Clonalit de Saprolegnia parasitica, le parasite des poissons du Doubs

Christophe Paul, Lassad Belbahri

Introduction

Contexte
Mortalit importante de poissons dans le bassin du Doubs Touche les ombres et les truites Taches blanches (mycoses)

Confusion sur les causes de cette mortalit Une saprolegniose est voque

Introduction

La saprolegniose ? Oui mais

Saprolegnia spp. prsent naturellement dans les cours deau Gnralement infection secondaire Ne touche que des poissons affaiblis

Pourquoi un taux de mortalit si lev ??? Pourquoi maintenant ???

Thierry Arnet

Analyses prliminaires
Prlvements sur un ombre malade Mise en culture ADN Barcoding (ITS)

Introduction

Saprolegnia parasitica s.l.

Oomycte du genre Saprolegnia Complexe S. diclina / S. parasitica / S. salmonis (Saprolegnia parasitica s.l.) Complexe despces mal dfinies Certaines souches sont trs virulentes: si le nb de spores est lev (Hussein, 2002) :
Taux de mortalit pour les truites arc-en-ciel (Salmo gairdneri) : 100% Taux de mortalit pour les truites brunes (Salmo trutta) : 90-100%

Introduction

Les sites
Ds 2009 : Le Doubs
Franco-suisse Sous-affluent du Rhne

La Loue
Rsurgence et affluent du Doubs (fr)

2 rivires connectes

Loue

Introduction

Les sites
Ds 2009 : Le Doubs
Franco-suisse Sous-affluent du Rhne

La Loue
Rsurgence et affluent du Doubs (fr)

2 rivires connectes
Sorne

En 2011 :
Doubs

La Sorne
Suisse Sous-affluent du Rhin

DECONNECTEE DU DOUBS!!

Introduction

Projet (OFEV)
Identification du pathogne (18S et ITS)
Mme pathogne pour tous les individus malades ? Espces? Liste des espces sensibles: htes?

Diversit gntique / clonalit (MLST)

Pathogne rsident vs Introduction Origine du pathogne ?

Matriel et mthodes

MLST: MultiLocus Sequence Typing

Analyse de la diversit gntique Caractrisation disolats (bactries ou eucaryotes) par lutilisation de squences dADN de plusieurs gnes de mnage (housekeeping genes) Fragments internes de 450-500 pb pour chaque gne Pour chaque locus (gne), les diffrentes squences dterminent des allles distincts et pour chaque isolat les allles des diffrents loci dfinissent un profil alllique (sequence type)

Matriel et mthodes

MLST: MultiLocus Sequence Typing

Matriel et mthodes

MLST: MultiLocus Sequence Typing

2 gnes nuclaires
Beta tubuline Facteur dlongation 1 alpha

2 gnes mitochondriaux
NADH dshydrognase sous-unit 1 Cytochrome C oxydase sous-unit 1

1 facteur de virulence
Protase aspartique

Matriel et mthodes

Collection de souches
Nom code Identif Molculaire Poisson Date prlvement lieu de prlvement

Doubs
blessures D1 D2 D3 D4 D5 D6 Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus Thymallus thymallus Thymallus thymallus Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta 17.04.11. 17.04.11. 17.04.11. 26.09.11. 26.09.11. 12.05.11. La roche plate (Chx-de-Fds) La roche plate (Chx-de-Fds) La roche plate (Chx-de-Fds) Bonaparte (Chx-de-Fds) Bonaparte (Chx-de-Fds) Goumois

22 souches
2 types de prlvements: Blessures des poissons malades Baiting (eau de la rivire)

Loue
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia sp. Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Barbatula barbatula 08.08.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. 25.11.11. Ornans Ornans Ornans Ornans Ornans Ornans Ornans Ornans Ornans

3 htes: Ombres (Thymallus thymallus)

Sorne
T1 T5 T7 T8 T10 Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Saprolegnia parasitica Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta Salmo trutta 14.11.11. 14.11.11. 14.11.11. 14.11.11. 14.11.11. Delmont Delmont Delmont Delmont Delmont

Truites fario (Salmo trutta) Loche (Barbatula barbatula)

baiting (Doubs)
S1.2 S2.2

Saprolegnia sp Saprolegnia sp

01.06.11. 01.06.11.

La Goule (Le Noirmont) Goumois

Rsultats & Discussion

18S: Saprolegniales
Saprolegnia spp.

Saprolegnia spp.

Outgroup

Rsultats & Discussion

18S: Saprolegniales
Isolats rpartis en 2 groupes :
Saprolegnia spp.

S. parasitica:
19x blessure

Saprolegnia sp.
1x blessure 2x ch. deau Saprolegnia spp.

Outgroup

Rsultats & Discussion

18S: Saprolegniales
Isolats rpartis en 2 groupes :
Saprolegnia spp.

S. parasitica:
19x blessure

Saprolegnia sp.
1x blessure 2x ch. deau Saprolegnia spp. toutes les S. parasitica ne correspondent pas notre souche genre Saprolegnia paraphyltique

Outgroup

Bases de donnes fiables ???

Rsultats & Discussion

ITS: Saprolegnia spp.

Saprolegnia parasitica s.l.

Outgroup

Rsultats & Discussion

ITS: Saprolegnia spp.

Isolats rpartis en 2 groupes (=18S):
Saprolegnia parasitica s.l.

Complexe S. parasitica s.l. Saprolegnia sp.

Outgroup

Rsultats & Discussion

18S & ITS

2 populations distinctes de Saprolegnia sont prsentes 19/20 prlvements sur les blessures donnent Saprolegnia parasitica s.l. Souche virulente Pathogne indpendant des espces de poissons Au moins 3 espces sensibles de 2 familles diffrentes Manque de fiabilit des bases de donnes + phylognie peu claire (confusion entre plusieurs espces)

Rsultats & Discussion

MLST: sq. concatnes

Mmes groupes quavec ITS et 18S
Groupe Groupe 1 1

Groupe 1: trs faible variabilit gntique Une exception P6 Groupe 1 correspond gntiquement une souche du Japon

Groupe 2
Outgroup

Rsultats & Discussion

MLST : profils allliques

Beta tubulin D1 D2 D3 D4 D5 D6 P1 P2 P4 P5 P6 P7 P8 P9 T1 T5 T7 T8 T10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 Elongation factor 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 Cytochrome C oxydase 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 NADH dehydrogenase 1 1 n/a 1 n/a n/a 1 1 1 1 1 2 3 1 1 1 1 1 1 Type 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 4 1 1 1 1 1 1

Groupe 1
Seulement 4 types allliques 16 souches sur 19 sont identiques

Rsultats & Discussion

2 populations de Saprolegnia distinctes

1 souche rsidente
Saprolegnia sp. Grande variabilit gntique 1 seule isolation partir de poisson malade Isole partir deau de la rivire

1 souche pathogne
Saprolegnia parasitica s.l. Trs faible variabilit gntique = population clonale Uniquement isole partir de poissons malades Daprs MLST, correspond gntiquement une souche du Japon

Rsultats & Discussion

MAIS
Pas possible dtablir clairement lorigine de la souche de S. parasitica s.l. du Doubs

Trop peu de donnes disponibles

Seulement 2/4 gnes squencs pour la souche du Japon 4 gnes squencs pour 1 seule souche de S. parasitica Pour les autres souches de S. parasitica, pas ou peu de donnes concernant les gnes utiliss

Ncessit de commander les souches disponibles pour un squenage avec nos primers

Rsultats & Discussion

En plus
De nombreux sites sont ambigus (htrozygote)
2 bases possibles pour un mme site Squences diffrentes sur les 2 chromosomes

Suggre une reproduction sexue ou une hybridation

Conclusions
Saprolegnia parasitica s.l. est toujours prsente et active cette anne (automne 2011) dans le Doubs et la Loue Au moins 3 espces de poissons sensibles de 2 familles diffrentes S. parasitica s.l. sest tendue une rivire non connecte au Doubs La population clonale de S. parasitica s.l. suggre une introduction rcente dans la rgion

Perspectives
Echantillonnage plus large chelle
Rpartition / frquence Image plus prcise des gnotypes agressifs Liste des htes possibles

Dterminer lorigine de la souche pathogne Dveloppement dun test de dtection partir dchantillons environnementaux (PCR spcifique) Squenage du gnome complet de la population clonale Eclaircissement de la phylognie Identifier le(s) vecteur(s)

Perspectives

Un vecteur potentiel
De nombreuses espces dcrevisse sont des htes potentiels pour les oomyctes Saprolegnia parasitica fait partie des parasites identifis de certaines espces dcrevisses (Sderhll et al., 1991) Lintroduction dcrevisses nord-amricaines (Procambarus clarkii) en Europe a dmontr tre lorigine de la propagation dAphanomyces astaci (Aquiloni et al., 2011) Dcouverte en 2005 dune espce dcrevisse nord-amricaine (Oronectes juvenilis) dans le Dessoubre , un affluent du Doubs (Chucholl & Daudey, 2008) Inquitant de constater que lintroduction de cette crevisse pourrait concider avec lapparition de lpidmie

Remerciements
LOFEV pour le financement du projet Loffice de lenvironnement du Jura Franoise Pozet, du laboratoire dpartemental danalyses du Jura (fr) Thomas Wahli, du centre pour la mdecine des poissons et des animaux sauvages de l'Universit de Berne (FIWI) Thierry Arnet Edward Mitchell Enrique Lara Nicole Jeanneret Ludovic Roussel-Delif Thibaud Goetschi Et tous ceux que jai oubli

Merci pour votre attention