10 Klc
[C]
I0 = intensité de la lumière incidente

I = lumière transmise
l = épaisseur traversée (souvent 1 cm) Abs
K = une constante caractéristique de la substance
c = la concentration en substance.
Linéarisation: log(I/ I0) = K.c
log(I/ I0) est appelé absorbance (DO)
Calcule de K à partir
DO = K.DB
d’une courbe étalon
79
15/09/2009
5.7) Estimation de la biomasse microbienne
Méthode SIR (Substrat Induction Response)
Réponse respiratoire (µg C-CO2 / g), après ajout de glucose en

concentration opt (a), est proportionnelle à la biomasse
Temps court = absence de division cellulaire (b)
Quantité saturante de glucose
Q g dépend
p de la communauté ((c))
CO2 a CO2 b CO2 c

S1
Division cellulaire
S2
S3
[G] tps [Gopt]
80
15/09/2009
Conversion de la réponse respiratoire (µg C-CO2 / g) en unité de biomasse

microbienne (µg C mic / g) Æ (relation d’Anderson
C-mic d Anderson et Domsh
Domsh, 1978)
Réponse respiratoire
par SIR (µg C-CO2 / g)
X = 40,04 Y +0,36
Biomasse microbienne
par fumigation
p g (µg C-
mic / g)
81
15/09/2009

Problématique - contexte Exemple
d’application
82
15/09/2009

1 mois
Résilience ?
1 an
Nouvel écosystème ?
4 ans
13 ans
Evolution
S
E
Succession
l ti i de
d la
l
qualité
écologique
des sols
83
15/09/2009
Quotient métabolique (resp/biom) = indicateur écophysiologique et

adaptatif
qCO2 bas = faible besoin énergétique pour produire de la biomasse
(stratège K, stable, efficaces, croissance lente, spécialiste)
qCO2 haut = important besoin énergétique pour produire de la biomasse
(stratège r , gaspillage énergétique, croissance rapide, généralistes)
84
15/09/2009
Chapitre 6 : Activités enzymatiques
6.1) Généralités
1899 Woods peroxydase

1946 Quastel
Objectifs
Æ Minéralisation de la MO
ÆCycle biogéochimiques
ÆIndicateurs de la qualité (fertilité) des sols
ÆBioindicateurs biomasse
ÆPotentiel de dépollution et changements globaux
85
15/09/2009
6.2) Propriétés fondamentales
= biocatalyseur permettant ou accélérant une réaction biochimiques

qui n’ont pas lieu spontanément
Æ Abaissement de l’énergie d’activation d’une réaction
A+B ↔ C+D
86
15/09/2009
Comment les enzymes permettent de diminuer l’Ea ?
Æ Apport des substrats au site actif (concentration et

accélération de la réaction)
Æ Orientation correcte (abaissent l’énergie nécessaire pour
obtenir AB)
87
15/09/2009
88
15/09/2009
Adsorption aux colloïdes éléctro-négatifs (pH et Pi)
Pi = point iso
iso-électrique
électrique (pH auquel la protéine est électriquement neutre)
R-NH2 + H+ Æ R-NH3+ (terminaison basiques acceptant un H+)

R-COOH Æ R-COO- + H+ (terminaisons acide libère un H+)
A un pH donné certaine prot sont chargée – d’autre chargée +
pH = Pi : faible adsorption Æ prot active
pH < Pi : prot chargée + = forte adsorption Æ inactivation
pH > Pi : prot chargée - = répulsion Æ prot active
Cellulase (Pi = 4,5) inactive en milieu acide, active en milieu neutre
89
15/09/2009
Ærégulation et mesure
capacité d’adsorption
d adsorption d’un
d un sol limitée,
ralentie son activité mais conserve le potentiel
protection contre la dégradation
induction Æ économie d’énergie = adaptation microbienne
90
15/09/2009
6.3) Méthodologie
Mesure ‘in situ’ des activités enzymatiques extracellulaires
Tampon de réaction (pH désiré)

Substrat
Acétate (pH3-6), phosphate (pH5-8),
[saturante]
NaOH-glycine (pH8-11)
1g échantillon
Incubation (tps, T°C)

Filtration, centrifugation
Lecture DO (dosage du produit obtenu, oxydé ou hydrolyse)
-Volume réactionnel précis et déterminé

-Tps d’incubation précis
-Témoin (ajout de substrat à la fin de l’incubation)
-Répétitions analytiques
91
15/09/2009

Expression des résultats
Gamme étalon des produits formés
DO
CMC Æ glucose (dosage colorimétrique)
X µg de glucose
µg [glucose]
X x VT
Tps incub x MM
U / g éch Æ µmoles de produit formé / minute / g éch
92
15/09/2009
Estérase (hydrolase)
Ex: Activité FDAse (fluorescéine
diacétate hydrolase)
93
15/09/2009
Diversité des fonctions cataboliques

(oxydation des substrats carbonés)
Méthode Ecoplate Biolog® - Analyse des

communautés microbiennes
• Capacité d’oxydation
d oxydation de 30 substrats
carbonés (3 réplicats)
• Carbohydrates (mannitol, glucose), aa
(arginine,sérine), acides carboxyliques
(ac. malique, galacturonique), amine
(phenylethyl-amine),
(p y y ), polymères
p y ((tween,,
cyclodextrine)
• Oxydation Æ réduction du tétrazolium
violet Æ intensité proportionnelle à la
capacité d’utilisation du substrat
94
15/09/2009
• Extraction des bactéries,

inoculation de la microplaque,
incubation (2-5j) et lecture de la
DO de chaque puits
•Standardisation des DO (AWCD

0.75)
•Traitements analytiques
(analyses multivariées, indice de
diversité)
95
15/09/2009
Contexte écologique
Surfaces
incendiées
Succession post-incendie
sur sols pauvres
Garrigues
Formations à Forêts feuillues
Forêts mixtes
pin d’Alep
p p (caducifoliées)
96
15/09/2009
Constat et problématique
Homogénéisation des peuplements forestiers en faveur du pin d’Alep
d Alep en France
Æ Espèce à forte plasticité écologique
Æ Gestion / exploitation sylvicole
Æ Restauration des écosystèmes incendiés
Conséquences: - perte nette de biodiversité

- diminution de la dynamique de décomposition de la matière
et de la disponibilité des nutriments (écosystèmes peu fertiles)
97
15/09/2009
1) Système expérimental 3 peuplements
pin d’Alep mixte chêne vert

X3 X3 X3
Litière
humus
98
15/09/2009
Indice de diversité fonctionnelle bactérienne (biolog)

Indice de Shannon
n
3.2 * ab
a
b
3.0
2.8
2.6
Pinède Mixte Chênaie

Axe
2
RDA
(20,8
%)
Organisation
g ((structure)) des
communautés microbiennes basée sur
leur capacité à oxyder 30 substrats
organiques (biolog)
Axe 1 RDA (31,4%)
99
15/09/2009
Chapitre 7 : génétique microbienne
7.1. Rappels
Pentose
Nucléosides
Nucléotides
Structure
primaire
100
15/09/2009
5'P 3'OH
ACGTATGCCCATACGCGCGCG
TGCATACGGGTATGCGCGCGC
3'OH 5'P
Structure
secondaire
101
15/09/2009
7.2. Extraction de l’ADN
Lyse cellulaire
Lysosyme (hydrolase, chaîne

polypeptidique de 129 acides aminés ) Æ
h d l
hydrolyse polysaccharide
l h id composés é
d'unités alternées de N-acétylglucosamine
(NAG) et d'acide N-acétylmuramique
(NAM).
102
15/09/2009
SDS (sodium dodécyl sulfate) = détergent Æ solubilisation des lipoprotéines)

EDTA (Ethylène diamine tretraacétate) chélateur de cations divalents (Ca2+),
iinhibe
hib lles DNA
DNAses
Purification
précipitation de protéines :
Perchlorate de sodium (NaO4Cl)
Solution de phénol
Chloroforme/alcool isoamyl
103
15/09/2009
La solution obtenue est chargée sur gel d'agarose (2%) et les molécules se
séparent suivant leur taille (poids moléculaire). La coloration au bromure
d'éthydium (BET), spécifique des acides nucléiques, révèle deux "bandes".
cathode
anode
104
15/09/2009
7.3. Composition en bases des acides nucléiques
rapport
Organisme A T G C
A+T/G+C
E. coli 26,0 23,9 24,9 25,2 1,00
D.pneumoniae 29,8 31,6 20,5 18,0 1,59
Levure 31,3 32,9 18,7 17,1 1,79
R t
Rat 28 6
28,6 28 4
28,4 21 4
21,4 21 5
21,5 1 33
1,33
Homme 30,3 30,3 19,9 19,8 1,52
Moles % G+C = (G+C)/(G+C+A+T)×100
Bacillus 32-62%
32 62%
E. coli 48-52%
Pseudomonas 58-70%
Agaricus 44%
105
15/09/2009
En raison de leurs doubles liaisons conjuguées, les

bases absorbent fortement la lumière ultraviolette
À pH 7, l’ADN a une absorbance maximum proche de

260 nm.
La température à laquelle l’ADN est à demi

déroulé s’appelle la température de fusion,
Tm, de l’ADN.
Tm coïncide avec le p
point d’inflexion de la
courbe sigmoïde.
+ le nb de liaisons H est élevée, plus Tm

est important
106
15/09/2009
7.4. Empreintes génétiques et séquençage
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amorces nucléotidiques
Dénaturation
Hybridation pcr.exe
Elongation
107
15/09/2009
108
15/09/2009
Empreintes génétiques
PCR/DGGE (Denaturing Gel Gradient Electrophoresis) de l’ADNr 16S
109
15/09/2009
Séquençage
110
15/09/2009
111
15/09/2009
112
15/09/2009
113
15/09/2009
Comparaison d'organismes
phylogéniquement éloignés
(séquences ADNr 16S)
114
15/09/2009
Comparaison d'organismes proches (séquences AmoA = bactéries ammonifiantes)

Genres nitrosococci, nitrosomonas, nitrosospira
115

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Licences 3ème année BPE et BPN– SV14B Microbiologie

IV) Identification des

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

I.1) Domaine de la microbiologie

L'écologie est la science qui étudie les interactions qui existent

La microbiologie est la science qui étudie les organismes dont la

L’écologie microbienne est la science qui étudie les interactions

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Quels sont les objectifs

2. Quelle est leur abondance relative ?

3. Quelles sont leurs fonctions dans l(es)’écosystèmes(s)?

4. Comment les micro-organismes changent ou transforment

6. Qu’est ce qui contrôle leur activité et leur abondance?

7. Quel rôle jouent-ils dans les cycles biogéochimiques ?

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Ecologie Ecologie microbienne Chimie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Fondamentaux à Notions importantes à

Rôle dans les cycles

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Cycles biogéochimiques : carbone

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

1bar par 10m 1 2 3 4 5

200 400 600 800 1000 1200

Æ Stratégies adaptatives des micro-organismes

Æ Réponse des bactéries à une modification de l'environnement

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Biodiversité Biodiversité Biodiversité des

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

• Recenser et inventorier les ressources biologiques, notamment dans les

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

I.1) Domaine de la microbiologie

Ensemble des techniques et des procédés qui permettent de tirer profit

Choix du microorganisme ou de la communauté, manipulation des

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Trichoderma hazianum KRL-AG2 Æ fongicide biologique

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Ingénierie génétique - technologie de l’ADN recombinant :

VP1 Transcription inverse

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

I.2) Histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Louis Pasteur (1861) Æ abandon définitif de la

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

Sergei Winogradski (1887) Æ Chimiotrophie

Æ métabolisme, enrichissement, cultures sélectives, gel

Chapitre 1 : Domaine et histoire de la microbiologie

5) Théorie des infections par les germes

Robert Koch (1876-1887) Æ Rôle des bactéries dans les maladies

Pasteur (1880-1885) Æ vaccins charbon, cholera, rage

Puis tout s’accélère…

Chapitre 2 : Manipulations aseptiques, stérilisation, conservation

2.1) Définitions normalisées

Stérilisation (AFNOR) : opération qui a pour objet de tuer tous les

Désinfection : action à visée anti-microbienne qqs le résultat, en

Décontamination : opération au résultat momentané, permettant de