Techniques d’analyses biologiques

Pr AMIR Soumia
Historique

■ Déjà dans l’antiquité l’homme était fasciné par la protection qu’il pouvait obtenir
contre telle ou telle maladie après avoir subit celle-ci.

■ Après 1900, qu’on a découvert que le facteur de protection apparaît dans le sang, des
anticorps ou des protéines produits in vivo (les immunoglobulines).
Réponses immunitaires
■ Les réponses immunitaires correspondent aux mécanismes de défenses de
l’organisme qui discriminent le « soi » du « non-soi ».

■ Ces mécanismes sont devenus de plus en plus complexe au fur et à mesure de

l’évolution des espèces afin de combattre des agents pathogènes évoluant
également sans cesse. Parmi ces agents pathogènes on compte les bactéries, les
virus, les parasites et les cellules tumorales.
Les antigènes

■ Les antigènes sont par définition des molécules naturelles ou synthétiques dont la

reconnaissance spécifique par des anticorps ou par des cellules du système immunitaire
provoque le déclenchement de la réponse immunitaire.

■ Les antigènes sont le plus souvent des protéines, des glycoprotéines ou des
polysaccharides, etc.
 Immunogène

■ On dira qu’une protéine donnée est un antigène mais on ne peut présumer du type de
réponse qu’elle induira chez un individu donné et selon un mode d’administration
particulier.
 
 
■ Un immunogène est un antigène capable d’induire une réponse immunitaire. Tous les
immunogènes sont donc des antigènes mais tous les antigènes ne sont pas
nécessairement des immunogènes.

■ L’adjectif immunogène prend aussi une connotation quantitative : plus la réponse sera
forte et induite facilement, plus l’antigène sera dit immunogène.

■ Evidemment, un antigène n’aura pas nécessairement la même immunogénicité chez

tous les individus et pourra être très immunogène chez l’un et beaucoup moins chez
l’autre.
 
Différents types d’antigènes

Antigènes exogènes

Ils sont étrangers à l’individu et peuvent être :

● allogéniques : issus de la même espèce
● xénogéniques : issus d’autres espèces

Antigènes endogènes

Ce sont des antigènes propres à l’hôte (auto-antigènes) et pouvant être considérés

comme étrangers. 
Antigènes naturels

Protéines
Les antigènes de type protéique sont très immunogènes et souvent utilisés pour
fabriquer des vaccins (pour cela, il faut un PM minimum de 1500 Da).

Polyosides

Ce sont des polymères à structure ordonnée constitués d’épitopes identiques se

répétant.
Deux types :
♦ homopolyosides : ose unique répété
♦ hétéropolyosides : motifs répétés formés de 2 à 6 oses.

Les polyosides sont des constituants ubiquitaires à la surface cellulaire, ils sont
également très immunogènes.
Lipides

Ils sont généralement très peu immunogènes sauf s’ils sont associés à des protéines.

Acides nucléiques

Leur immunogénicité est très faible même s’il existe des anticorps anti-ADN. De la
même manière que pour les lipides, on peut augmenter leur pouvoir immunogène en
les associant à des protéines.
L’épitope

L’épitope est la région de l’antigène reconnue de façon spécifique par les anticorps et les
récepteurs membranaires des lymphocytes B (BCR) et des lymphocytes T (TCR).
Haptène

■ Un haptène est une substance différente des constituants de l’organisme mais de faible
masse moléculaire, donc n’est pas antigénique.

■ Un haptène peut se lier à des produits de la réponse immunitaire mais n’induit jamais,
à lui seul, de réponse immunitaire. Il est réactogène, mais seul, n’est pas immunogène.

■ Le terme d’antigène est réservé à des substances qui au moins dans certaines
conditions sont capables d’induire une certaine réponse immunitaire alors que le terme
d’haptène est réservé à des substances qui quoi qu’on fasse ne seront jamais capables de
le faire.
■ Les haptènes nécessitent toujours un couplage avec une molécule transporteuse afin
d'engendrer une immunogénicité.

■ Haptène à fonction réactive : 2,4 Dinitrophenol ou DNP.

■ Un peptide de petite taille peut également réagir comme un haptène.

Types de réponses immunitaires

■ Deux types de réponses immunitaires rentrent en jeux :

♦ D’une part la réponse immunitaire innée (ou naturelle) qui est immédiate.
♦ D’autre part la réponse immunitaire adaptative (ou spécifique) qui est tardive.
 Réponse immunitaire innée

■ La réponse immunitaire innée est induite par un signal danger émis suite à
l’interaction spécifique entre :
♦ Des récepteurs du soi appelés PRR (pour « Pattern Recognition Receptors »)
et
♦ Des molécules du non-soi appelées PAMP (pour « Pathogen Associated Molecular
Patterns ») présent au niveau des microorganismes qu’ils soient pathogène ou non.
La réponse immunitaire innée

■ Elle est mise en jeu immédiatement et est fonctionnelle 4 jours (96 heures).

■ Elle met en jeu différents modules de défense :

 
- Des modules constitutifs comme la barrière peau-muqueuse.
- Des modules induits comme la phagocytose et la réponse inflammatoire, qui nécessite
les cellules phagocytaires et les cytokines.
 Le système du complément
■ Le système du complément est un groupe de 35 protéines connues du sérum, faisant
partie de l'immunité innée.

■ c’est un ensemble de protéines circulantes ou membranaires du sang, principalement

sécrétées par le foie. Leur rôle initialement reconnu était de compléter l'action des
immunoglobulines sériques, d'où leur nom.

■ 12 de ces protéines sont directement impliquées dans les mécanismes d'élimination

des pathogènes, les autres régulent finement l'activité des premières afin d'éviter une
réaction auto-immune.
■ En l'absence de ces protéines thermolabiles (qui perdent leur qualités à une
température déterminée), les immunoglobulines thermostables spécifiques sont
incapables d'entraîner la lyse de leur cible.

En effet, en portant le sérum à une température de l'ordre de 56 °C, on lui retire ses
activités lytiques non spécifiques et spécifiques qui seraient néfastes pour son
utilisation ultérieure.
■ Les différentes protéines du complément sont des pro-enzymes inactives et qui sont
activées en cascade par clivage. Le clivage libère une fraction ayant une activité
enzymatique de protéase, et un petit fragment qui possède souvent un rôle sur les
cellules inflammatoires.

■ Il y a trois voies biochimiques qui activent le système du complément : la voie

classique du complément, la voie alterne du complément et la voie des lectines liant les
résidus mannose des membranes bactériennes.
■ Le complément peut s'activer en l'absence d'anticorps, dans le cas de la voie alterne
et de la voie des lectines, c'est pour cela qu'il est uniquement considéré comme faisant
partie de l'immunité innée.

■ Néanmoins, la voie dite classique d'activation débute par la reconnaissance

d'anticorps et fait à ce titre partie de l'immunité acquise (dite aussi adaptative).
 Le complément

■ Le système du complément :
♦ Synthétisé par les macrophages et les hépatocytes
♦ Circule habituellement sous forme inactive

■ Cascade d’activation séquentielle qui convertit chaque pro-enzyme dans son état
actif et amplifie la réponse

■ Le complément montre que immunité innée et immunité acquise doivent être

considérées comme deux systèmes collaborant pour élaborer la réponse immunitaire
et non comme deux systèmes indépendants. 
 Fonctions du complément

Le système du complément possède plusieurs fonctions importantes :

♦ Certaines protéines se lient de façon covalente au pathogène permettant ainsi son
opsonisation par les phagocytes possédant des récepteurs au complément.

♦ De petits fragments de protéines agissent comme des chimio-attractants pour

recruter et activer un nombre croissant de phagocytes au site d’infection : activation
du système immunitaire .
♦ Des composés terminaux s’organisent en un complexe protéique capable de créer
des pores dans les membranes bactériennes : la cytolyse d'une cellule ou d'un agent
pathogène..
 Les cytokines
Hormones du système immunitaire : Petites protéines secrétées par différentes cellules de
l’organisme. Elles modulent les réactions immunitaires contrôlant les activités du système
neuroendocrinien (autocrine, paracrine, endocrine).
LES CELLULES DU SYSTEME IMMUNITAIRE
 Les cellules NK
Les cellules NK (Natural Killer) sont des grands lymphocytes granuleux (ou LGL = large
granular lymphocyte) représentant 5 à 10 % des lymphocytes circulants et capables de
détruire des cellules infectées par des virus et certaines cellules tumorales en déchargeant le
contenu de leurs granules.
Les mastocytes
 
♦ Les mastocytes sont présents dans la plupart des tissus bordant les vaisseaux sanguins.
 
♦ Ils contiennent de nombreux granules riches en médiateurs de l'inflammation comme
l'histamine et le PAF (platelet-activating factor).

Les cellules dendritiques

 
Les cellules dendritiques sont caractérisées par de longs prolongements
cytoplasmiques rappelant les dendrites des neurones. Elles appartiennent à la lignée
des monocytes/macrophages.
■ Les PRR sont des groupes de récepteurs, dont les gènes ne sont pas polymorphe,
ils sont tous les mêmes au sein d’une espèce.

■ Ces récepteurs sont exprimés au niveau de différentes cellules : les

macrophages, les cellules dendritiques (CD), les cellules NK (« natural killer »),
les polynucléaires, les mastocytes et les cellules résidentes (fibroblastes, cellules
musculaires, cellules épithéliales).
 Etapes de la réponse immunitaire spécifique

■ Reconnaissance de l'antigène et sélection clonale : le lymphocyte B étant capable

de reconnaître la molécule étrangère sera sélectionné et cette sélection va provoquer
l'activation des lymphocytes B.

■ Prolifération clonale : le lymphocyte B sélectionné va subir des mitoses successives

et on aura alors des clones qui auront tous le même anticorps membranaire.

■ Différenciation des lymphocytes B en plasmocytes : une partie des lymphocytes B

va se transformer en plasmocytes (cellules sécrétrices d'anticorps ayant une longue
durée de vie) et l'autre partie se transformera en lymphocytes B de mémoire.

■ Formation de complexe immun : les anticorps synthétisés par les plasmocytes vont
être libérés dans les liquides extra-cellulaires et vont se lier aux antigènes qui ont
induit leur production. Un complexe immun est l'ensemble anticorps/antigène et
celui-ci sera éliminé par exocytose.
 Les lymphocytes

■ Les lymphocytes sont les cellules majeures de la réponse immunitaire adaptative qui
font partis des leucocytes.

■ Chez l’Homme, les lymphocytes B arrivent à maturité dans la moelle osseuse. Ils
sont caractérisés par la présence d’un BCR qui leurs permettent de reconnaître des
fragments antigéniques.

■ D’autre par les lymphocytes T (LT) ou cellule T, dont la lettre « T » provient du «

Thymus », organe humain dans lequel les LT arrivent à maturité. Ils sont caractérisés
par la présence d’un TCR qui leurs permettent de reconnaître des fragments
antigéniques.

■ Les lymphocytes ont différentes localisations suivant leur stade de maturité, en effet
ils sont d’avantages présents aux niveaux des organes lymphoïdes secondaires, du sang
et de la lymphe lorsqu’ils ne sont pas encore activé, et ont une localisation ubiquitaires
lorsqu’ils sont activés.
 BCR et TCR
■ La réponse immunitaire spécifique est mise en jeu quand les antigènes sont fixés
spécifiquement par des molécules de reconnaissance appelées récepteurs pour l'antigène.

Il en existe deux types :

- les immunoglobulines (Ig)
-les récepteurs des lymphocytes T
(TCR :T cell receptor)

• Les Ig se présentent sous deux formes :

- solubles = les anticorps,
- membranaire = les récepteurs des lymphocytes B
-(BCR : B cell receptor)

• Les TCR n'existent que sous forme membranaire.

NB: les immunoglobulines devient un anticorps quand il reconnait un antigène

 Les TCR

■ Les TCR sont des récepteurs membranaires caractéristiques des lymphocytes T, on ne

les trouve donc nulle part ailleurs.

Ils procurent aux LT la propriété de reconnaitre des fragments peptidiques antigéniques

associés aux molécules du CMH et ceci de manière spécifique.

■ La structure globale des lymphocytes T est identiques, ils se distinguent par leurs TCR
toujours accompagné du cluster de différenciation CD3, ainsi que du CD4 ou du CD8
suivant le lymphocyte considéré.
 LES MOLECULES DU CMH

Les gènes du complexe majeur d'histocompatibilité

 
■ Le Complexe Majeur d’Histocompatibilité (CMH) est une région du génome dont
les gènes codent pour les molécules (peptides) d’histocompatibilité qui sont
présentent à la surface de cellules présentatrices d’antigène et qui assurent la
présentation des antigènes aux lymphocytes T afin de les activer.
 Les clusters de différenciation (CD)

■ Les clusters de différenciation (CD) sont des antigènes exprimés par les
populations cellulaires du système immunitaire et déterminent le type cellulaire et
éventuellement leur fonction.

■ Ce sont des marqueurs des surfaces cellulaires, tels que les reconnaissent des jeux
spécifiques d'anticorps utilisés pour identifier le type de cellule, l'étape de
différenciation et l'activité d'une cellule. Plus de 360 CD différents ont été
identifiés.
Les anticorps

Isotypes = définissent les classes et sous classes :

-Ig G (I, II, III, IV)

- Ig A (I, II)
- Ig M, Ig D, Ig E
- Ig kappa, Ig lamda

• paratope = structure qui se lie à l'épitope de l'antigène

Structure schématique d’un immunoglobulines
 Antigènes, déterminants antigéniques et épitopes

■ Pour qu’une protéine soit immunogène, elle doit pouvoir induire une réponse des
lymphocytes T
 
■ Le BCR, qui est une immunoglobuline de membrane (Ig), reconnaît l'antigène sous sa
forme native (complexe binaire = BCR + Ag).
L'antigène peut être une protéine, un polysaccharide, une glycoprotéine.

■ Le TCR ne reconnaît que des antigènes protéiques qui ont été découpés en
polypeptides, associés à des molécules CMH de classe I ou II et présentés à la surface
de cellules (complexe ternaire = TCR + Ag + CMH).
 
■ Les macromolécules (comme les protéines) et les micro-organismes, expriment de
nombreux épitopes différents : un antigène est le plus souvent une mosaïque de
déterminants antigéniques.
 
CMH 1

■ Les gènes de classe 1 codent pour les molécules de classes 1 du CMH.

■ Les molécules du CMH-I codées par ces gènes sont présentes sur toutes les cellules
nucléées de l’organisme (donc pas les globules rouges) à des taux variables (expression
la plus importante au niveau des lymphocytes).

■ Les molécules de classes I du CMH permettent la présentation du peptide antigénique

aux lymphocytes T. CD8, les LT-CD8 qui deviendront des LT cytotoxiques.
CMH 2

■ Les gènes de classe 2 codent pour les molécules de classes 2 du CMH.

■ Les molécules du CMH II codées par ces gènes sont présentes sur un nombre de
cellules beaucoup plus restreint : les monocytes, les macrophages, les cellules
dendritiques, les lymphocytes B et les cellules épithéliales du thymus.

■ On appelle ces cellules les cellules présentatrices d’antigènes (ou CPAG) qui ont
pour fonction de présenter les molécules d’Ag à une série de lymphocytes T, les LT-
CD4 qui deviendront des LT helpers (ou LT auxiliaire).

■ Certains des gènes, les gènes de classe 3  faisant partie du CMH n’ont pas de fonction
de présentation de l’antigène mais codent pour d’autres molécules jouant un rôle dans les
défenses immunitaires.
Les molécules CD1

■ A côté des molécules de classe 1 et de classe 2 du CMH, il existe d’autres

molécules ayant la capacité de présenter des antigènes, ce sont les molécules CD1.
Ces molécules sont structurellement proches des molécules de classe 1 du CMH.

■ Elles ont la caractéristique de présenter des lipides et des glycolipides qui seront

reconnu par le TCR présenté par les cellules NKT et les lymphocytes présentant
un TCR-γδ.
NB/ Retenir l'impossibilité du TCR à reconnaître l’antigène natif puisqu'une
troisième molécule intervient : celle du CMH. Le TCR est un récepteur bien
particulier qui doit à la fois reconnaître le peptide antigénique et la molécule CMH
(de classe I ou II). C’est ce que l’on appelle parfois la restriction de la
reconnaissance de l’antigène par le CMH (Zinkernagel – prix Nobel 1997).
Analyses immunologiques
■ On a découvert que ces réactions immunologiques avaient un fondement chimique et
qu’elles pourraient avoir lieu non seulement in vivo, mais aussi in vitro.

■ Ces constatations ont permis de mettre au point des méthodes d’analyses

immunochimiques dites (titrages immunologiques).

■ Ces titrages exploitent la propriété de reconnaissance moléculaires des anticorps.

Avant d’appliquer les méthodes immunochimiques à la détection et au dosage

d’antigène. Il faut préparer les réactifs biologiques qui interviennent dans ces
méthodes : les anticorps chez les animaux supérieurs en leur inoculent l’antigène.
 Anticorps monoclonaux et polyclonaux

- Un agent pathogène (bactérie, virus, etc.) est reconnu par le système immunitaire par
l'intermédiaire d'antigènes. Un antigène possède généralement
plusieurs épitopes différents qui sont autant de sites de liaison aux anticorps.

- On peut classer une population d'anticorps selon sa capacité à reconnaître un seul

ou plusieurs épitopes.
Anticorps polyclonaux

■ Les anticorps polyclonaux sont un mélange d'anticorps reconnaissant différents

épitopes sur un antigène donné, chaque idiotype étant sécrété par un clone de
plasmocytes différent. Au cours de la réponse immunitaire, un organisme synthétise des
anticorps dirigés contre plusieurs épitopes d'un antigène : la réponse est dite polyclonale.
Sérum polyclonal (=immun serum = anticorps polyclonal) :

■ C’est un immunsérum qui contient un mélange d'anticorps provenant de LB

différents. C’est un sérum qui renferme des Acp de classes et de sous-classes
différentes, d’affinités diverses et reconnaissent plusieurs déterminants antigéniques.

-obtention : en injecte un antigène avec 3 épitopes à un lapin ; il produit 3 LB

différents reconnaissant les 3 épitopes ; différenciation en 3 plasmocytes différents et
donc sécrétion de 3 anticorps.
Sérum polyclonal (=immun serum = anticorps polyclonal) :

■ Pour la production Sérum polyclonal, on peut utiliser des lapins, des souris, des
chèvres, des moutons, des poulets, des chevaux, etc.

Ag : de différente nature ou pour les haptènes (< 3 kDa) ou les peptides

synthétiques (10-15 AA), sont couplés a une protéine porteuse de haut PM ( ≪
carrier ≫) ex : BSA, thyroglobuline, hémocyanine… par l’action d’agents de
couplage ex : glutaraldéhyde (NH2, SH), carbodiimides (NH2, COOH).

Voies d’administration : sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et

intraveineuse.
■ In vivo, la réponse est toujours polyclonale, sauf cas
exceptionnels :

♦ vaccination : anticorps polyclonal monospécifique qui est en fait un

anticorps qui reconnaît différents épitopes du même antigène.
 Anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type
d'épitope sur un antigène donné. Ils sont tous identiques et produits par un seul clone
de plasmocyte.
Les anticorps monoclonaux sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la
fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.
■ Les anticorps monoclonaux utilisés comme médicaments se terminent par « mab »,
acronyme de « monoclonal antibody » par exemple :

- Trastuzumab (Herceptin ® ), utilisé dans les cancers du sein dit ‘Her2' positif et
certains cancers de l'estomac,
- Cetuximab (Erbitux ® ), utilisé dans les cancers du colon, les cancers ORL, les
cancers bronchiques,
-Bevacizumab (Avastin ® ) : utilisé dans les cancers du colon, les cancers du rein, les
cancers bronchiques, les cancers du sein, les cancers de l'ovaire,
- Rituximab (Mabthéra ® ), utilisé dans les lymphomes,

■ Ils sont par exemple utilisés dans les tests de grossesse du commerce, ainsi que dans
de nombreux domaines de la recherche en biologie et par de nombreuses techniques
(cytométrie en flux, western blots...).

■ Ils sont aussi de plus en plus utilisés dans les tests en laboratoire d'immuno-
hématologie pour rehausser les réactions positives.
 Historique des MAB :
Durant les années 1970, il était connu qu'un cancer (myélome) des cellules B produisait
de grandes quantités d'anticorps identiques.

En 1975 : Georges Köhler et César Milstein ont publié dans Nature une technique de
production d'anticorps monoclonaux.
♦ 1984 : anticorps monoclonaux chimériques souris/homme.
♦ 1986: premier anticorps monoclonal mis sur le marché : Muromomab (anti-CD3)
♦ 1989 : anticorps monoclonaux humanisés.
♦ 1994: production d’anticorps monoclonaux humains par des souris transgéniques ou
trans-chromosomiques.
Principe

■ Afin de produire des lignées stables de cellules produisant l'anticorps désiré, Kohler et
Milstein ont élaboré l'idée de la méthode de fusion de deux types de cellules.
Production
Plusieurs étapes sont nécessaires pour l'obtention d'anticorps monoclonaux :

1- Immunisation
La première étape est l’inoculation, généralement par voie péritonéale d'un antigène ou
d'un haptène à un animal de laboratoire, (souvent la souris, le rat ou le lapin), ce qui a
pour effet de produire des plasmocytes libérant des anticorps contre cet antigène.
■ Plusieurs protocoles d'immunisation sont possibles en variant les doses, les intervalles
des injections, l'adjuvant utilisé et la durée du traitement.

■ L'adjuvant utilisé est principalement l'adjudant de Freund; soit incomplet (émulsion

d’huiles, d’eau et d’émulsifiants (savons) qui piège l’Ag) soit complet (complexe d’eau,
d’huiles, d’émulsifiants et de morceaux de bactéries tuées).
 Fusion
■ L'animal est sacrifié et les cellules B sont isolées à partir de la rate.
Les cellules B, ne pouvant se multiplier mais produisant les anticorps désirés, sont
fusionnées avec des myélomes (cellules cancéreuses, donc aptes à une division cellulaire
rapide et immortelles).

Hybridomes
■ Cette étape de fusion peut être effectuée en utilisant le PEG ou par
électroporation.

♦ Le PEG polyéthylène glycol est utilisé pour fusionner deux cellules en vue de
l'obtention d'hybrides somatiques.

♦ Dans l'électroporation, on applique un champ électrique sur les

membranes qui sont ainsi déstabilisées, et l'ADN chargé négativement
présent dans l'espace extracellulaire peut rentrer dans les cellules en migrant
vers le pôle positif de la charge.
■ Un hybridome est une cellule qui provient de l'hybridation entre des cellules
lymphoïdes normales de mammifères et des cellules myélomateuses de tumeurs
malignes du système immunitaire.

■ L'intérêt est de cumuler les propriétés des deux cellules de départ : production
spécifique d'anticorps pour le lymphocyte et immortalité pour la cellule cancéreuse.
Propagation, sélection et clonage

■ Les souches de myélome utilisées doivent être des mutants n'ayant pas, soit la
thymidine kinase (TKase), soit la HGPRTase, deux enzymes nécessaires à la
biosynthèse des nucléotides. Ainsi, ces cellules ne peuvent se développer et se
multiplier qu'en produisant des nucléotides par les voies métaboliques de
récupération des nucléotides (voie de sauvetage).
■ Les voies « novo » sont inhibées par des antagonistes de l'acide folique
comme l'aminoptérine.
■ Les hybridomes sont capables de se multiplier indéfiniment car ils possèdent le
génome des cellules transformées et le génome des lymphocytes.

Les myélomes parents n'ayant pas l'enzyme essentielle, seules les cellules fusionnées
ou hybridomes l'ayant acquis pourront survivre.
Les hybridomes sont capables de biosynthétiser des nucléotides en utilisant la thymine et
l'hypoxanthine du milieu HAT.

● Un milieu HAT contient le mélange de l’aminoptérine, l’hypoxanthine et de la

thymidine.

● L’hypoxanthine qui, utilisée par l’enzyme HGPRT, peut donner les bases puriques (A et
G).

● La thymidine, associée à l’enzyme TK (thymidine kinase), permet la synthèse des

bases pyrimidiques (C, T et U).
Propagation, sélection et clonage

■ Le taux de succès d'une fusion est plutôt faible et varie selon le protocole utilisé (de 5
% à 50 % ).

■ Ces hybridomes sont ensuite mises en culture, ayant la propriété des cellules
cancéreuses, elles se multiplient rapidement et indéfiniment.

Afin de favoriser la croissance de ces hybridomes, plusieurs additifs peuvent être ajoutés
dans le milieu de culture (facteur de croissance, couche de cellules nourricières).

■ Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices d'anticorps

monoclonaux. Les hybridomes servent à produire en grande quantité des anticorps
monoclonaux.
■ Ces lignées d'hybridomes secrètent des anticorps tous différents. Afin de
sélectionner notre anticorps d'intérêt, il faut d'abord isoler chacun des clones.

Classiquement, cette sélection se fait par dilution limite pour permettre l'isolation de
clones uniques. On dilue les hybridomes à une concentration très faible. On prépare
ensuite des cultures avec de très petits volumes.

■ La dilution limite fait en sorte que les probabilités que ce très petit volume contient
deux cellules sont extrêmement faibles. On est donc quasi assuré que les cellules
obtenues dans chaque culture ne proviennent que d'une seule cellule initiale; Ce sont
donc des clones purs qui évidemment, ne produisent qu'un seul clonotype d'anticorps.
■ Les hybridomes donnent des lignées immortalisées stables productrices
d'anticorps monoclonaux. Les hybridomes servent à produire en grande quantité
des anticorps monoclonaux.

■ Ces lignées d'hybridomes secrètent des anticorps tous différents. Afin de

sélectionner notre anticorps d'intérêt, il faut d'abord isoler chacun des clones.
■ Plus récemment, l'utilisation du cytomètre en flux permet aussi la séparation de
cellules. Chaque clone est ensuite testé, la plupart du temps en Western Blot, par
ELISA.
Techniques immuno-analytiques
■ Au départ, les techniques immuno-analytiques reposaient sur l’interaction des
antigènes et des anticorps en solution aboutissant à la précipitation du complexe
antigène-anticorps. Cette précipitation permet de déterminer la concentration
d’antigène ou d’anticorps. Ces méthodes de précipitation conviennent pour assurer la
concentration d ’antigène de l’ordre du µg/mg/ml

■ Cependant quand la substances à analyser est présente dans des concentrations

plus faibles. Comme c’est le cas avec les mycotoxines. D’autres méthodes plus
sensibles sont nécessaires pour mesurer la formation du complexe.

♦ Il s’ agit des méthodes immunochimiques ou titrage immunologiques.

 Les immunodosages
■ Dans le cadre des immunodosages, les antigènes correspondent aux molécules à
doser, à condition que l’on dispose des anticorps spécifiques de ces antigènes.

■ Au moyen d’une courbe d’étalonnage en comparant les signaux (désintégration

radioactive, absorbance, luminescence, etc.) obtenus pour l’échantillon à doser avec les
signaux de  l’étalon.
Aspect théorique de la réaction antigène - anticorps
Caractéristiques de la liaison antigène - anticorps

● Association de 2 molécules entre le paratope et l'épitope.

● Cette association nécessite une bonne complémentarité stérique entre les 2 sites
réactifs.
● C'est une réaction exothermique, spécifique et réversible.
● La loi d'action de masse détermine la constance d'équilibre K = affinité intrinsèque.
Nature des liaisons antigène - anticorps

- Faible énergie
- Dépendent de la complémentarité entre le paratope et l'épitope
- Non covalentes

■ forces de van der Walls :

- les plus faibles
- dues au mouvement des électron dans la molécule : formation de dipôles SS
■ forces électrostatiques = liaisons ioniques :
- entre 2 groupements ioniques
- 2 à 5 kcal/mol
■ liaison hydrogène :
- entre atomes électropositifs et électronégatifs
- faibles
■ liaisons hydrophobes :
- entre groupements polaires ou hydrophobes
- faibles
Caractéristiques de la liaison antigène - anticorps

■ Il y a donc des forces d'attraction et de répulsion entre le paratope et l'épitope.

L'énergie de liaison est élevée entre le paratope et l'épitope car toutes ces liaisons
sont de faible énergie mais sont très nombreuses.

■ l'énergie dépend de la complémentarité entre les 2 sites.

■ quand on mesure l'affinité d'un anticorps pour son antigène, on mesure la

somme des forces attractives et répulsives.
Mesure de l'affinité intrinsèque d'un anticorps

• Technique de dialyse à l'équilibre :

- la différence de niveau à l'équilibre correspond à la quantité d'haptène liée à l'anticorps
• à partir des données expérimentales on fait la représentation de Scatchard qui donne
l'affinité de l'anticorps ainsi que sa valence (nombre de paratopes par molécule)

- Lorsque la moitié des sites d'anticorps sont liés à l'haptène :

K = affinité = 1/[Ag]
- plus la valeur de K est grande, plus l'anticorps est afin et plus il détecte de faibles
concentrations d'haptène.
Avidité

♦ K = mesure théorique de l'affinité intrinsèque d'un paratope pour l'épitope.

♦ dans la réalité l'anticorps est au moins bivalent et les antigènes sont multivalents

♦ la multivalence augmente d'un facteur 10 3 pour IgG et de 107 pour Ig M l'énergie

de liaison pour un même épitope. Pour une affinité intrinsèque égale ( 10 4) l'Ig M est
+ avide que l'IgG.

♦ l'interaction de l'anticorps avec l'antigène au niveau d'un seul site augmente la

probabilité de rencontre au niveau du 2ème site
♦ l'intensité des interactions = avidité = affinité fonctionnelle.

♦ la somme théorique entre les affinités intrinsèques de chaque site est très inférieure
à l'affinité réelle.
Avidité
♦ l'avidité conditionne la rapidité de formation d'un complexe antigène -
anticorps. Elle dépend de l'affinité intrinsèque, de la valence de l'anticorps et de
l'antigène, de conditions physicochimiques : température, pH, force ionique.

♦ au cours d'immunisations répétées, l'affinité et l'avidité des anticorps

augmentent car il y a une sélection des anticorps ayant des paratopes de plus en
plus complémentaires des épitopes.
Applications des réactions antigène – anticorps

Diagnostic des maladies infectieuses (bactéries, virus, parasites, champignons)

- diagnostic indirect = recherche d'anticorps spécifiques dans un sérum
-diagnostic direct = recherche de l'agent infectieux dans différents liquides biologiques
ou sur des biopsies.

-Diagnostic de pathologies affectant le système immunitaire

= déficit immunitaire, maladie auto-immunes (ex : polyarthrite rhumatoïde),
hypersensibilité (= allergie), syndromes prolifératifs (ex : lymphomes)

Dosage quantitatif de molécules

Hormones, vitamines, protéines inflammatoires, médicaments etc.
 Techniques d'immuno-agglutinations
Applications à la recherche et caractérisation de molécules, de cellules ou de virus

Principe
La réaction antigène-anticorps lorsqu'elle met en oeuvre un antigène insoluble
(comme des cellules bactériennes, comme des globules rouges portant naturellement
des antigènes, peut conduire à la formation d'un agglutinât.

♦ Ces réactions d'agglutinations peuvent être lues à 1’oeil nu.

Exemple : groupages sanguins sur lame, sérotypage des Salmonella ou autres

microorganismes
 Techniques de précipitation

■ c'est une réaction qui apparaît dans un milieu liquide ou gélifié entre un
antigène soluble et 1’anticorps précipitant (Ig M, IgG).
■ le précipité est dû à la formation d'un réseau macromoléculaire
tridimensionnel
■ l'anticorps doit être au moins bivalent (2 paratopes) : Fab ne donne pas de
précipité ; seuls les sérums polyclonaux donnent des réactions de précipitation.
■ l'antigène doit être au moins bivalent (2 épitopes) : un haptène ne donne pas
de réactions (un seul épitope) ; l'haptène doit être couplé à une protéine
porteuse.
Précipitation en milieu liquide : méthode de Heidelberger et Kendall (1929)
- Test de l’anneau (« Ring Test »)
C’est la théorie des réseaux de Marak donnée en 1934. On observe un précipité car il y a
la création d’agrégats moléculaires trop gros qui ne sont plus solubles. Chaque Ac peut
fixer deux Ag grâce à leurs deux sites de fixation. On a un anti-sérum polyclonal car, si
cet anti-sérum est monoclonal, on ne peut pas avoir d’agrégats et alors on ne peut pas
avoir de précipité.
■ Courbe de type lapin : 3 zones :
zone 1 : excès d'anticorps. Les complexes immuns sont de petite taille. Il existe
des anticorps libre dans le surnageant.

zone 2 : zone d'équivalence. Tous les anticorps spécifiques sont complexés à

l'antigène. Il n'existe pas d'anticorps libres ou d'antigènes libres dans le
surnageant.

Zone 3 : zone d'excès d'antigène. La taille des complexes immuns diminue et le

précipité se redissout. Il existe des antigènes libres dans le surnageant.
Courbe de type cheval : 3 zones + une prézone = prozone.
La prozone : dans les premiers tubes pas de précipité, car les anticorps ne sont pas
précipitants. Cette prozone est due à des anticorps très affins qui ne précipitent pas. Il
se forme des complexes immuns solubles.
NB : la prozone est observable pour toutes les réactions antigène-anticorps. Il faut donc
faire attention pour éviter les faux négatifs.
La turbidimétrie / néphélométrie :

- Turbidimétrie : mesure du rayonnement absorbé

- Néphélémétrie : mesure du rayonnement diffusé (plus sensible).
Précipitation en milieu Gélifié

Méthode d’immunodiffusion radiale (IDR): méthode de Mancini

Protocole
 Electrophorèse en fusée ou technique de Laurell :

C’est une technique qui fait appel à la séparation, l’intérêt de la méthode, la

précipitation est plus rapide.
L'immunodiffusion double (IDD)

L'immunodiffusion double (IDD) a été développée par Ouchterlony et on y réfère

souvent dans la littérature en la nommant d'après son inventeur.
La méthode d’Ouchterlony peut être utilisée notamment pour détecter la présence
d’anticorps spécifiques dans un sérum, pour mettre en évidence un antigène donné
dans un liquide biologique, ou pour évaluer le degré d'identité (nul, total ou partiel)
entre différents antigènes.
L'immunodiffusion consiste à placer dans un puits formé dans un gel d'agarose un
antigène (ou un mélange susceptible de le contenir) et un anticorps correspondant (ou
un mélange susceptible de le contenir) dans un autre puits.

Test = Ag A Test = Ag B Test = Ag A et Ag B

Cette méthode est utilisée pour les études qualitatives.

S'il y a un même antigène dans des puits périphériques contigus, les lignes de précipitine
auront évidemment tendance à fusionner. D'après la forme de cette fusion on pourra
évaluer la similitude entre les antigènes du puits périphérique. S'il y a fusion complète, on
pourra conclure à l'identité des protéines des deux puits.

Test = Ag A Test = Ag B Test = Ag A et Ag B

■ En pratique, on utilise des dispositions de puits permettant de faire les analyses
voulues.

■ La configuration la plus courante est celle où un puits central est entouré de 6

ou 8 puits périphériques disposés autour de façon à former les coins d'un
hexagone ou d'un octogone régulier.

■ Après le dépôt, on laisse les protéines diffuser. Lorsque l'équilibre est atteint,
environ 48 heures, des lignes de précipitation se seront formées entre le puits
central et les puits périphériques.
Immuno-éléctrophorèse
Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions
en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés
indépendantes, leur mobilité électrophorètique et leur spécifité
antigènique.

■ 1ière étape

Un mélange d’Ag est soumis à un champ électrique (de 5 à 8 V), le long duquel
les constituants se répartissent en fonction de leur mobilité électrophorètique
(Tampon Véronal-Tris).
■ 2ième étape
Un immuno-sérum poly-spécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui
de la piste électrophorètique dont les fractions diffusent en sens inverse.
■ L’exploitation des résultats est basée sur celle de la technique
d’Ouchterlony.
Immuno-dosages utilisant un marqueur
Nature du marqueur
 Radio-isotopes

■ Les radio-isotopes sont les premiers marqueurs utilisés dans les méthodes
immunologiques; il existe donc une vaste gamme d’essais radio-
immunologiques.
■ Les radio-isotopes sont facilement détectés à très faibles intensités, les
procédures de marquage sont simples et les marqueurs radioactifs n’ont
virtuellement pas d’effet sur la liaison anticorps-antigène.
■ Les radio-isotopes sont coûteux, dangereux et nécessitent un contrôle et des
procédures de destruction strictes.
■ La désintégration isotopique nécessite un remplacement régulier de
l’anticorps ou antigène marqué.
Les radio-isotopes utilisés:

Iode-125:
- Utilisé pour le marquage de grands antigènes
- Émission de particules β et de radiation γ (faible énergie)
- t1/2=60 jours
- Marqueur externe qui requiert un attachement covalent à l’antigène (ex.
substitution sur la tyrosine par oxydation). Ceci peut engendrer une différence
structurale entre l’antigène et l’antigène marqué.

Carbone-14 et Hydrogène-3 (tritium):

- Utilisés pour le marquage d’haptènes
- Émetteurs de radiation β
- t1/2=5730 ans (C-14) et 12.3 ans (H-3)
- Marqueurs internes; les radio-isotopes remplacent des atomes existants

■Limite de détection pour les antigènes ≈ 10-12 M.

 Fluorophores

♦ Les fluorophores sont communément utilisés comme marqueurs:

♦ Une limite de détection pour l’antigène de ~10 -10 M est obtenue avec les
marqueurs fluorescents (2 ordres de grandeur plus élevés que celle des essais
avec radio-isotopes).
 Marqueurs enzymatiques pour les ELISAs
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Les enzymes sont actuellement les marqueurs les plus utilisés pour les essais
immunologiques.

♦ Un seul marqueur enzymatique catalyse une espèce détectable (par

absorption, fluorescence ou électrochimie) générant ainsi un grand signal
(phénomène d’amplification catalytique).

♦ Avantage d’une méthode immunoenzymatique : une amplification du signal

qui rend possible l’analyse quantitative de faibles concentrations d’échantillon.

♦Désavantage d’une méthode immunoenzymatique: besoin d’ajouter un

substrat et d’avoir une autre étape de réaction
Caractéristiques d’un marqueur enzymatique idéal :
♦ un taux de roulement élevé
♦ un produit facilement détecté
♦ un substrat qui n’interfère pas avec la mesure
♦ un faible coût
♦ une stabilité et résistance aux interférences possibles
♦ Normalement, l’enzyme, substrat et produit ne doivent pas être présent dans
les échantillons analysés.
♦ Il y a cinq enzymes qui sont communément utilisés comme marqueurs.

1. Horseradish peroxydase (EC 1.11.1.7, MM 40kDa) est l’enzyme

la plus utilisée dans les essais immuno-enzymatiques, due à sa grande activité
spécifique (4500 U/mg à 37°C = taux de roulement de ~3000 molécules de
substrat par seconde par molécule de HRP) et le fait que la HRP est
relativement non spécifique vers le substrat secondaire.

* Une variété de colorants (forme réduite) peuvent être utilisés comme

substrats qui sont convertis à leur forme oxydée colorée :
2-Phosphatase alcaline (EC 3.1.3.1, MM 100 kDa) a un pH optimal autour
de 9 et une activité spécifique de 1000 U/mg à 37°C (taux de roulement de
~1700/s) :

3- β-Galactosidase (EC 3.2.1.23, MM 540 kDa) a un pH optimal autour de 7 et

une activité spécifique de 600 U/mg à 37°C (taux de roulement de ~5400/s):
4. Glucose-6-phosphate déshydrogénase (EC 1.1.1.49, MM 104 kDa) a un
pH optimal autour de 7.8 et une activité spécifique de 400 U/mg à 37°C (taux
de roulement de ~700/s):

5. Uréase (EC 3.5.1.5, MM 483 kDa) a une activité spécifique de 10,000

U/mg à 37°C et pH 7.0 (taux de roulement de ~80,000/s):
Détection
 Différentes techniques (Tests de dépistage)
Les techniques immuno-enzymatiques
I/ Les techniques ELISA
Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes
immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en :

■ Recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes

protéiques, des haptènes).

■ Analyse médicale, pour le dosage de nombreuses substances (Ag, Ac,

hormones, marqueurs tumoraux, médicaments…).
♣ Ces techniques (Assay) ont divers applications
(recherche/quantification d'antigènes ou d'anticorps viraux et diverses
variantes, mais le mécanisme de base reste le même:

♣ une certaine qualité de plastique est capable d'adsorber (Sorbent)

anticorps ou antigènes (immuno-sorbent), adsorption suffisamment forte
pour résister au lavage.

♣ un antigène ou anticorps peut être liée une enzyme (enzyme linked),

enzyme catalysant la transformation d'un substrat incolore en substrat
coloré.

♣ la coloration permet de déceler antigène ou anticorps et son intensité

(mesurée en densité optique ou DO) donc la quantification.
Principe
♦ Le sérum à tester est mis en contact avec un support solide (microplaque de
titration, microparticules ... ) sensibilisé par l'antigène viral vis a- vis duquel est
effectuée la sérologie.

♦ Après incubation et lavage, le complexe immun ainsi immobilisé est révélé

par l'addition d'Ac anti-immunoglobuline humaine (anti-IgG, -IgG-1, IgG-3, -
IgM, -IgA ou -1g totales), appelé conjugué, qui est couplé à un système de
révélation de nature enzymatique (enzyme immuno assay = EIA ou enzyme
linked Immuno Sorbent Assay = ELISA).

♦ Le substrat de l'enzyme peut être fluorogénique, chimioluminescent ou

chromogénique, les effets obtenus étant quantifiés respectivement grâce à un
fluorimètre, un luminomètre ou un spectrophotomètre.
Dosage en phase hétérogène
Il nécessite une étape de séparation du complexe Ag-Ac avant la détection et
répond aux deux principes de base :
- soit avec excès d’AC (méthode Sandwich) : méthode non compétitive
-

Les méthodes ELISAs

● La méthode ELISA (simple) est un essai hétérogène sur phase solide dans
lequel le complexe antigène:anticorps (Ag: Ab1) est détecté par un antigène ou
un deuxième anticorps (anti-Ab1) marqué avec une enzyme qui catalyse la
conversion d’un substrat incolore en produit coloré.

● Ils emploient généralement un anticorps immobilisé dans les puits d’un

plateau de microtitration en polystyrène (analyse automatisée).

● Ils sont effectuées dans le mode compétitif ou non compétitif

Dosages avec un excès de réactif : méthode sandwich

ELISA - mode non compétitif

■ Ces techniques nécessitent toutes une étape de séparation, elles sont réalisées
en phase hétérogène.
■ Cette méthode s’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques
ou non); elle est donc inutilisable pour les haptènes. Elle est aussi plus sensible.
Méthode en « sandwich »

L’intensité de la fluorescence augmente linéairement avec la [antigène] dans

l’échantillon.
Dosage avec Ag marqué
Dosage indirecte avec Ac secondaire marqué
Principe

♦ L’Ag fixé sur un support

♦ On ajoute un Ac primaire qui se fixe à l’Ag.
♦ Ce complexe Ag-Ac nécessite pour être détecté la présence d’un 2éme Ac ou Ac
secondaire conjugué à un marqueur (marqueur lié par une liaison de covalence) :
c’est ce complexe ternaire qui va être détecté.
ELISA – mode non compétitif
■ Amplification par le système avidine-biotine (ABC) La biotine (coenzyme facile
à lier aux Ig) a une très forte affinité pour l’avidine (blanc d’oeuf) et la
streptavidine (Streptomyces avidinii ).

● L’Ac biotynilé se lie sur l’Ag fixé à la phase solide puis, de la streptavidine,
conjuguée à une enzyme, se lie à la biotine (complexe ternaire).

■La streptavidine, peut fixer aussi plein de molécules colorées, ce qui permet une
forte augmentation de sensibilité, mais une perte de spécificité.
ELISA - mode compétitif
■ Cette réaction a lieu entre un Ag en milieu solide et une phase liquide
contenant l’Ag à doser. On mélange les deux phases, on ajoute ensuite un
nouvel Ag portant une enzyme.
■ L’antigène dans l’échantillon (analyte, Ag) et l’antigène marqué avec
enzyme (Ag-E) sont en compétition pour un nombre limité (et insuffisant)
de sites anticorps.

■ Après incubation, le support solide est rincé pour enlever les antigènes non-
liées et une concentration saturante du substrat enzymatique est ajoutée.

■ Dans ce cas, la vitesse de conversion du substrat en produit diminue

lorsque [Ag libre] dans l’échantillon augmente.
■ Plus souvent, une approche à temps fixe est utilisée.
■ Après un certain temps d’incubation avec le substrat, la réaction enzymatique
est arrêtée par l’addition d’un acide ou d’une base forte qui dénature
l’enzyme.
■ La quantification du produit formé donne une courbe d’étalonnage dans
laquelle la [produit] diminue lorsque la [Aglibre] dans l’échantillon augmente
Les aspects techniques :
■ La fixation des Ag est réalisée sur une plaque spécialement traitée pour fixer
les protéines. Cette fixation est en général réalisée par un tampon basique.

■ Les étapes de lavage sont effectuées avec des tampons contenant des
détergeants doux qui permettent de retirer tout ce qui est fixé de manière non-
spécifique. Pendant le lavage, on ajoute des protéines de saturation.

■Le conjugué : c’est un complexe entre un Ac ou un Ag et une enzyme. On utilise

la péroxydase du radis (raifort) → H2O2 → H2O + ½O2. La phosphatase alcaline
qui enlève les protéines si elle est en milieu basique.

■ Ces enzymes sont fixées de manière covalente grâce au glutaraldéhyde qui

forme un pont entre l’enzyme et l’Ac ou l’Ag. Quand on doit fixer des sucres, on
utilise le périodate de sodium.
 Exemple : Test de grossesse ou Bandelette réactive

■ Test en forme de bâtonnet destiné à mettre en évidence l'hormone spécifique

de la grossesse, la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), une
glycoprotéine.

■ Cet hormone apparaît dans l'urine quelques jours après la conception et sa

concentration augmente rapidement dans les premières semaines de grossesse.
Exemple : Test de grossesse ou Bandelette réactive
■ Cet essai est effectué dans un format «sandwich» avec deux anticorps.
■ Un anticorps, «l’anticorps de capture» est immobilisé de façon covalente à la
surface de la bandelette.
■ Le 2e anticorps, «l’anticorps traceur» est marqué avec un colorant. L’anticorps
traceur est imprégné sur la surface de la bandelette, mais demeure mobile.
■ La bandelette est composée d’un matériau adsorbant. Lorsqu’un échantillon
d’urine est déposé à la surface, le liquide se déplace à travers la bandelette par
capillarité et les réactions de l’essai ont lieu dans un flux.
■ Une goutte d’urine est appliquée dans la fenêtre d’entrée.
■ Le liquide (urine) se déplace au-dessus de la zone contenant les anticorps
traceurs qui sont marqués avec un colorant.
■ Si la hCG est présente dans l’échantillon d’urine, elle formera un complexe
avec l’anticorps traceur.
■ Le complexe hCG-anticorps traceur formé continue à se déplacer au long de la
bandelette adsorbante et passe sur la région (fenêtre de test) contenant l’anticorps de
capture immobilisé.

■ Un sandwich est formé entre l’anticorps de capture immobilisé et l’anticorps

traceur avec la hCG entre les deux. L’anticorps traceur mobile est
immobilisé.

■ La quantité de complexe sandwich formé est directement proportionnel au teneur

de hCG dans l’échantillon d’urine. Si la [hCG] excède une concentration minimale,
la couleur du colorant (attaché à l’anticorps traceur) devient visible à l’oeil.
Exemple 2 : d’un essais ELISA
Détection d’anticorps au virus de l’immunodéficience humaine (VIH) par ÉLISA

■ La détection des anticorps VIH repose sur le fait que les anticorps VIH se lie
spécifiquement au VIH (antigène).

■ Étapes de l’essai: Immobilisation du VIH dans un puit de plateau à

microtitration - rinçage - ajout de l’échantillon de sérum sanguin et incubation -
rinçage - ajout d’un 2e anticorps (anti-anticorps VIH) avec marqueur enzymatique
- rinçage - ajout du substrat enzymatique - production d’un produit coloré- lecture
de l’absorbance par spectrophotométrie UV-vis.
 Essais homogènes de type EMIT (Enzyme- Multiplied Immunoassay
Technique)

■ Le dosage par la méthode homogène EMIT est utilisé pour la quantification

d’haptènes (hormones, substances thérapeutiques et les drogues).

■ Cette méthode est basée sur une compétition entre l’haptène dans
l’échantillon (analyte) et un haptène marqué avec enzyme pour une quantité
limitée d’anticorps :
■ De l’enzyme contenant de l’haptène libre exhibe une activité enzymatique
élevée, tandis que la liaison de l’anticorps à l’haptène diminue drastiquement
l’activité enzymatique due à l’encombrement stérique ou à des changements
structuraux au site actif de l’enzyme.

■ L’activité enzymatique augmente avec la concentration haptène dans

l’échantillon.

■ La limite de détection typique est d’environ 1 ng/mL.

II/ L’immuno-fluorescence
On a une visualisation de la réponse grâce à un fluorochrome. Les
fluorochromes sont des substances qui, quand elles sont soumises à un rayon
lumineux, deviennent instables (passent à un état excité) et qui, pour revenir à
l’état fondamental, émettent une longueur d’onde différente de la longueur
d’onde absorbée (λ émise > λ absorbée).

■ L’isothiocyanate de fluoriscine (ou FITC) absorbe à λ=490nm et émet à

λ=517 nm (vert).
■ L’isothiocyanate de rhodamine absorbe à λ=550nm et émet à λ=580nm
(rouge, orangé).
■ La phycoérythrine est un autre fluorochrome.
■ La lecture est réalisée avec un microscope à fluorescence.
NB :Système amplificateur avidine / biotine
L’immunofluorescence
L’immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag /Ac sur des
cellules en suspension, des frottis cellulaires, des microorganismes ou des coupes
d’organe.

A. Indirecte (IFI)

Microscope à fluorescence :
- A lumière réfléchie
- A lumière transmise
Lampes à vapeur d’halogène ou de mercure
Système d’acquisition : appareil photos, caméra…
Immuno-fluorescence indirecte

1ère réaction : avec un Ac1 spécifique à l’Ag mais non marqué

On peut avoir un système d’amplification. C’est un avantage scientifique car

l’immuno-fluorescence peut être réalisée sur des cellules vivantes.
Dosage indirecte avec Ag marqué : pour la quantification d’anticorps

● L’intensité de la fluorescence augmente avec la [anticorps] dans l’échantillon

Immuno-fluorescence directe

Méthode en « un temps », l’Ag est recherché directement par l’Ac

spécifique marqué.
Le fluorochrome est fixé à l’Ac qui reconnaît l’Ag que l’on veut
trouver.
Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus.

■ On bloque tous les sites où l’Ac peut se fixer de manière non spécifique (on
met beaucoup de lait écrémé, de BSA, de protéines). On ajoute ensuite un Ac
non spécifique de sérum humain ou de veau fœtal mais en enlevant le
complément.
Immunoélectrophorèse :
■ On crée un champ électrique qui permet la migration du sérum, ce qui permet
la séparation des protéines.

On met la plaque sur gélose, on la révèle en utilisant des anticorps précipitants

dirigés contre les protéines (anticorps anti-albumine, anti-globuline α1, anti-
globuline α2, anti-globuline β, anti-globuline γ…).

■ On obtient des arcs de précipitation. On compare le sérum du patient avec des

témoins.
1■ Il y a une 1ère migration des protéines en fonction de leur masse
moléculaire, sous courant électrique. Les protéines lourdes restent au
dessus tandis que les légères diffusent loin, car il y a un maillage dans le
gel.

2 ■ Le gel est transféré sur une membrane. On applique un champ

électrique pour coller les protéines sur la membrane, qui est par la suite
découpée en lamelles. Des anticorps précipitants permettent la
révélation.
III- L’immuno-empreinte (immunotransfert ou « western blot »)

■ Cette technique combine le pouvoir de séparation de

l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection,
ce qui en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag
ou d’un Ac.
A. Séparation des Ag par SDS-PAGE
Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes
dénaturées et chargées négativement, migrent dans un gel d’acrylamide / bis-
acrylamide (de teneur x %) sous l’action d’un champ électrique. Elles sont séparées
en fonction de leur PM.
Solution de dépôt des échantillons : Solution de Laëmmli (Tris 0,5 M pH 6,8,
glycérol 20%, SDS 40%, Bleu de bromophénol 0,009%, DTT 10%).
B. Le transfert des protéines sur membrane

Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de
nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique.
■ Les protéines transférées sur membrane de NC sont incubées avec des
immunosérums ou des Ac. Les protéines ayant formé des complexes Ag /Ac
réagissent ensuite avec des Ac (de chèvre) dirigés contre les IgG de l’espèce
d’origine du sérum testé.

■ Ces Ac secondaires sont couplés à la peroxydase (ou à la phosphatase alcaline).

La peroxydase oxyde le luminol qui va émettre de la lumière permettant la
révélation autoradiographique des complexes.