Cours 3 Concept 1

1 Dans cette deuxième partie du module 2, on va mettre en évidence quelques techniques moléculaires. Ces
techniques ne sont pas réservés à la biologie cellulaire, mais sont partagés avec la biochimie et la biologie
moléculaire. Néanmoins, ils se trouvent dans la trousse d’outils des biologistes cellulaires.

2 Le premier de ces techniques s’appelle la centrifugation. Dans cette technique on applique une force
centrifuge à un mélange d’objets ou macromolécules en solution afin de les séparer. La force centrifuge est le
nom que l’on donne à la sensation d’être tiré vers un côté lorsqu’une voiture fait un virage. Vu d’en haut, la
voiture doit subir une accélération afin de changer de direction, et on mesure l’effet sur des molécules par des
multiples de la force d’accélération du a la gravité, ou « fois g ».

3 La rotation des échantillons se fait par un centrifuge. Cet appareil contient une tige qui permet de faire
tourner un rotor dans laquelle est placé les tubes de centrifuges qui contient les échantillons. Parce qu’il y a
beaucoup d’énergie impliquée dans un rotor qui tourne rapidement, les centrifuges sont tapissés d’une
armure qui protège l’opérateur en cas d’accident.

4 Heureusement, les accidents sont rares. Ils peuvent arriver quand les rotors deviennent trop âgés. Il peut
aussi arriver si on oublie de balancer le poids d’un échantillon en mettant le même poids sur l’autre côté du
rotor.

5 Il y a deux types de centrifugation qu’on peut utiliser pour séparer des objets. Le premier s’appelle la
centrifugation différentielle. Ceci est utilisé pour séparer les objets de taille différente. Ceci semble être en
contradiction avec les expériences de Galilée, qui ont démontrer que deux objets de taille différente tombe
avec la même vitesse. Il a déduit qu’une accélération constante sur deux objets fait en sorte que objet plus
grand, ou plus massif, subi un plus grande force. Mais les expériences de Galilée ont eu lieu dans l’air qui
n’offre peu de résistance au mouvement des objets.

6 La situation en solution est très différente, car l’eau offre une plus grande résistance a le mouvement des
objets. Encore plus importante, la résistance dépend de la taille de l’objet, ou de façon plus juste, du rapport
entre sa superficie et son volume. Plus qu’un objet est grand, plus que le rapport entre sa superficie et son
volume est petit. La masse de l’objet augment en fonction de la masse, tandis que la résistance au mouvement
augment avec la superficie. Dans l’eau, les plus grands objets descendent plus rapidement. Typiquement on
fait la centrifugation différente en plusieurs étapes, augmentation la vitesse de rotation à chaque étape. En
vitesse réduite, la force d’accélération est petite, et les grands objets vont descend dans le tube a centrifuge
formant un culot dans le fond. Pour descend les plus petits objets on doit augmenter la vitesse de rotation et
donc l’accélération sur ces objets.

7 Le deuxième type de centrifugation s’appelle da centrifugation sur gradient de densité. Cette technique
repose sur la « poussée d’Archimède », une force dirige vers le haut qui est un résultat du fait que la pression
augmente avec la profondeur. La pression est toujours plus fort en bas ce qui pousse donc l’objet vers le haut.
La poussée verticale est proportionnelle au poids du volume de liquide déplacé par l’objet, et donc les effets
dépendent de la densité de l’objet. Un objet plus dense que l’eau va couler parce qu’il est tiré vers le bas avec
une force qui est plus grand que la poussée verticale.

8 Expérimentalement, on prépare un tube de centrifuge avec une solution dont la densité augment de haut en
bas, ce que l’on appelle un gradient de densité. Lorsque les objets sont sédimentés par l’accélération due à la
rotation de l’échantillon, ils descendent jusqu’au point ou leur densité est le même qu’à la densité de la
solution qui l’entoure et ils s’arrêtent là. Les objets de densité différents vont arrêter de bouger a des positions
différentes dans tube de centrifuge. Notez qu’on peut utiliser les deux types de centrifugation un à la suite de
l’autre afin de purifier davantage des échantillons.

9 La taille des objets va déterminer la vitesse de rotation et donc l’accélération nécessaire pour faire bouger
l’objet. Par exemple, une faible vitesse de rotation est suffisante pour faire bouger les cellules du sang, et en
plaçant un mélange de cellules par-dessus d’un solution qui est plus dense que les globules blancs et moins
dense que des globules rouges, on peut sédimenter sélectivement des globules rouges. Pour sédimenter les
molécules d’ADN par contre, qui sont beaucoup plus petits, l’accélération doit être beaucoup plus grande.
Dans cette expérience on voit la séparation de l’ADN nucléaire riche en GC et l’ADN mitochondrial riche en AT,
car le nombre liens hydrogènes dans les paires de bases GC et AT faits que leur densité des deux est
légèrement différents.

10 Dans un exemple, on purifie des chloroplastes en utilisant les deux types de centrifugation de façon
séquentielle. Après avoir broyé les feuilles, on sépare les chloroplastes intact et très dense des chloroplastes
brisés dont la densité est identique a la solution. Ensuite, on sépare les grands chloroplastes des petits
composants du cytoplasme par centrifugation différentielle.

11 Mettez le diaporama en pause afin de réfléchir sur la question.

Pour répond a cette question il faut réaliser que la centrifugation sur gradient de densité va certainement
séparer des objets de densité différente, mais lorsque les objets sont petits la vitesse de centrifugation (tel
que l’on a vu avec la centrifugation différentielle) n’est pas très grand au moins d’avoir une très grande
accélération.

Cours 3 Concept 2

1 Dans ce concept, on va voir comment le mouvement des molécules dans un champ électrique peut être
exploité pour séparer des molécules afin de les analyser.

2 Tout comme l’attraction d’un ion par une charge opposé, un champ électrique exerce une force sur les
molécules chargées qui les fait bouger.

3 L’ADN est une molécule idéale pour faire l’électrophorèse, car chaque phosphate dans la double hélice porte
une charge négative. La forme de la molécule d’ADN est donc d’un fils tapissé avec des charges dont le
nombre dépend de sa longueur.

4 Mettez le diaporama en pause le temps de réfléchir à cette question.

La bonne réponse est D, les trois molécules auront toutes la même vitesse. La raison pour ceci est reliée au fait
que le nombre le charges est directement proportionnelle à la longueur, ou la taille, de la molécule. Plus que
la molécule est longue, plus que la force nécessaire pour le faire bouger et grand, mais plus qu’on a des
charges, plus que la force exercée sur la molécule va être grande.

5 On ne peut pas utiliser l’électrophorèse dans l’eau pour séparer des molécules dont la taille est différente. À
la place, on fait l’électrophorèse dans un gel formé des longues fibres d’orientation aléatoire. Les gels du
polysaccharide agarose, comme du JELLO, sont liquides à une température élevée et solide à la température
de pièce. On le fait fondre, on verse dans un contenant approprié et on le laisse refroidir. On met aussi un
plastic comme un peigne dans un côté afin de faire des puits pour mets nos échantillons lorsque l’agarose a
refroidi. Ensuite on met tout le gel dans un bac à l’électrophorèse qui contient une solution de sel qui permet
le courant électrique de passer. On place des électrodes dans le bac afin d’attirer l’ADN vers le côté positif.

6 Les fibres d’agarose dans le gel ralenti la migration des molécules d’ADN et on voit ça parce que les
molécules migrent de plus en plus lentement quand la concentration d’agarose est élevée. Notez que par
convention, la migration des molécules pendant l’électrophorèse est toujours de haut en bas. Notez aussi que
les petites molécules trouvent plus facilement un chemin parmi les fibres d’agarose, et donc les petites
molécules migrent plus rapidement et se trouvent en bas dans chaque image d’électrophorèse.

7 Une bonne analogie est de courir dans un foret avec des bâtons de longueur différente. Les bâtons plus
longs ont plus de difficulté de trouver un chemin parmi les arbres, et donc migrent plus lentement.

8 L’électrophorèse d’ADN séparé des molécules de taille, ou longueur différentes. On peut visualiser toutes les
molécules de l’ADN avec un marqueur fluorescent, qui est généralement le bromure d’éthidium qui est plus
soluble dans l’eau que le DAPI. On peut aussi visionner une séquence en particulier en faisant une hybridation
avec une sonde taguée. Généralement on utilise des sondes radioactives, qui sont très faciles à synthétiser et
sont détectées dans les qualités très faibles. Par contre on ne pas utiliser l’hybridation que les molécules sont
dans le gel, car la sonde diffuse trop lentement. À la place, on transfère l’ADN sur un support solide, appelle
une membrane de nitrocellulose, qui lie les molécules d’ADN par sa charge nette positive. Le transfert
s’appelle un transfert Southern, après la personne qui a développé le technique. On transféré l’ADN par le
mouvement d’une solution qui monte à travers le gel et la nitrocellulose pour entrer dans une pile d’essuie-
tout par capillarité. Après le transfert, les sites sur la nitrocellulose qui peut encore lier de l’ADN sont bloqués
avec un ADN non radioactif avant de faire l’hybridation avec la sonde radioactive. Après l’hybridation, la
nitrocellulose est lavée et exposée à un film pour voir le postillon et la quantité de radioactivité. Notez qu’on
met toujours des standards de taille afin de corriger pour des différences dans la mobilité d’ADN en fonction
de la concentration d’agarose et le temps de l’électrophorèse.

9 L’électrophorèse des protéines est en principe différent de l’ADN, car les protéines sont formées des acides
aminés avec des charges positives et négatives. Pour faire un système d’électrophorèse plus similaire a celle
de l’ADN, on traite les protéines avec un détergent appelé sodium dodecyl sulfate, ou SDS. Ce détergent
dénature la protéine et le tapisse avec des charges négatives, produisant une molécule comme un fils dont le
nombre de charges négatives dépend de sa longueur. Des protéines contient parfois des ponts disulfure, donc
on les traite aussi avec de la 2-mercaptoethanol.

10 Pour faire l’électrophorèse des protéines, qui sont plus petites en général que les ADN, on utilise un gel
formé de polyacrylamide qui fait des trous plus petits. Ce technique s’appelle l’électrophorèse sur gel de
polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). On fait le gel sur la vertical, pas à l’horizontale comme pour
des gels agarose, car la solution d’acrylamide doit être à l’abri de l’oxygène pour polymériser. On fait un
sandwich de deux plaques de vitre, séparé par des espaceurs. On bloque le bas du sandwich avec du plastic, et
on couvre le dessus avec un peigne qui va produire des puits après la solidification. Encore ici, l’électrophorèse
va du haut en bas, et les protéines les plus petites migrent plus rapidement. On voit un exemple d’un gel de
SDS-PAGE ou on a suivi la purification d’une protéine a travers plusieurs étapes de chromatographie par
colonne. Dans la dernière colonne il ne semble avoir qu’une seule chaine polypeptidique de taille 40,000 Da.

11 Une variation de l’électrophorèse des protéines s’appelle l’électrophorèse bidimensionnelle. Cette

technique se passe en deux étapes dont la deuxième est le SDS-PAGE. Pour la première étape, appelé
focalisation isoélectrique, on utilise des protéines natives, dans leur conformation tridimensionnelle normale.
Cette première étape se fait dans un gradient de pH. Ceci est important, car la charge sur une protéine est
différente dépendamment de la pH. À pH 10 les protons sont enlevés des acides aminés, formant une charge
positive sur des groupements acides et aucune charge sur des groupements basiques. En contraste, à pH 4 les
protons sont ajoutés aux acides aminés, formant des charges positives sur des groupements basiques et
aucune charge sur les groupements acides. Une protéine donnée va avoir une charge nette négative à pH10 ,
et c’est ici qu’on place l’électrode négative. La même protéine va avoir une charge nette positive à pH 4, est
c’est ici qu’on place l’électrode positive. Pendant l’électrophorèse, ces deux formes de la protéine vont être
attirées vers le centre du gel. À une position qui dépend de nombre d’acides aminé acide et basique, une
protéine va trouver un pH ou le nombre de charges négatives égal le nombre de charges positives et la
protéine s’arrête de migrer. On distribue donc les différentes protéines avec une proportion différente des
acides aminés acide et basique le long du gradient de pH. Ce premier gel est traité avec SDS et 2-
mercaptoethanol et placé sur le deuxième gel, où on sépare des protéines selon leur taille, ou longueur. Ce
technique distribue des protéines sur une surface au lieu d’une ligne, et on peut visualiser plus que mille
protéines différentes sur un seul gel.

12 Pour détecter une protéine spécifique, on utilise toujours un anticorps, mais comme avec des analyses
Southern , on doit sortir les protéines du gel et les coller sur une membrane de nitrocellulose. Les transferts
après SDS-PAGE sont appelés des Westerns, et sont généralement faits par électrophorèse avec l’électrode
positive positionnée en arrière de la nitrocellulose. On ajoute des protéines comme de lait écrémé afin de
bloquer des sites ou les anticorps peut lier de façon non spécifique avant d’incuber la nitrocellulose avec notre
anticorps. Il y a plusieurs anticorps secondaires disponibles pour détecter nos anticorps primaires.

13 Dans cette question essaye de trouve un nom pour un transfert des ARN sur nitrocellulose.

Si vous avez choisi Northern, vous avez raison!

14 Pour cette question aussi, essayer d’y répondre avant de reprendre le diaporama.

Toutes ces réponses sont vraies. Notez que la réponse 1 peut avoir deux interprétations possibles, soit que la
protéine a été dénaturée avant et reste dénaturée pendant l’électrophorèse, ou alternativement que la
protéine n’a pas été dénaturée avant l’électrophorèse est devient dénaturée seulement pendant. Étant
donné que les reposes 2,3 et 4 sont vrai, la première interprétation pour le réponse 1 devrait être bon.

15 Dans ce problème, on va utiliser la technique de FISH afin de déterminer la localisation d’une protéine
Brca1 dans une cellule. Ici on connaît la séquence, et au lieu de purifier la protéine on va acheter trois petits
peptides d’environ 15 acides aminés chaque. On va appeler les anticorps produits par l’injection de ces
peptides dans un lapin des anticorps A, B et C. On fait le raccourci avec l’utilisation des peptides, car la
protéine entière, de taille 220,000 Daltons, a environ 2000 acides aminés et est peu soluble dans l’eau.

16 Les trois panneaux en haut représentent les images qu’on voit avec les trois anticorps. Curieusement, les
anticorps A et B donnent le même résultat, une localisation nucléaire, tandis que l’anticorps C suggère que
l’antigène se trouve dans la membrane plasmique et dans les vésicules sécrétoires. Afin de nous aider à
déterminer quelle localisation est vraie, on utilise les trois anticorps dans les analyses Westerns. On voit que
même si les trois anticorps réagi avec une protéine de 220 kilo Daltons, l’anticorps C semble réagir avec une
protéine de 180 kDa. Mettez le diaporama en pause afin de déterminer où se trouve Brca! Dans la cellule.

La bonne réponse est le noyau. On ne dit pas ça parce que deux anticorps sur trois ont donné cette
localisation, mais parce que l’anticorps C, celle qui donne la membrane plasmique, semble avoir une réaction
très importante avec une protéine de 180 kDa sur Western. L’interprétation plus raisonnable est que
l’immunolocalisation que l’on voit avec l’anticorps C est de cette protéine de 180 kDa.
Comment est-ce possible qu’un anticorps fait contre le peptide d’une protéine puisse lier un autre? Une
possibilité est que la partie de la protéine que l’on a choisie fait partie d’un domaine partagé avec d’autres
protéines. La protéine de 180 kDa pourrait être une, et si cette protéine est plus abondante que Brca1 on va
juste voir lui sur des coupes.

Cours 3 Concept 3

1 Dans cette concept on va regarder comment faire les ADN recombinant. Ces techniques nous permettre de
modifier des séquences d’ADN et de les produire en grand quantité. On a déjà vu les résultats de ces
techniques lorsqu’on a faites des protéines fusion.

2 Les ADN recombinant sont des molécules d’ADN mis ensemble dans un laboratoire qui ne se retrouveront
pas ensemble dans la nature. On utilise des ADN recombinant pour entre autre, les cloner (produire une
séquence en particulier en grande quantité).

3 Dans cette question on propose de cloner un individu pas simplement une séquence d’ADN. Réfléchissez un
moment avant d’y répondre.

Un clone est effectivement un individu avec exactement le même bagage génétique que nous. Par contre,
l’utilisation des organes de rechange n’est pas éthique car ce clone est une personne comme nous. Un
exemple des clones naturels sont des jumeaux identiques.

4 Il y a deux façons majeures pour générer un très grand nombre de copies d’une molécule d’ADN. La
première s’appelle le clonage dans les bactéries. Cette technique a été rendu possible par la découverte des
enzymes de restriction, des enzymes chez les bactéries qui sont capable de lier spécifiquement une séquence
précise d’environ six nucléotides ,dans une molécule d’ADN et de la couper en deux.

5 Les enzymes de restriction ont probablement évolué pour restreindre la capacité de bactériophages de se
propager dans une cellule bactérienne. Il y a plusieurs milliers d’enzymes connus, chacun d’eux coupe une
molécule d’ADN a un séquence différent. Certaines des enzymes de restriction génèrent des extrémités
franches, ou les deux brins de l’ADN ont la même longueur. D’autre enzymes produisent des extrémités
cohésives, ou soit l’extrémité 5’ est plus longue ,soit l’extrémité 3’ est plus longue. Si les extrémités sont
cohésives, seulement une séquence complémentaire peut se lier. Le processus que l’on appelle ligation fait un
lien covalent entre deux molécules d’ADN, et généralement on peut faire la ligation de seulement deux
fragments coupés par la même enzyme (par 2 séquences cohésives identiques).

6 Afin de cloner une molécule d’ADN ,on va liguer ensemble une molécule et une plasmide, ou vecteur de
clonage, les plasmides sont une séquence d’ADN qui peut se répliquer de façon autonome dans une bactérie.
Parfois ,on fait le clonage de seulement une séquence, mais d’autre fois on veut générer une banque d’ADN,
un population de bactéries ou chaque bactérie contient un parmi un très grand nombre de séquences. Par
exemple, on peut cloner l’ADN provenant du génome d’un organisme formant un banque génomique. Pour ce
faire, on coupe l’ADN génomique d’un organisme et un vecteur approprié avec le même enzyme de
restriction. Ensuite, on fait la ligation entre les deux dans les conditions ou préférentiellement une seulecopie
de l’ADN génomique est liée par vecteur. Lorsqu’on introduit ces ADN recombinant dans une population de
bactéries par transformation, on va finir avec une population de bactéries dont chaque bactérie a une
séquence et que cette séquence est unique dans la population, donc avec la condition que chaque bactérie ne
reçoit qu’1 seul vecteur. Étalé sur un boite de pétri, chaque bactérie croît, et produit une colonie formée
d’environ un million de cellules. Et chaque bactérie dans la colonie, contient le même fragment de l’ADN
génomique.

7 Une autre façon de cloner une molécule d’ADN utilise une technique que l‘on appelle une réaction en chaine
par polymérase, ou PCR (de l’anglais polymerase chain reaction). Cette méthode profite de l’action catalytique
d’une polymérase d’ADN. Cet enzyme lie une molécule d’ADN formé de deux brins dont un est plus long que
l’autre. Pour avoir un activité de polymérisation, le brin avec l’extrémité 3’,est utilisé pour recevoir des
nucléotides, et donc doit être plus court que son complément ( de l’autre brin). La polymérase d’ADN fait un
lien covalent entre le premier phosphate sur le coté 5’ d’une nucléotide triphosphate (dites un NTP) et cette
nucléotide agi sur l’hydroxyle sur l’extrémité 3’. L’identité de la NTP est déterminée par sa complémentarité
avec la nucléotide sur l’autre brin, appelé le brin matrice, ce qui explique pourquoi l’extrémité 3’ doit être plus
courte. On dit que les polymérases que leur activité de polymérase à la direction 5’ à 3’, car cela représente la
direction de croissance sur le brin on est en train d’ajouter des nucléotides.

8 Dans la réaction PCR ,on mélange une molécule d’ADN et deux petites séquences appelées amorces , qui
sont complémentaires aux extrémités de la séquence qu’on veut amplifier. La première étape est de chauffer
le mélange à 95 degrés afin de séparer la molécule d’ADN. Ensuite, on descend la température à 55 degrés,
permettant aux amorces de s’hybrider avec leur séquence complémentaire. Enfin, on monte la température à
72 degrés, la température optimale pour la polymérase. Ceci est un polymérase d’ADN provenant d’un
organisme qui croît normalement dans les source chaudes de 70 degrés. Après ces trois étapes, on a doublé le
nombre de molécules à deux molécules. Si on répète le même cycle de trois étapes ,on va encore doubler le
nombre de molécules d’ADN à quatre. Après 30 cycles, on a environ un milliard, ou 2 a la puissance 30,
molécules d’ADN. Toutes les molécules d’ADN amplifiées ont exactement la même séquence.

9 Une réaction PCR peut commencer avec une seule molécule. Cependant, la détection des produits de la
réaction a typiquement besoin de commencer avec plus qu’une molécule. On peut déterminer
expérimentalement la qualité de l’ADN nécessaire en diminuant la quantité de la brin matrice à une
concentration ou on ne voit plus le produit. Dans cette expérience , le seuil de détection est autour de 10
cellules originales.

10 Les analyses d’ADN par PCR peuvent être utilisées pour caractériser l’équivalent des empreintes digitales
qui sont présentes dans les séquences d’ADN. On choisit des amorces qui nous permettent d’amplifier des
séquences d’environ 5 bases répétées plusieurs fois dans plusieurs endroits dans le génome. Le nombre de
répétitions détermine la longueur des fragments amplifiés, et leur longueur peut être visualisée par
électrophorèse. Chaque individu (sauf jumeaux identiques) a un patron de fragments différents. Dans
l’illustration à droite, on voit deux patrons différents, 1 de l’accusé et un autre différent de la victime.
L’échantillon 2, ayant obtenu du sang sur l’accusé, démontre que le sang vient de la victime.

11 Le PCR doit être utiliser avec des molécules d’ADN parce qu’on utilise une polymérase d’ADN. Par contre,
on peut transformer un ARN en ADN, permettant la détection des ARN par PCR. La transformation de l’ARN
en ADN utilise un enzyme (un transcriptase inverse), provenant d’un rétrovirus. Les rétrovirus ont un génome
d’ARN qui est transformé en ADN suite à l’infection d’une cellule par la transcriptase inverse qui entre en
même temps que le génome du virus.

12 Il y a plusieurs raison de vouloir cloner des molécules d’ADN.

13 Le plus important raison est le séquençage, car ceci nous permet d’identifier la molécule. L’identification se
fait par une comparaison entre la séquence de notre ADN , avec la séquence de tout autre séquence déposé
dans les banques de données. Les analyses appelés BLAST (pour basic local alignment search tool) sont utilisés
pour déterminer les séquences identiques ou similaires.

14 Le clonage nous permet aussi de transformer d’autres cellules, permettant la génération des organismes
génétiquement modifiée. À gauche, on voit des poissons qui expriment la GFP, et qui fluorescent sous la
lumière ultraviolette. À droite, on voit un épis de maïs qui exprime une protéine appelée Bt, toxique aux larves
d’insectes.

15 Une bactérie transgénique peut être programmé à synthétiser beaucoup de protéines taguées , ce qui
pourrait permettre sa purification et sa cristallisation afin de déterminer sa structure par cristallographie aux
rayons X. On peut aussi utiliser des protéines purifiées pour faire une étude des caractéristiques
fonctionnelles, comme pour les enzymes.

16 Faites pause ici afin de trouver la bonne réponse.

La bonne réponse est d. Pour comprendre cette réponse, il faut réaliser que le brin complémentaire a aussi la
séquence 5’-ACCGGT-3’, et cette séquence va aussi être coupée entre l’adénine et la cytosine. Ceci va produire
une extension 5’ simple brin dont la séquence est 5’-CCGGT-3’. Seulement Mro1 est capable de produire la
même extension parmi les différents choix. Notez que la paire de bases AT est sous forme double brin et ne
peut pas contribuer à la liaison entre les deux séquences.

Cours 3 Concept 4

1 Dans ce concept, on va discuter du séquençage. On a déjà vu le lien étroit entre la séquence, la structure et
la fonction, donc l’importance de déterminer la séquence d’une macromolécule.

2 On va voir le séquençage des ADN et des protéines. La chimie des deux est complètement différente, donc
les techniques de séquençage aussi. Parfois dans la vie quotidienne, on voit des évènements ou la séquence
est prévisible. La séquence d’une macromolécule est différente, car on ne peut pas la prédire. Encore plus
important, comme pour des mots, les séquences différentes des macromolécules vont dire des choses
différentes.

3 L’insuline était la première fois qu’on a séquencé une macromolécule. L’insuline est formée de deux parties
différentes d’une chaine polypeptidique, liées par des ponts disulfure. Essentiellement il a trouvé une façon
d’ajouter un produit chimique de façon spécifique à l’extrémité N terminal d’une protéine ou d’une peptide.
Ceci, couplé avec des expériences ou les protéines ont été coupés en petits morceaux par des traitements
chimiques ou enzymatiques, lui a permis de déterminer la séquence des acides aminés dans l’insuline avec
une séquence définie(chaîne polypeptidique avec ponds disulfure). Ceci a complètement révolutionné la façon
comment les scientifiques pensaient des protéines, car on ne pensait pas qu’un ordre de ces acides aminés
déterminé était même possible. Ces techniques initiales ne sont plus utilisées et on ne va pas les voir en détail.

4 Environ 20 années après le séquençage d’insuline, Sanger a rapporté une méthode pour le séquençage
d’ADN. Comme les protéines, les ADN sont des séquences linéaires de modules de construction. Mais puisque
les modules sont complètement différents des protéines, ils nécessitent une technologie complètement
différente.

5 La méthode de séquençage dite terminaison de chaine, ou séquençage de Sanger, est encore utilisé
aujourd’hui. Il y a deux ingrédients essentiels, dont le premier est la polymérase d’ADN. On sait que cette
enzyme ajoute l’extrémité 5’ d’un nucléotide phosphate sur l’extrémité 3’ d’une amorce, suivant les règles de
complémentarité avec un brin matrice – c’est ce que l’on appelle la synthèse 5’ à 3’. Le deuxième ingrédient
essentiel , s’appelle un didesoxyribonucleotide triphosphate. Ceci diffère d’un desoxynucleotide triphosphate
par l’absence d’un hydroxyle sur la position 3’ du ribose. L’ajout d’un nucléotide normal dans une chaine de
nucléotides en croissance , fait en sorte qu’un nouvel hydroxyle en 3’ est disponible pour ajouter le prochain
nucléotide à la chaîne. Mais l’ajout de la forme didesoxy bloque la synthèse, car il n’y a pas d’hydroxyle en 3’
pour faire un lien covalent avec un autre NTP.

6 Pour faire un séquençage, on va préparer quatre réactions différentes, toutes avec le même ADN matrice et
le même amorce, mais dans chacun, on va ajouter un didesoxynucléotide différent, ajouté au mélange des
NTP normal. La proportion de la forme didesoxy est choisie pour permettre la polymérisation d’environ une
bonne centaine de nucléotides avant que la forme didesoxy soit insérée dans la chaîne.

7 Il est important de réaliser que chaque réaction de synthèse se fait avec une population de molécules
d’ADN. Parce que la sélection de nucléotides didesoxy est aléatoire, on va finir avec une population de
molécules nouvellement synthétisée dont la longueur va être différente, car la place ou la forme didesoxy a
été insérée va être différente. Encore plus important, on sait que dans les réactions, celle qui contient
didesoxy ATP par exemple, chaque molécule d’ADN nouvellement synthétisée finie avec une adénine, car
seulement les adénine didesoxy ATP vont arrêter la synthèse. Dans chacune des quatre réactions, on produit
un groupe de molécules de longueur différentes, mais ou le nucléotide à l’extrémité 3’ dépend de l’identité de
la didesoxy nucléotide ajoutée.

8 Maintenant, après la synthèse on fait l’électrophorèse des quatre réactions, une à côté de l’autre, dans un
gel dont la résolution nous permet de séparer des fragments ,qui diffère de taille par seulement un nucléotide.
Ce que l’on voit, c’est un sorte d’échelle, mais où les différents échelons se trouvent distribuées parmi les
différentes réactions. Les plus petits fragments sont en bas, et dans l’exemple à gauche, ceci se trouve dans
une réaction dont tous les fragments se terminent par A. Le fragment qui est un nucléotide plus grand, se
trouve dans une réaction ou tous les fragments finissent par T, donc la séquence à date est AT. Le fragment
avec un nucléotide de plus, se trouve dans la réaction ou les extrémités en 3’ sont tous les G, alors la séquence
à date est ATG. Donc, la séquence de l’ADN est simplement lue du bas vers le haut du gel. Un exemple d’un
gel, où les fragments ont été marqué par des nucléotides radioactifs est détecté par exposition à un film, se
trouve à droite.

9 La grande avancée technique qui a permis le séquençage de 3 milliards de nucléotides dans le génome
humain est venue avec les robots qui faisaient une chromatographie sur filtration de gel, des réactions ou les 4
nucléotides didesoxy, chacune marquée avec une couleur fluorescente différente, se retrouvent dans la même
réaction. La chromato sur filtration de gel sépare des macromolécules par leur taille et chaque nucléotide de
plus sera détectée par sa couleur de fluorescence.

10 La prochaine étape dans l’évolution des techniques de séquençage, exploitait ce que l’on appelle les
techniques de « haut débit », des façons de faire plusieurs réactions de séquençage au même temps. Il y en
plusieurs de ces techniques disponibles maintenant, mais ici je vais vous montrer seulement un. Ce technique
s’appelle la pyrosequencage, un nom dérivé du fait qu’on mesure le pyrophosphate libéré d’un nucléotide
triphosphate lorsqu’un nucléotide est ajouté à une chaine croissante d’acides nucléiques par la polymérase
d’ADN. La façon de détecter la pyrophosphate dépend de deux autres enzymes, un qui produit un adénosine
triphosphate (ATP) à partir du pyrophosphate, et un autre qui utilise l’ATP dans une réaction bioluminescente.

11 Le pyrosequencage utilise une plaque avec plusieurs millions de puits, chacun lequel va éventuellement
contenir une petite bille tapissée d’ADN. Les billes ADN sont préparés par la ligation d’une petite séquence
taguée ,qui va servir comme amorce et de lier l’ADN à une bille, comme pour la chromatographie d’affinité.
Chaque bille commence avec seulement un fragment d’ADN qui est amplifié par PCR pour générer plusieurs
millions de molécules identiques sur la bille. Parce que le pyrophosphate est toujours produit lors de la
polymérisation indépendaemment de la nucléotide, il faut trouver une façon de déterminer l’identité du
nucléotide ajouté. Pour ce faire, un nucléotide à la fois passe à travers toute la plaque. La lumière est produite
seulement si ce nucléotide est ajouté à une molécule d’ADN, et parce qu’on enregistre la lumière émise par
chaque puits séparément, on peut savoir quel fragment a ajouté ce nucléotide. On fait plusieurs cycles des
A,G,C et T, un après l’autre, afin de déterminer la séquence de l’ADN dans chaque puit. Un exemple d’un seul
puit, se trouve à droite, qui démontre plusieurs puits individuels en train d’emmètre la lumière. Un exemple
d’un puits en fonction des cycles de quatre nucléotides se trouve à gauche. La séquence du fragment est
GCAGGCCT, car la polymérisation de deux nucléotides produit 2x plus de lumière.

12 La vidéo démontre une expérience de pyrosequencage avec l’ADN provenant des os des Neandertal. Cela a
été utilisé pour déterminer le génome des Néandertal. Il y a plusieurs différences dans la séquence des
nucléotides entre les humaines et les Néeandertal, mais seulement une faible proportion de ces différences va
produire une protéine avec une séquence différente. Les Neandertal sont donc parmi nos plus proches
ancêtres. Une analyse des séquences de protéines différentes a déterminé que seulement 83 protéines entre
hum/Néan= suggère que si on pouvait changer la séquence de ces 83 protéines, on pourrait changer l’identité
d’une cellule d’un humain à Néandertal.

13 Une question qui est soulevée par le séquençage du génome des Neandertal est qu’en principe, on peut
modifier le génome humain pour contenir ces mêmes différences. Ceci n’est pas vraiment une question de
science, mais de l’éthique. Est-ce qu’on devrait le faire?

14 On a déjà vu que les protéines, tout comme les ADN, sont les séquences linéaires de modules de
construction. Le défi est donc de trouver la chimie qui nous permette de déterminer la séquence de ces
modules.

15 La technique privilégiée maintenant exploite la spectroscopie de masse (la MS). Cette technique envoie une
molécule chargée dans un champ magnétique. Pour frapper un détecteur, les molécules doivent suivre une
courbe, et ceci est déterminée par la masse et la charge sur la molécule. Les MS mesurent les masses avec une
très grande précision.

15 Des protéines intactes sont typiquement trop massives pour le MS, donc elles sont coupées en fragments
par une protéase, typiquement la trypsine qui coupe les extrémités des acides aminés basiques (lysines et
arginines). Ensuite , le mélange est injecté dans le MS et la masse de chaque fragment tryptique est mesurée.
Pour des organismes dont le génome est connu, on peut demander à l’ordinateur de calculer le patron de
fragments pour chaque protéine dans le génome, et ensuite de comparer le vrai patron expérimentale avec
tous les patrons calculés. Lorsqu’on trouve un match, on sait l’identité de la protéine et donc sa séquence.

16 Pour des protéines provenant d’organisme où on ne dispose pas de la séquence génomique, une autre
approche doit être utilisée. Cette technique utilise deux MS, liées par une petite chambre qui contient un gaz
inerte. La première MS sépare les peptides typtiques, comme avant, mais au lieu de frapper le détecteur , il
passe à travers le gaz inerte, et cette coliision entre la chambre et le gaz casse les peptides en fragments. Il y a
un bris par peptide tryptique, toujours à un lien peptidique, et on finit avec une population de petits
fragments qui diffère dans leur taille par un acide aminé. On mesure donc la masse de chaque fragment, et la
séquence d’acides aminés dans le peptide tryptique est déterminée par la différence de masse des fragments
successifs. Cela nous permet d’identifier l’acide aminé qui a été ajouté pour générer le fragment le plus grand.
Ceci s’appelle le séquençage de novo.

17 En résumé, chaque ADN et protéine a une séquence particulière, et on utilise le séquençage pour le
déterminer, et ce , à travers plusieurs techniques de chimie possibles.

18 Faites pause afin de lire la question et tenter de le résoudre.

La bonne réponse est b. Parce qu’il n’y a pas de choix de modules dans la synthèse d’un polymère de
polysaccharide, et donc, cette synthèse n’a pas besoin d’information.

Cours 3 Concept 5

1 Dans ce dernier concept dans le module techniques, j’aimerais retourner à la transformation. La

transformation nous permet d’introduire un gène dans un cellule ou un organisme et donc de changer sa
comportement.

2 Il y a deux voies générales disponible pour la transformation, que j’appelle les techniques physiques et
biologiques.

3 La transformation chez les bactéries est généralement permanent. La transformation chez les eucaryotes est
plus complexe et peut être permanent ou temporaire. Parfois on parle de transfection, ou les gènes introduits
sont exprimés de façon transitoire, mais ici je ne ferais pas de distinction entre transformation et transfection.

4 La première expérience qui a mis en évidence la transformation des bactéries, a utilisé les bactéries
Streptococcus. Il y a deux formes de Streptococcus, une qui forme des colonies lisses sur une boite de Pétri, et
l’autre qui forme des colonies rugueuses. Les bactéries lisse sont tapissées d’une couche polysaccharidiques,
qui les protège contre la système immunitaire des animaux, et en conséquence, des souris injectées avec la
forme lisse meurent. En contraste, les souris injectées avec la forme rugueuse ne meurent pas. On peut tuer
les bactéries lisses, en les chauffant, et ces bactéries mortes ne tuent pas des souris après injection. Par
contre, si on injecte des souris avec un mélange de bactéries lisse vivant avec les bactéries lisses mortes, les
souris meurent. À l’époque, on a parlé de la transformation des bactéries non virulente en bactéries
virulentes. Aujourd’hui ,on va dire que les bactéries rugueuses ont été transformées avec un fragment d’ADN
contenant les gènes permettant la synthèse de la couche protectrice polysaccharidique, relâchée par des
bactéries lisses (chauffées, qui ont relâché leur ADN dans la solution ) après leur mort.

5 On a déjà vu des technique physiques pour la transformation, alors on passera aux techniques biologiques.

6 Le système biologique le plus utilisé avec des plantes exploite une bactérie, Agrobacterium tumefaciens, qui
est capable d’infecter une plante blessée et d’injecter son plasmide T dans une cellule végétale. Ce plasmide,
appelé le plasmide Ti, est incorporée dans le génome végétal et les gènes sur le plasmide lui permettent de
faire la synthèse des hormones de croissance végétale sont exprimé formant une galle, une sorte de tumeur
végétale. La section du plasmide T avec les gênes de croissance peut être remplacé avec n’importe quelle
séquence d’ADN. Les cellules qui ont incorporé le plasmide T peuvent être utilisées pour regénérer une plante
au complet, générant une plante transgénique.

7 Chez les animaux, des rétrovirus sont capables d’infecter des cellules, d’injecter leur génome, et
d’incorporer des gènes dans le génome de l’hôte. On a déjà vu des rétrovirus comme source de la
transcriptase inverse, et la conversion du génome d’ARN en ADN , ce qui est un prérequis pour la
transformation par rétrovirus. Une forme de thérapie génique exploite des rétrovirus, modifiés pour avoir un
gène bénéfique. Les cellules des animaux infectés par des rétrovirus , modifiés, peuvent incorporer et
expriment une nouvelle gêne. Dans des expériences de type thérapie génétique, un gène encodant une
protéine défectueuse dans le développement du système immunitaire a été introduit dans les patients mutant
sans système immunitaire. Les expériences ont été très prometteuses, mais avec le temps, certains des
patients ont développé des cancers parce que le nouveau gène peut s’insérer de façon aléatoire dans le
génome de l’hôte.

8 Une nouvelle avancée technologique, appelé CRISPR-Cas9, permet de cibler une région précise pour
l’insertion d’un transgène. En 2019, un chercheur chinois a rapporté la naissance de deux jumelles dont le
génome a été modifié par cette technique. Les critiques de cette expérience disent qu’on est sur le point de
changer l’espèce humaine, ce qui soulève un autre problème éthique à l’utilisation de cette technique.

9 Le système CRISPR-CCas9 a été caractérisé initialement chez certaines bactéries. Lorsqu’infectées par un
virus, quelques molécules d’ADN viral sont dégradées et insérées dans un locus génétique appelle CRISPR
(clustered regularly interspersed short paindromic repeat). Ce locus peut être transcrit, formant des ARN, et
ces ARN lient une nucléase appelée Cas9 (CRISPR associated). La séquence de l’ARN agit comme un guide pour
que la nucléase Cas9 cible l’ADN viral pour dégradation, formant ainsi une sorte d’immunité bactérienne
contre un nouvelle infection.

10 Les modification dans cette technique permettent de remplacer de façon spécifique la section d’un
chromosome contenant un mauvais gène. On doit injecter des gènes encodant Cas9 en plus que deux ARN
guides, qui vont définir les 2 extrémités du fragment d’ADN qu’on veut remplacer. On doit aussi injecter un
ADN qui contient la bonne copie du gène. Un fois coupée, la cellule le remplace par un processus appelé
recombinaison homologue, qui utilise le même mécanisme utilisé pendant la méiose. On peut aussi remplacer
une bonne copie d’un gène avec une forme mutante, ce qui génère les knock-out, dont le phénotype nous
informe sur la fonction du gène.

11-12-13-14 Pk introduire un segment d’ADN? 1)Une raison de vouloir introduire des gènes est de déterminer
la fonction d’un gène. On peut également introduire un gène afin d’étudier son expression. Dans l’exemple
démontré ici, deux protéines fluorescentes ont été introduites dans la même cellule, tous deux ont été
découvert avec la même séquence régulatrice. 2)On peut voir par la couleur variable des bactéries que
l’expression semble être différente dans les différentes cellules (à partir de la même cellule régulatrice). 3)On
peut également générer les organismes génétiquement modifiés, qui veulent dire leur donner un phénotype
désiré, afin de produire des plantes résistantes à l’attaque des insectes. 4) Une façon d’exploiter des
organismes génétiquement modifiés, est la création des usines biologiques pour la synthèse des protéines, par
exemple l’insuline , qui est utilisée pour traiter des gens diabétiques.

15 En résumé, la transgénèse est une technique très puissante pour étudier la fonction de nos gènes et de
modifier le phénotype des organismes.