Zeggari

Anne 2008
Rsum
Au cours de cette thse, deux Lab On Chip ont t raliss. Le premier est destin la
THSE
fcondation in vitro (FIV) et le second au transport et au contrle qualit dun greffon cor-
nen. Le Lab On Chip pour la FIV est constitu dune plateforme et dun ensemble de prsente
sondes permettant la caractrisation de lovocyte. La plateforme en silicium, assure le
maintien en vie de lovocyte en formant un rservoir pour le milieu de vie des cellules. Un LU.F.R. DES SCIENCES ET TECHNIQUES
rseau de microcanaux usin sur la plateforme permet daspirer le milieu des cellules et DE LUNIVERSIT DE FRANCHE-COMT
confre cette dernire les fonctions : de dplacement, de positionnement et dimmobi-
lisation de lovocyte. Des tests prliminaires, sur des ovocytes surnumraires, ont mon-
tr la faisabilit des analyses non invasives pour la caractrisation des ovocytes avant pour obtenir le
fcondation.
Actuellement, la manipulation de la corne, pour effectuer certaines analyses, risque de GRADE DE DOCTEUR DE LUNIVERSIT
lendommager. Pour rsoudre ce problme, nous avons dvelopp une mthode optique, DE FRANCHE-COMT
non invasive, pour caractriser ltat de la corne. Il sagit dune mesure de la transmit- Spcialit : Sciences pour Ingnieur
tance de la corne corrle avec le nombre de cellules vivantes. Afin de dtecter les
infections dans la corne, nous avons dvelopp des microcapteurs de pH. Ces derniers
offrent une mesure ponctuelle plus prcise. La caractrisation des microcapteurs a don-
ne des rsultats pertinents jusqu une taille de 10 m. Enfin, nous avons intgr un sys-
tme de capillaires pour maintenir la fois la corne dans son milieu de vie et pour la
positionner dune manire non invasive, afin deffectuer son analyse.
MICROSYSTMES ET MICROCAPTEURS
Mots cls : Lab On Chip, microsytmes, manipulation des cellules uniques, FIV, gravure
POUR LES SCIENCES DU VIVANT
humide KOH, gravure sche DRIE, microcapteurs, spectre de transmission de la corne,
polymres en couches minces, microlectrodes.
Abstract
In this thesis, two Lab On Chip has been realised. The first one is intended for in vitro fer-
tilization (IVF), the second for the transportation and quality control of the cornea. The
Lab On chip for IVF is formed of a platform and a set of probes. The platform is made of
silicon ; it forms a reservoir for the life fluid of the oocyte to keep it alive. On the plat-
par
form we machined a network of microchannels to aspire the life fluid ; this operation
Rabah ZEGGARI
gives the platform the functions of : transportation, positioning and immobilization of the
oocyte. A preliminary test, on supernumerary cells, demonstrates the feasibility of non
invasive tests for the characterization of the oocyte before fertilization. Soutenue le 24 avril 2008 devant la commission dExamen
Actually, the manipulation of the cornea, for execute some analysis, can cause damage
for it. To resolve this problem, we developed an optical method, so no invasive, for cha- Prsident du Jury H. MAILLOTTE Directeur de Recherche CNRS, Universit de Franche-Comt
racterization state of the cornea. It consist in the measure of cornea transmittance, that
measure is correlated with the number of living cells. To detect infections in the cornea, Directeur de thse T. GHARBI Professeur, Universit de Franche-Comt
we developed pH micro-sensors. The latter offer a more accurate measure. The charac-
terisation of the pH micro-sensors has yielded results relevant until a size of 10 m. Rapporteurs D. FELBACQ Professeur luniversit de Montpellier II
Finally, we incorporated a system of capillaries to maintain the cornea in his life fluid, also M.L HAJI Professeur luniversit de Rennes 1
for its positioning bynon invasive manner for analysis.
Examinateurs D. BARCHIESI Professeur, Universit de Technologie de Troyes
Key words : Lab On Chip, microsystems, single cell manipulation, wet etching KOH, dry G. HERLEM Matre de confrence (HDR), Universit de Franche-Comt
etching DRIE, IVF, microsensors, micromachining, corneal transmission spectrum, thin V. LAPIERRE Docteur en Medecine, Institut de cancrologie Gustave Roussy
polymers films, microelectrodes. B. WACOGNE Charg de Recherche CNRS (HDR), Universit de Franche-Comt
Remerciements
Le travail qui est rsum dans le prsent manuscrit a t effectu au sein du Dparte-
ment dOptique P.M. Duffieux de lInstitut FEMTO-ST (U.M.R. 6174) lUniversit de
Franche-Comt.
Tout dabord, je tiens remercier profondment Monsieur le Professeur Tijani Gharbi,
directeur de thse, de mavoir guid, suivi et soutenue scientifiquement ainsi que morale-
ment, tout au long de ce travail.
Je tiens remercier Guillaume Herlem, Matre de Confrences et Bruno Wacogne,
Charg de Recherche CNRS, pour leurs suivi et leurs conseils qui ma permis de mener
ces travaux.
Jadresse mes remerciements Monsieur Herv Maillotte directeur de recherche CNRS
et directeur de notre dpartement davoir accept de prsider le jury de ma thse.
Jexprime ma profonde gratitude Monsieur Daniel Felbaq, Professeur lUniversit
de Montpellier II, Monsieur Mohamed-lazhar Haji, Professeur lUniversit de Rennes
I, pour mavoir fait lhonneur de rapporter ce travail.
Je tiens madresser mes remerciements Madame, Valrie Lapierre Docteur en M-
decine pour avoir accept de juger ce travail.
Egalement mes remerciements M. Dominique BARCHIESI Professeur lUniver-
sit de Troyes pour avoir accept de juger ce travail.
Ma profonde reconnaissance Monsieur Nacer-Eddine Demagh, Matre de Conf-
rences (HDR) luniversit de Stif (Algrie), de ses prcieuses aides scientifiques ainsi
que pour son esprit de collaboration. Mes remerciements sadressent aussi au Professeur
Brahim Guizal pour sa gentillesse et sa disponibilit pour la relecture du manuscrit,
Christian Pieralli, Charg de Recherche CNRS, qui ma aid interprter les rsultats
relatifs la fcondation in vitro. Je dis un grand merci Monsieur Christophe Roux, Pro-
fesseur lUniversit de Franche-Comt, de mavoir donn la possibilit dexprimenter
III
IV
sur des ovocytes le dispositif ralis dans cette thse, et Monsieur Pierre Tiberghien, Di-
recteur de lEFS de mavoir permis de mener les exprimentations relatives aux cornes
au sein de son tablissement. Je remerci galement, le staff scientifique et technique de
lEFS qui ont mis ma disposition les moyens ncessaires pour travailler sur des greffons
de cornes. Je cite, le Docteur S. Maddens, J. Pizzotto et N. Pouthier.
Un grand merci au personnel de la centrale technologique MIMENTO, dont certains,
qui se reconnatront, mauront plus dune fois dpann l o rien ne les y obligeait.
Jadresse mes remerciements galement la Fondation Transplantation pour avoir
assurer une partie du financement de cette thse.
Enfin, je noublierai jamais la sympathie de tous les membres de lquipe et du La-
boratoire, ainsi que tous les collgues et les amis qui mont accompagn pendant cette
thse : je cite Abder, Rabah, Reda,Malha, Nabiha, Vincent, Kamal, Hicham, Hakim, Nes-
tor, Jaime . . .
Introduction gnrale
L
es microsystmes peuvent tre dfinis comme des systmes miniaturiss incor-
porant de manire monolithique des capteurs, des actionneurs et des dispositifs
de traitement de linformation. Leurs dimensions sont comprises entre quelques
micromtres et quelques millimtres. La multidisciplinarit est une caractris-
tique forte des activits de dveloppement des microsystmes. Aujourdhui, la quasi-
totalit des disciplines scientifiques ou techniques sont impliques (mdecine, biologie,
physique, chimie, optique, mcanique . . .). Lintrt grandissant pour les microsystmes
en terme de recherche et de march rside dans le fait quau-del de la diminution des
tailles et des cots de fabrication des dispositifs, la miniaturisation permet de multiplier
les fonctionnalits intgres aux systmes et de rpondre de nouveaux besoins.
Le domaine biomdical, est lun des domaines o lintrt pour les microsystmes est
capital et surtout pour tout ce qui relve de lanalyse biomdicale (analyses sanguines,
analyses dovules...). Ces analyses peuvent poser un problme de cot, de lourdeur de
mise en oeuvre et parfois mme de prcision. Construire un microsytme pour le biom-
dical ne va pas sans difficults. En effet, un tel microsystme doit rpondre aux mmes
critres que les systmes traditionnels, tel que la biocompatibilt des matriaux utiliss, la
manipulation des micro-objets biologiques (cellules, ADN. . .), le contrle des paramtres
biologiques (temprature, pH, pression sanguine. . .). Cest dans ce contexte de recherche
que sinscrit lobjectif de cette thse.
Le travail de thse prsent dans ce manuscrit est scind en deux parties principales :
La premire partie est consacre au dveloppement dun Lab On Chip pour la f-
condation in vitro qui utilise la microfluidique pour le transport et le positionnement des
ovocytes dans des sites bien prcis afin de les analyser ou de les fconder. Ce Lab On
Chip est constitu dune plateforme et dun ensemble de sondes. La plateforme assure le
maintien en vie de lovocyte en formant un rservoir pour le milieu biologique appropri.
V
VI
Un systme de microfluidique assure le dplacement et limmobilisation de lovocyte.

Lensemble des sondes permet doprer une analyse objective de lovocyte, cest donc
une aide la dcision dans le choix de la fcondation ou non de lovocyte.
Dans un premier temps, nous dcrirons les diffrentes techniques utilises dans le
domaine de la micromanipulation biologique et nous mettrons en vidence leurs limites
par rapport notre application.
Dans un deuxime temps, nous exposerons les choix technologiques que nous avons
retenu pour raliser cette plateforme. Nous dcrirons les mthodes de micro-usinage du
silicium que nous avons mis en uvre pour cette ralisation. Enfin, nous dmontrerons
quun rseau de microcanaux peut assurer le transport de lovocyte et son immobilisation
dans des sites bien prcis. Aussi, en vue dune analyse spectrale deux fibres optiques ont
t intgres la plateforme pour constituer un atelier danalyse.
La deuxime partie est consacre au dveloppement dun Lab On Chip pour le trans-
port et le contrle qualit dun greffon cornen. Il sagit dapporter des solutions aux
problmes de transport et de conservation des greffons cornens, poss aux banques de
cornes. En effet, les techniques actuelles de conservation et de contrle de la qualit
dun greffon cornen sont loin dtre satisfaisantes. Le critre dterminant de la qualit
des cornes est le nombre des cellules endothliales vivantes prsentent dans la corne. Le
comptage de ces cellules est effectu, par un oprateur sous microscope, aprs coloration
de la corne par le bleu trypan qui sinfiltre uniquement dans les cellules mortes. Or ce
dernier produit sest avr cancrigne et il sera sans doute interdit dans lavenir. Notre
but a t de remplacer cette mthode par une mthode optique qui a lavantage (i) dtre
non invasive et (ii) dviter une manipulation de la corne qui est source dinfections et/ou
de dgradation. Pour ce faire, nous avons mis au point un systme de mesure de la trans-
mittance optique de la corne examiner. Nous avons trouv une corrlation troite entre
le nombre de cellules vivantes et cette transmittance.
Cette partie est organise en deux chapitres, dans le premier nous dcrivons la physio-
logie de la corne et nous rappelons son rle prpondrant dans la vision. Nous citons les
tapes suivies du prlvement jusqu la greffe, en insistant sur les prcautions de mani-
pulation trs rigoureuses. Ensuite, nous dtaillons les tapes exprimentales et thoriques
qui nous ont amen dterminer le spectre de transmittance de la corne. Enfin, nous
donnons des rsultats prliminaires obtenus sur des cornes non-conformes (i.e. rejetes
par la technique habituelle de slection ).
Le deuxime chapitre est consacr au dveloppement de microcapteurs pour lanalyse
bactriologique des cornes pendant leur conservation. En effet, les cornes destines la
greffe sont prserves dans un milieu de conservation 31 C, un contrle bactriologique
est effectu quotidiennement par une mesure de son pH par colorimtrie. La variation du
pH, traduit une infection bactrienne et induit un virage de la couleur du milieu du rouge
au jaune ou conduit une turbidit. Linconvnient majeur de cette mthode est quelle
est peu prcise et oprateur dpendante. Afin, de pallier ces problmes nous avons d-
velopp des microcapteurs potentiomtriques capables deffectuer des mesures locales du
VII
pH et en temps rel pour prvoir toute infection. Nous dcrirons tout dabord les diff-
rentes mthodes et techniques utilises pour la mesure du pH et nous montrerons, par la
suite, les avantages offerts par notre mthode. Nous prciserons les tapes technologiques
entrant dans llaboration et la caractrisation de nos microcapteurs.
Enfin nous montrons que le microsystme qui rpond la problmatique pose dans
cette deuxime partie se concrtise sous la forme dun support moul dans une rsine
biocompatible et dot dun systme de fluidique pour assurer en toute scurit lanalyse
optique et bactriologique de la corne.
Nous terminerons par une conclusion gnrale avec des remarques qui ouvrent la voie
de nouvelles recherches dans ce domaine.
Sommaire
I Lab On Chip pour la fcondation in vitro 1

1 Plateforme pour la FIV 3
1.1 tat de lart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Schma de principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 Choix de la technologie silicium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 Techniques dusinage du silicium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.5 Usinage de la face infrieure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6 Usinage de la face suprieure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.7 La partie verre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.8 Assemblage du microsystme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.9 Rsultats Exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.10 Mesure des proprits optiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.11 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
II Lab On Chip pour le transport et le contrle qualit du greffon

cornen.in vitro 47
2 Etude du spectre de Transmittance de la corne 49
2.1 Gnralits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.2 La greffe de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.3 Comportement optique de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.4 Dispositif exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.5 Tests sur site . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
IX
X
2.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3 Microcapteurs pour la dtection de bactries 79

3.1 tat de lart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.2 Approche conceptuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.3 Ralisation de microcapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.4 Caractrisation des capteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.5 Etude des capteurs microsystmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.6 Intgration des capteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.7 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
III Bibliographie 115

Bibliographie 117
IV Index 123
Index 125
I
Lab On Chip pour la fcondation
in vitro
Sommaire Chapitre
1.1 tat de lart
1.2 Schma de principe
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
Choix de la technologie silicium
Techniques dusinage du silicium
Usinage de la face infrieure
Usinage de la face suprieure
La partie verre
1
1.8 Assemblage du microsystme
1.9 Rsultats Exprimentaux . . .
1.10 Mesure des proprits optiques. . .
1.11 Conclusion
Plateforme pour la FIV
L
a fcondation extra corporelle ou fcondation in vitro (FIV), consiste repro-
duire en laboratoire ce qui se passe naturellement dans les trompes de Fallope :
la fcondation et les premires tapes du dveloppement embryonnaire. La f-
condation in vitro proprement dite consiste mettre en contact les ovocytes
et les spermatozodes dans une prouvette pour permettre ces spermatozodes de f-
conder lovocyte. En cas dchec, le mdecin biologiste pratique la FIV avec ICSI (In-
tra Cytoplasmic Sperm Injection.), o il introduit lui-mme, par micro-injection et sous
contrle microscopique, le spermatozode lintrieur de lovocyte. Les taux de succs
de la FIV (Fcondation in vitro.) sont actuellement de lordre de 25% de grossesse. Ce
faible taux de russite peut tre d plusieurs facteurs parmi lesquels :
Comptence de lovocyte (qualit) : la qualit de lovocyte est value sur des
critres subjectifs. Essentiellement par observation au moyen dun microscope, le
praticien dcide des ovocytes qui seront fconds. La dtermination des ovocytes
satisfaisants est donc trs fortement praticien-dpendante.
Les Conditions exprimentales : actuellement, toutes les oprations ncessaires
une FIV se droulent manuellement en salle grise, une temprature de lordre
de 35 C. La salle grise est galement enrichie en CO2 pour augmenter le pH de
latmosphre. De plus, latmosphre est quasi sature en humidit.
Le savoir-faire du praticien : lexprience du praticien est une donne importante
du taux de russite de la FIV.
Cest dans ce contexte que nous avons entrepris la conception dun Lab On
Chip ddi la fcondation in vitro. Nous avons opt pour un Lab On Chip qui
apporterait des rponses au premier point dans les bonnes conditions expri-
mentales. La rponse au dernier point consisterait en lautomatisation totale de
la fcondation in vitro. Au vu de la complexit des tches assurer pour aboutir cette
automatisation nous navons pas retenu cette opration dans nos objectifs.
3
4 Plateforme pour la FIV
Nous avons donc entrepris la conception et la ralisation dune plateforme de ce Lab

On Chip qui accueillerait les ovocytes candidats une fcondation, et les instruments de
mesures qui vont assurer un choix objectifs des ovocytes pour un meilleur taux de succs
de la FIV.
Ainsi cette plateforme doit remplir les fonctions suivantes :
le maintien en vie des ovocytes ;
le positionnement des ovocytes ;
laccueil des sondes de mesures et de caractrisation.
Pour la ralisation de cette plateforme nous avons retenu la technologie silicium. Nous
1 nous sommes bass sur les techniques de microfabrication disponibles dans notre labora-
toire. Premirement, il sagit de mettre au point un systme de transport des cellules la
surface des microlaboratoires (plateformes daccueil). Ceci doit permettre de dplacer la
cellule dun poste danalyse un autre. Deuximement, Il faut assurer un positionnement
ultra prcis de la cellule au niveau des postes danalyse. Enfin, il faut mettre au point les
diffrents microcapteurs danalyse cellulaire ainsi que leur intgration sur les plateformes
daccueil.
Dans la premire partie, nous prsentons un schma de principe de la plateforme, nous

expliquons le choix des matriaux entrant dans la ralisation du microsystme et nous d-
taillons les diffrentes composantes du Lab On Chip. La deuxime partie est ddie
la partie silicium du Lab On Chip. Nous y prsentons les techniques de gravure du sili-
cium mises en uvre pour raliser la plateforme. Dans la troisime partie nous montrons
comment une plaque en verre soude la plateforme peut garantir ltanchit du mi-
crosystme, et assurer linterface avec des systmes de pompage externes. La quatrime
partie, montre les moyens et les techniques utilises pour lassemblage des diffrentes
composantes du microsystme. Nous prsentons aussi un montage exprimental ddi
la validation de notre microsystme. Une cinquime partie est ddie un microsys-
tme pour ltude des proprits optiques de lovocyte. Enfin, nous terminerons par une
conclusion sur cette partie.
1.1 tat de lart

Introduction
Dans cette partie nous prsentons les techniques les plus courantes utilises dans la
micromanipulation des cellules biologiques.
Enfin nous fixons, au vu de cet tat de lart, les contraintes auxquelles doit satisfaire
notre microsystme. Llaboration de la solution technologique remplissant ce cahier des
charges sera prsente au cours de ce chapitre.
1.1 tat de lart 5
1.1.1 Les pinces optiques

Les lasers trouvent de continuelles applications en biologie, tant dans le domaine de
la recherche que dans celui du diagnostic et de la thrapeutique. Lutilisation de la force
optique produite par les lasers a permis de crer une pince optique capable dattraper une
cellule ou un fragment dorganite cellulaire, de les fixer et de les transporter dans un autre
site cellulaire.
Le principe de fonctionnement des pinces optiques est prsent sur le schma ci-
dessous (figure 1.1). Il dcrit la force optique sappliquant sur une sphre dans un gradient
dintensit lumineuse. Une bille de taille microscopique est place dans un faisceau fort
gradient dintensit lumineuse. Les rayons lumineux incidents (A et B) qui traversent
1
la bille changent de direction leur entre et leur sortie. Les modifications de quantit

de mouvement qui en rsultent produisent des forces optiques (FA et FB ) dautant plus

grandes que lintensit lumineuse est forte (FB > FA ). La force rsultante qui sexerce

sur la bille (Fres = FA + FB ) tend attirer la bille dans la direction o la lumire est la
plus intense.
Gradient d'intensit
A B

FA FB

Fres = FA + FB
F IGURE 1.1 Principe physique des pinces optiques
Les pinces optiques ont t utilises pour capturer, slectionner et dplacer de nom-
breux types cellulaires ou organismes unicellulaires : bactries, virus, spermatozodes,
globules rouges, cellules rtiniennes en culture[1]. La slection et la mise en contact de
cellules photosensibles avec des cellules neuronales a permis dtudier le dveloppement
des contacts intercellulaires et la rgnration de synapses entre ces deux types cellu-
laires [2]. La manipulation optique de cellules mobiles comme les spermatozodes pour
la mesure de leurs forces de propulsion flagellaire et dchappement des piges optiques
constitue un outil de diagnostique de certaines strilits [3].
Performances et inconvnients
Les pinces optiques sont capables de manipuler des micro-objets en milieu fluide,
mais plus particulirement aqueux, dont la taille varie de 25nm environ (taille critique
pour russir le pigeage) 32m pour les forces de lordre de quelques dizaines de pN et
pour un laser de 100mW [4], les particules se dplaant jusqu quelques 220m/s pour
une particule de 2, 68m environ et une puissance laser de 128mW [5].
Cependant, la manipulation de cellules biologiques par laser trapping a des effets n-

fastes non ngligeables. En effet, certaines cellules, en fonction de la longueur donde et
1 de la puissance du laser, sont dtruites lors de la manipulation [6, 7]. Morito propose, pour
pallier ce problme, dutiliser les infra-rouges moins destructeurs que la lumire visible
[8]. Arai, propose lui, de manipuler la cellule cible en la poussant, soit avec des cellules
manipules par laser qui, elles, seront dtruites[9], soit avec un pousseur artificiel dplac
par laser trapping[10]. Ce risque de destruction de cellules reste le principal dsavantage
de ce type de manipulation.
1.1.2 La manipulation mcanique

Les cellules biologiques peuvent tre dplaces par une simple action mcanique.
Deux grands modes de dplacement sont possibles : la pousse dans un plan et la saisie
par pince.
Arai propose de pousser une cellule laide dun manipulateur dplac par laser
trapping[11]. Le laser trapping peut, par lutilisation de laser trop puissant, dtruire les
cellules. En poussant une cellule laide dun pousseur manipul par laser trapping, on
ne dtruit pas la cellule pousse, non expose au laser.
Gauthier [12] a dvelopp un micropousseur magntique voluant dans un milieu
aqueux insr entre deux lamelles de verre utilises pour les observations au microscope.
Le principe dactionnement du pousseur repose sur lutilisation dun champ magntique
cr par un aimant. Cet aimant, contrl en position, est situ sous les lamelles. Le mi-
cropousseur est labor avec un matriau ferromagntique. Le mouvement de laimant
dplace le pousseur dans le milieu liquide. Grce ce dispositif, des particules, dont le
diamtre minimum est vingt micromtres, sont guides et positionnes avec une prcision
de lordre du micron.
Une autre ide est de raliser une pince cellules. Dans ce domaine, Jager[13] pr-
sente un microrobot articul avec un bras et une pince, tous deux actionns grce des
polymres actifs. Ces polymres actifs ont la proprit de se dformer au sein dun milieu
aqueux sous leffet dun champ lectrique. Ce robot travaillant en milieu aqueux permet
la manipulation dobjets de 100m sur une plage de 250m.
Il existe galement une alternative des pinces. Une structure rigide est monte sur un
dispositif de dplacement. Cette structure fait office de cage pour emprisonner la cellule et
ainsi la dplacer. Sadani [14] utilise ce principe pour manipuler un ovocyte. Il est consti-
tu dun bras mont sur un dispositif de translation. Le bras est perc son extrmit pour
1.1 tat de lart 7
accueillir lovocyte.
Ces systmes prsentent des aspects trs pratiques. Ils sadaptent diffrentes tailles
de cellules dont la plus petite mesure une vingtaine de microns. Nanmoins, ces outils
sont uniquement ddis au positionnement des cellules, ils nintgrent pas des systmes
danalyses. Pour dplacer les cellules ces techniques ncessitent lutilisation dun champ
magntique ou lectrique et/ou un contact mcanique ce qui risque dendommager les
cellules.
1
1.1.3 La dilectrophorse
Parmi les techniques de manipulation, celles bases sur une approche utilisant un
champ lectrique sont particulirement adaptes la miniaturisation [15]. Elles combinent
les avantages de la rapidit, la flexibilit, le contrle et la facilit dautomatisation. Selon
la nature des particules manipuler, diffrents types de champs lectriques peuvent tre
appliqus :
Un champ de courant continu pour llectrophorse de particules charges,
Un champ non uniforme de courant alternatif pour la dilectrophorse (DEP) de
particules polarisables (charges ou neutres).
La dilectrophorse est un phnomne qui trouve son origine dans les proprits di-
lectriques des matriaux qui, sous leffet dun champ lectrique se polarisent [16]. Si
le champ lectrique appliqu est non uniforme lchelle dune particule dilectrique,
celle-ci va subir des forces dilectriques qui, de par cette non uniformit, vont lentraner
soit du ct de la zone o le champ est le plus fort (dilectrophorse positive) soit du
ct o il est le plus faible (dilectrophorse ngative). La dilectrophorse permet donc
de manipuler des particules avec des champs lectriques. Un intrt premier est de pou-
voir travailler avec des champs alternatifs, supprimant ainsi les ractions lectrochimiques
parasites dans les chantillons biologiques.
La manipulation de cellules biologiques par dilectrophorse est une technique cou-
ramment utilise aujourdhui[17] . Les microsystmes dvelopps permettent de crer des
champs lectriques suffisamment intenses pour envisager de faire de la dilectrophorse
sur des cellules. Ainsi, le champ dapplications de la dilectrophorse souvre aux bio-
technologies et notamment celui de la manipulation de petits chantillons cellulaires
[18].
Diffrents systmes ont t mis au point pour manipuler et sparer des cellules biolo-
giques. Outre les paramtres caractrisant le systme (gomtrie des lectrodes, tension
applique, frquence . . . ), le comportement des cellules soumises au champ lectrique
est directement li leurs proprits dilectriques qui par l mme deviennent un critre
de tri. Les cellules malades ont des caractristiques dilectriques diffrentes des cellules
saines. Elles se comporteront donc diffremment lorsquelles sont soumises un champ
lectrique. Cest en se basant sur cette particularit que des systmes de diffrenciation
de cellules ont t conus, notamment un dispositif permettant disoler et de collecter

dans le sang des cellules infectes par la leucmie [19] . La dilectrophorse a t utilise
pour sparer et caractriser des cellules normales ou cancreuses [20] Des applications de
transport et de sparation de cellules et de particules dans des microrseaux dlectrodes
ont ainsi t ralises [15], notamment par Fuhret et al. qui ont utilis la DEP dans un dis-
positif pour aiguiller et concentrer des particules avec des vitesses maximales denviron
10mm par seconde [21].
1 Malgr les avantages offerts par cette mthode mentionns ci-dessus des inconv-
nients persistes. En effet, les cellules manipules sont soumises des champs lectriques
trs intenses (quelques dizaines de kV /m) dont les effets physiologiques long ou
court terme ne sont pas connus. En effet, certains organismes subcellulaires sont polaires,
comme par exemple lADN. Il est donc, dans notre cas trop hasardeux dutiliser cette
technique. De plus pour certaines frquences, le milieu cellulaire se met bouillir ce qui
entrane dune part lrosion des lectrodes du systme [22] et dautre part lvaporation
de la solution constituant le milieu.
1.1.4 Manipulation des cellules par ondes acoustiques

Une mthode originale base sur lutilisation dun pige tridimensionnel non intrusif
pour les particules microscopiques dans un liquide a galement t utilise. Ce pige est
bas sur les forces acoustiques. La thorie de lvitation et du pigeage est bien comprise
[23, 24]. La mthode est applique pour ltude de la tension superficielle la surface
de gouttes de liquide de lordre du millimtre [25], des oscillations de forme et la d-
formation de gouttelettes et de cellules biologiques [26] et des proprits mcaniques de
matriel biologique, comme les globules rouges [27].
Hertz et al. [28] ont dcrit un pige tridimensionnel non instructif bas sur les forces
acoustiques dans une cavit ultrasonique. Les expriences 11 mgahertz dmontrent le
concept et vrifient les forces thoriques. Les calculs thoriques pour des systmes de plus
haute frquence indiquent un potentiel significatif pour le pigeage de particules submi-
cromtriques.
1.1 tat de lart 9
La diffrenciation entre les cellules et le srum physiologique dans lequel baignent,

implique de gnrer un champ acoustique de forte nergie. Il est important dajouter que
ces champs dondes trs nergtiques entranant un phnomne de radicalisation de lox-
gne. Les radicaux libres tant nocifs pour les cellules vivantes, cette technique leur est
donc prjudiciable [29]
1.1.5 La microfluidique
La microfluidique tudie le transport de fluides souvent biologiques, de lchelle de 1
quelques microns quelques centaines de microns. A cette chelle les effets inertiels
( lorigine de la turbulence) sont gnralement ngligeables. Ainsi les globules rouges
transportes dans un capillaire sanguin (souvent plus troit que le globule lui-mme), un
fluide de polymres circulant travers un milieu poreux, constitue des systmes micro-
fluidiques. A cette chelle cest la viscosit qui domine, les effets de tension de surface
peuvent aussi tre prpondrants.
La plupart des dispositifs microfluidiques sont composs de capillaires et de chambres
de ractions. Pour les usiner, on part en gnral dun matriau solide, plan, dans lequel
nous allons forms des canaux et des cuvettes qui seront ensuite recouverts dun cou-
vercle. Pour raliser ces motifs, nous utilisons la lithographie et la gravure dun matriau
solide comme le silicium, le verre ou le quartz. Ou procdons par moulage ou emboutis-
sage de matriaux polymres. Les dimensions caractristiques des canaux sont de lordre
de la centaine de microns mais descendent parfois jusqu quelques dizaines de nano-
mtres. La nature du rgime dcoulement dun fluide est dtermine par le nombre de
Reynolds qui dpend de la vitesse dcoulement, du diamtre du capillaire et de la vis-
cosit du fluide. ces dimensions et dans les rgimes de vitesse habituels (infrieure au
centimtre par seconde), pour leau ou une solution aqueuse plus visqueuse, le nombre de
Reynolds est tel quil ny a jamais apparition de turbulence. Le dplacement de fluide est
effectu en utilisant notamment des micropompes (ou microvannes) ou encore les phno-
mnes dlectrocintique ou lectroosmose [30, 31].
Les applications majeures de la microfluidique portent sur le traitement de cellules :
analyse, contrle du dveloppement, centrifugation, dcoronisation, etc. Lanalyse de
lADN est un bon exemple dutilisation des rseaux microfluidiques. Le prlvement
dADN circule dans le rseau et traverse diffrentes zones de traitement avant dtre ana-
lys [32, 33].
La microfluidique est une technique idale pour le transport des cellules. Elle est non
invasive puisquelle ne ncessite pas de lien matriel pour dplacer les corps et elle ne
provoque pas de phnomnes susceptibles dendommager les cellules tels que la radicali-
sation de loxygne ou des chauffements localiss. Toutefois, la microfluidique prsente
des limites pour la capture et le maintien de cellules. Elle est forcment associe un
autre systme dont la fonction est dimmobiliser la cellule.
Conclusion
1
Dans cette partie nous avons prsent les techniques couramment utilises dans la ma-
nipulation des particules biologiques. En effet, des techniques utilisant des champs lec-
triques, magntiques ou acoustiques ont t mises en vidence. Bien que ces techniques
soient utilises dans plusieurs domaines avec efficacit, elles ne sont pas adaptes notre
application. Le caractre embryon-compatible de notre application interdit lutilisation de
ces diffrents champs. Ceci pouvant avoir des effets nocifs sur les ovocytes. Nous avons
prsent galement des techniques qui saffranchisent du premier inconvnient. La mani-
pulation par moyens mcanique, bien qui prsentent un avantage evident par rapports aux
techniques prcdentes risque dendommager les cellules. Enfin, nous avons prsent la
technique de la microfluidique qui semble la plus approprie. Il est vident que cette tech-
nique possde un caractre non invasif. Puisquelle utilise une turbulence dans le liquide
de vie pour dplacer les cellules.
Dans la partie suivante, nous allons prsenter les tapes de ralisation dune plate-
forme microfluidique sur silicium. Elle sera ddie au transport et au positionnement des
ovocytes afin de les analyser ou de guider la pipette dinjection du sperme.
1.2 Schma de principe 11
1.2 Schma de principe

Notre but est de raliser un Lab On Chip en silicium. Celui-ci comprend trois as-
pects. Le premier aspect est laccueil et le maintien en vie des ovocytes. Le deuxime
concerne un systme de transport et dimmobilisation des ovocytes sur des sites bien pr-
cis. Enfin, le dernier consiste mettre au point les diffrents microcapteurs danalyse et
de prvoir leur intgration sur le Lab On Chip. Avant de dcrire ce systme, il convient
de prciser que les contraintes lies la FIV interdisent lutilisation de tout champ lec-
trique, magntique ou acoustique. Nous avons donc opt pour un systme faisant appel
aux techniques de la microfluidique pour le dplacement et le positionnement prcis des
cellules. Cet aspect constitue la contrainte principale de notre travail et conditionne toute 1
la gomtrie du systme. Un schma de principe est donn sur la figure 1.2.
Connecteurs Sillons fibres Ovocyte Milieu Sens du dplacement Canal principal

microfluidique
Microcanal
Micro-canal Verre Ouverture Connecteur Silicium

Canal principal Micro-ouverture microfluidique
F IGURE 1.2 Schma de principe du "Lab On Chip".
Sur la face suprieure du microsystme, nous usinons un canal de 200 m de lar-

geur. Les largissements mnags aux extrmits de ce canal principal sont les zones de
dpt et de collection des cellules. Une succession de microouvertures (40 m espaces
de 2 mm) connectes des microcanaux usins en face arrire du dispositif, permettent
daspirer le liquide squentiellement dune ouverture lautre et de dplacer lovocyte.
Ltanchit des microcanaux est assure par soudure anodique dun wafer en verre. Ce
dernier est perc pour permettre de connecter les microcanaux au systme daspiration.
Des connecteurs microfluidique, colls sur le verre, assurent la liaison entre les micro-
canaux et le systme daspiration. Il faut noter que le diamtre des connecteurs micro-
fluidique commerciaux (8 mm), conduisent une taille relativement importante du Lab
On Chip (30 40 mm). De ce fait, nous ne pourrons fabriquer que quatre dispositifs par
wafer de quatre pouces. Sur la face suprieure, nous avons galement intgr des sillons
pour fibres optiques. Ces dernires constituent deux postes danalyse. Un systme de deux
fibres (premier atelier), est ddi la mesure de labsorption et de lindice de rfraction de
lovocyte. Une troisime fibre (deuxime atelier) permet la mesure du pH membranaire
de la cellule. Dans ce qui suit nous allons dtailler les diffrentes parties du microsystme
ainsi que les techniques dusinage utilises.
1.3 Choix de la technologie silicium

Le choix du matriau de base de notre microsystme sest port sur le silicium [15,
34]. Ce dernier semble le meilleur candidat pour plusieurs raisons. Premirement, nous
matrisons bien toutes les techniques dusinage ncessaires la ralisation du microsys-
tme. Deuximement, une simple oxydation thermique suffit le rendre embryocompa-
tible, ce qui est essentiel dans notre travail.
Nous utilisons un wafer de quatre pouces de diamtre, de 525 m dpaisseur et de
coupe <100>. Deux masques lithographiques de 5 pouces sont ncessaires pour la rali-
sation de la partie silicium de notre microsystme. Le premier masque (face suprieure)
1 dfinit les motifs de la face suprieure : le canal principal, les zones de dpt et de col-
lection et les sillons pour fibres optiques. Le deuxime masque (face infrieure), dfinit
les ouvertures connectes aux microsillons. Les tapes de la photolithographie sur chaque
face du wafer sont suivies par une tape de gravure sche pour la face suprieure et hu-
mide pour la face infrieure. Dans ce qui suit nous allons dtailler ces deux techniques.
1.4 Techniques dusinage du silicium

Deux types dusinages du silicium sont ncessaires la ralisation du microsystme.
Le premier est lusinage chimique par voie humide qui consiste usiner des chantillons
par trempage dans des bains dattaque chimique. Dans notre cas nous utilisons la potasse
(KOH) qui est probablement le bain dattaque le plus couramment employ [35, 36].
Le second type dusinage, dit usinage par voie sche, consiste en un bombardement de
lchantillon par un plasma. Dans notre cas nous utilisons la DRIE (Deep Reaction Ion
Etching.)[37]. Chaque technique intervient jusqu une profondeur bien dfinie comme le
montre le schma de principe (figure 1.3).
Il faut noter que nous avions utilis deux techniques pour la gravure du silicium, dans
le souci de rduire le nombre dtapes technologiques ncessaires la ralisation du mi-
crosystme. A laide de la DRIE la face infrieure ncessiterait deux tapes de masquage
avec alignement. Dans un travail prcdent [14] a mis au point une technique de gravure
KOH pour cette face.
Face suprieure
Gravure DRIE Canal Principal
hw
h1
h2
Face infrieure Ouverture

Gravure KOH pyramidale Sillon en V
F IGURE 1.3 Schma de principe des sites dimmobilisation.

1.5 Usinage de la face infrieure 13
La figure 1.3 montre les deux faces du wafer aprs usinages. En fait, chaque face est
grave laide une technique spcifique. Dans un premier temps, nous gravons la face
infrieure du wafer silicium dans un bain de KOH, jusqu ce que les ouvertures pyrami-
dales connectes aux sillons en V soient formes. Dans un deuxime temps, nous gravons
la face suprieure par DRIE jusqu une profondeur qui permet lobtention douvertures
la dimension dsire. En fait, au cours de cette dernire gravure nous arrtons le pro-
cessus de gravure plusieurs reprises pour mesurer la profondeur des structures ainsi que
la taille des ouvertures. Le processus de gravure prend fin une fois la taille des ouvertures
souhaite est atteinte. Il faut noter, que pour cette raison la gravure DRIE est effectue
aprs la gravure KOH. Au niveau dimensionnel, les donnes de base sont :
hw : paisseur du wafer (525 m).

1
w = 40m : ct de louverture.
Ensuite il reste calculer :
h2 : profondeur laquelle louverture fera 40m de ct ;

h1 : profondeur laquelle se forme louverture pyramidale.
La largeur de 40m pour la micro-ouverture daspiration na pas t choisie au hasard.

Sadani [14], a montr que cette dimension tait bien adapte la fois pour le dplacement
et pour le pigeage de la cellule. Dans ce qui suit nous dtaillons la mthode suivie pour
graver chaque face du wafer.
1.5 Usinage de la face infrieure

Sur cette face nous allons usiner des ouvertures pyramidales connectes des micro-
sillons. La technique de gravure du silicium retenue pour atteindre ce but, est la gravure
KOH. Le choix de cette mthode se justifi par la rsolution gomtrique des structures
quelle offre dune part, de la possibilit dobtenir cet usinage en une seule tape dautre
part [14, 38]. Toutefois, bien que nous obtenions facilement des structures gomtries
complexes parfaitement dessines laide de ce type de gravure, quelques architectures
simples impliquent la mise au point de structures de compensation parfois complexes.
Par exemple la fabrication de sillons en V formant un angle droit convexe [39, 40] ou
concave [41] ncessite lutilisation de motifs supplmentaires insrs au niveau des coins
proprement dit.
La technique de compensation utilise pour obtenir des microsillons formant des
angles droits parfaitement dfinis est dcrite en rfrence [14, 42]. Nous ny reviendrons
donc pas. Un autre motif qui ncessite des structures de compensation est constitu par les
ouvertures pyramidales connectes des microsillons. Une technique de compensation a
dj t propose pour un cas particulier [38]. Cependant, notre systme ncessite une
adaptation particulire de cette technique. Dans ce qui suit, nous prsentons en dtail la
structure que nous avons mise au point.
1.5.1 Gravure sans structure de compensation

Lorsquaucune compensation nest utilise, le motif du masque (figure 1.4) est com-
pos dun sillon dfini par une barre de largeur 2a oriente suivant la direction <110>.
Nous rappellons que le but est dobtenir une ouverture carre de ct w situe une pro-
fondeur h2 (voir figure 1.3). Dans ce cas, nous attendons que la relation entre w et la
dimension 2h du masque soit donne par :

1 V<110>
2h = w + 2h2 (1.1)
tan V(100)
1 O :
= 54.7 : est langle entre les plans {111}

et la surface du wafer.
V<110> : vitesse de gravure des artes
<110>.
V(100) : vitesse de gravure des plans {100}.
h2 : profondeur laquelle louverture
mesurera w de ct.
Il se trouve que cette relation nest jamais vrifie en raison de la sous gravure des plans
{411} qui tendent allonger louverture suivant la direction du sillon. Ces plans prennent
naissance aux points A ds le dbut de la gravure (voir rfrence [14] pour une description
dtaille de ce phnomne). La consquence principale est quon aboutit la formation
douvertures trs allonges dans le sens des microsillons.
y
z 2h
x SiO2 Si
A
<110> 2a
A
Sommet de la pyramide
F IGURE 1.4 Motif du masque non compens.
1.5.2 tude thorique de la structure de compensation

Cette section est divise en deux parties. Dans la premire, nous prsenterons la tech-
nique de compensation que nous proposons et nous dtaillerons le processus de gravure
qui mne des sillons connects des ouvertures pyramidales. La seconde partie est
ddie des considrations thoriques et ltablissement des rgles de compensation.
Nous rappelons que, le but est dobtenir des ouvertures pyramidales de profondeur h1
(voir figure 1.3). Ces dernires dbouchent dans le canal principal (profondeur h2 ) don-
nant naissance des ouvertures carres de ct w. Il faut noter que, la gravure pourrait
tre stoppe la profondeur h2 . Nous avons prfr poursuivre la gravure jusqu une
profondeur h1 pour tre srs que les ouvertures dbouchent dans le canal principal.
Prsentation de larchitecture de la compensation

1
Afin dobtenir des ouvertures pyramidales connectes des sillons avec une bonne
dfinition gomtrique, nous proposons la technique de compensation prsente en figure
1.5. Elle consiste dconnecter le motif du sillon du motif de louverture sur le masque
de lithographie. Le masque correspondant louverture nest plus un carr mais une sorte
de C lenvers de ct 2h.
y
z 2h
x SiO2 0 Si
A
Si 2a A
d
F IGURE 1.5 Motif du masque compens.
Lobjectif est de retarder linstant o les plans {411} commencent se dvelopper

depuis les points A. La structure de compensation est dfinie comme suit. La dimension
latrale est 2h, la largeur des segments en haut et en bas de la compensation est . Ainsi,
la distance entre ces segments et le sillon est 0 = h a . Dans ce qui suit, les
termes paramtres de compensation, ou CP feront rfrence d, cest--dire la distance
entre les points A et la partie verticale de la structure de compensation. En tudiant la
figure 1.5, il est clair que pour une dimension 0 donne, d est le paramtre crucial de la
compensation. En effet, il dtermine lintervalle de temps entre le dbut de la gravure et
le moment o les plans {411} commencent se dvelopper depuis les points A.
Au dbut de la gravure, des sillons en V commencent se dvelopper dans les ouvertures
du masque, de mme que des plans {411} depuis les coins convexes de la structure [43].
Lorsque le sillon en V principal est entirement usin (figure 1.6), louverture pyramidale
commence se former.
y
z 2h
{111}
{111}
x (100)
{111} A {411}
{111}
Plans
rugueux
Sillon principal
A
{111}
1 F IGURE 1.6 Apparition de la future ouverture pyramidale.
Des plans {111} apparaissent depuis les cts de dimension 2h. Ils conduisent aux
surfaces usines {100}. Dans le mme temps, les plans {411} se sont dplacs en direc-
tion du sillon. Des surfaces rugueuses relient les plans {411} aux surfaces usines (100)
[39, 44]. Progressivement, et comme il peut tre observ sur la figure 1.7, les artes <410>
rejoignent le sillon aux points A. La surface usine (100) voit sa dimension diminuer.
y
z
x < 410 > {111}
(100)
O A
{111}
{111} Plans
{411}
rugueux
{111}
Sillon principal
A
{111}
{411}
F IGURE 1.7 Evolution des plans lors de la gravure.
Ds lors, plusieurs processus de gravure ont lieu simultanment (figure 1.8). Certains
plans {411} se dveloppent vers lextrieur de la structure pendant que des plans {771} se
forment. Le plan {771}, le plus important est celui de droite (figure 1.8) car il commande
la gomtrie de louverture qui apparatra dans le canal principal la suite de la gravure
DRIE de lautre face.
y
z
{111}
2h
{111}
x {411}
C (100)
{111} {111}
Plans
rugueux {111}
{771}
F IGURE 1.8 Connexion du canal avant la formation de louverture. 1

Notons que de nouvelles surfaces rugueuses se dveloppent pendant cette phase de la
gravure. Ensuite certains des plans {771} se rejoignent au point C dans le fond du sillon.
Au niveau du point C, une surface (100) apparat et se dveloppe vers le bas du wafer.
Lorsque la gravure est compltement termine (figure 1.9) les plans {111} se rejoignent
au sommet de la pyramide au point (D). Le point (D) est centr par rapport aux motifs
initiaux 2h du masque.
{771}
y
2h
z {411}
{111}
x
D
{111}
{111} {111}
{111}
Plans rugeux
(100)
F IGURE 1.9 Formation de louverture pyramidale.
En conclusion de cette partie, trois principales tapes se distinguent dans le processus

de gravure. La premire tape correspond la priode entre le dbut de la gravure et
le moment o les artes <410> rejoignent les points A (en fait quand les plans {771}
apparaissent). La deuxime tape stend de la fin de la premire tape jusqu linstant
o le sillon est connect (quand les artes convergent vers le point O). Enfin, la troisime
tape dure jusquau moment o la pyramide est forme.
1.5.3 Rgles de dfinition de la structure de compensation

La partie prcdente met en vidence lexistence de limites pour la dimension d de la
compensation. La dimension maximale pour d est dicte par le fait que le sillon doit tre
connect quand la pyramide est forme. En dautres termes, la fin de la deuxime tape
doit correspondre la fin de la gravure. Cela fixe une valeur maximum pour d. En effet,
si d est plus grand que cette valeur, la gravure ne dure pas assez longtemps pour que le
sillon soit connect. Remarquons que le plan {771} se dveloppe suffisamment tt pour
lui permettre datteindre la profondeur h2 avant la fin de la gravure, louverture finale, au
niveau du canal principal sera rectangulaire [38]. Cela fixe une valeur minimale pour d.
Dans cette partie nous calculerons les valeurs limites acceptables pour le paramtre de
compensation.
Calcul des valeurs maximales pour d

1 Comme nous lavons prcis prcdemment, la valeur maximale d est rgie par le
temps ncessaire pour que les artes rejoignent le point O. A ce stade, il nous faut dter-
miner laquelle des artes nous devons considrer. Pour expliquer ceci, nous nous rfre-
rons la figure 1.10, o les proportions ont t intentionnellement exagres et o nous
reprsentons que la partie suprieure de la compensation. Pendant le processus de gravure
les artes et convergent vers le point O. La question est de savoir laquelle des deux artes
arrive en premier au point O. Comme nous pouvons le voir sur la figure 1.10, la rponse
dpend de linconnue d.
< 41
0>
< 41
0>
L <410>
0
(100)
<4
10 >
2a O
d0
d<410>
Max
F IGURE 1.10 : Larte <410> arrive la premire au point O.
Un lment de rponse consiste remarquer que lintersection entre les artes <410>
et <410> se dplace selon la direction avec un angle de 45 par rapport laxe du sillon.
Ici, nous percevons un cas particulier pour lequel les deux artes arrivent au point O en
mme temps. Ce cas particulier correspond une valeur de d donne par :
d0 = 0 + a (1.2)
Maintenant, pour chacune des artes nous calculons la valeur correspondante de dM ax .

Nous appellerons ces valeurs d<410> <410>
M ax et dM ax (figure 1.10). Enfin, nous comparerons les
valeurs calcules avec d0 . Si cest larte <410> qui rejoint le point O en premier, d<4 10>
M ax
doit tre suprieure d0 . Par contre, si cest larte <410> qui arrive en premier au point
O, d<4 10>
M ax doit tre infrieure d0 . Nous nous rfrerons la figure 1.10 pour calculer
<410>
dM ax . La distance que larte <410> doit parcourir est donne par :

<410> <410>
L = (cos ) 0 + a + dM ax tan (1.3)
Le temps ncessaire ce parcours est :
L<410>

cos
<410>
=
V<410>
=
V<410>
<410>
0 + a + dM ax tan (1.4) 1
Rappelons que <410> doit tre infrieur ou gal T = h1 /V(100) le temps requis pour
former la pyramide. Dans le cas contraire le sillon ne sera pas connect. Nous aurons
alors :
<410> 1 h1 V<410>
dM ax = (0 + a) (1.5)
tan V(100) cos
Intressons nous, maintenant, au cas o larte <410> arrive en premier au point O (figure
1.11). Un calcul similaire au premier calcul nous donne la valeur :

<410> h1 V<410>
dM ax = (0 + a) tan (1.6)
V(100) cos
0>
<41
0 L

< 41
0>
2a O
<410>
dMax
d0
F IGURE 1.11 : Larte <410> arrive la premire au point O.

Nous venons dtablir les expressions des paramtres dM ax concernant chacune des
artes <410> et <410>. Les conditions dfinissant lordre darrive des artes au point O
en fonction du paramtre d sont les suivantes :
Larte <410> arrive la premire au point O si : d<410>

M ax > d0 .
<410>
Larte <410> arrive la premire au point O si : dM ax < d0 .
Dans la pratique nous procdons comme suit :

1
Calcul de
d<410>
M ax
Calcul de
<410>
dM ax
la valeur
maximale
Larte
de la com-
<410> arrive
pensation
la premire
d<410>
M ax > d0
est dM ax oui
au point O
donne par
lqua(1.5) non
Larte
<410> arrive <410>
dM ax < d0
la premire oui
au point O
la valeur
maximale
de la com-
pensation
est dM ax
donne par
lqua (1.6)
Maintenant que nous avons dtermin les conditions pour lesquelles la connexion est
tablie au moment o louverture pyramidale est forme une profondeur h1 , nous allons
calculer les valeurs minimales du paramtre d pour obtenir des ouvertures carres la
profondeur h2 .
Calcul des valeurs minimales pour d

Avant de calculer la valeur minimum acceptable pour d, nous rappelons que le plan
{771} ne doit pas avoir atteint la profondeur h2 lorsque la gravure est termine. Il nous
faut donc valuer le temps ncessaire pour que ce plan {771} atteigne la profondeur h2 .
Sachant que cette dure doit tre infrieure au temps de gravure total, nous calculons la
valeur minimum admise pour d.
Le temps peut scrire sous la forme : 1
= 1 + 2
1 : le temps ncessaire pour quune des artes <410> atteigne un des point A (naissance
du plan {771}) ;
2 : reprsente le temps mis par le plan {771} pour voluer travers le wafer jusqu la
profondeur h2 .
Lide du calcul est la suivante :

Calcul des temps 1<410> et 1<410> ncessaires pour que les artes <410> ou <410>
arrivent au point A.
Calcul du temps 2 ncessaire pour que le plan {771} parvienne la profondeur h2 .
Dtermination de <410> = 1<410> + 2 et <410> = 1<410> + 2 .
Introduction des contraintes : <410> ou <410> doivent tre suprieurs au temps de
gravure totale, cest--dire <410> ou <410> h1 /V(100) .
<410>
Dduction des expressions correspondantes de dM in et d<4 10>
M in que nous compa-
rerons d0 (de manire analogue ce qui a t fait pour dM ax ).
Lexpression de 1 stablit de la mme manire que celle de dM ax . Seulement cette
fois, cest larte qui arrive au point A en premier quil faut dterminer. Pour cela, nous
devons considrer un cas particulier lgrement diffrent de celui pris en compte prc-
demment. Puisque cest le point A et non plus le point O quil faut considrer, d0 est
simplement donn par :
d0 = 0 (1.7)
Dans ce cas, nous obtenons les expressions suivantes :

<410> cos <410>
1 = 0 + dM in tan (1.8)
V<410>

<410> cos <410>
1 = 0 tan + dM in (1.9)
V<410>
Pour calculer 2 nous considrerons la figure 1.12, qui reprsente une vue en coupe de ce
qui se passe en dessous du point A.
Face suprieure
(gravure DRIE) D
w
h1 {111}
h2
L{771}

Face infrieure
(gravure KOH) c b
1 F IGURE 1.12 : Parcours du plan {771}.
De cette figure nous dduisons les expressions suivantes :

h2
tan = (1.10)
c
h2
tan = (1.11)
b+c
L{771}
sin = (1.12)
b
avec L{771} = V{771} 2
Desquelles nous obtenons :

h2 1 1
2 = sin (1.13)
V{771} tan tan
En combinant les relations 1.8 et 1.13, nous obtenons les expressions de <410> et
<410> . Rappelons que doit tre suprieur ou gale au temps total de la gravure T . Nous
en dduisons alors :

<410> V<410> h1 h2 1 1 0
dM in = sin
sin V(100) V{771} tan tan tan

<410> V<410> h1 h2 1 1
dM in = sin 0 tan
cos V(100) V{771} tan tan
En ce qui concerne le paramtre dM in , le raisonnement sur lordre darrive des artes

en fonction du paramtre de compensation est similaire au prcdent, la diffrence que
d0 = 0 , ce qui conduit :
Larte <410> arrive la premire au point O si : d<4 10>

M in > d0 .
<410>
Larte <410> arrive la premire au point O si : dM in < d0 .
Dans la pratique, nous procdons suivant le mme principe pour la dtermination de

dM ax . Les ingalits tablies ci-dessus dfinissent un domaine runissant lensemble des
valeurs des paramtres de compensation pour lesquelles nous obtenons un microcanal
correctement connect une ouverture carre non dforme au niveau du canal principal
(profondeur h2 ). Les valeurs numriques des angles et des vitesses de gravure peuvent
tre trouves en rfrence [38].
1.5.4 Influence des sous gravures des plans {111}

Dans ce qui prcde, nous navons pas tenu compte de lvolution des plans {111}
pendant la gravure. En ralit ces plans subissent une sous gravure. Cette dernire tend
1
translater le point A vers le haut suivant la direction <110> (figure 1.13). Cette sous
gravure des plans {111} se traduit par une augmentation des dimensions des microsillons
dune valeur :
= temps de gravure V<110>
Sous gravure

A
{111}
2a
A'
Sillon principal
F IGURE 1.13 Schma de la sous gravure.
La dure 1 relle est donc plus petite que celle exprime prcdemment. Cependant,
la manire de conduire les calculs reste la mme. Les paramtres de d prennent alors les
formes suivantes :
Les valeurs maximales pour d sont donnes par :

1 h1 V<410> V<110> V<110>
d<410>
M ax = 0 + a h1 +h1
tan V(100) cos V(100) V(100)

<410> h1 V<410> V<110> V<110>
dM ax = 0 + a h1 tan + h1
cos V<100> V(100) V(100)

V<110>
Valeurs comparer avec d0 = 0 + a h1 .
V(100)
Les valeurs minimales pour d sont donnes par :

1 1 h1 h2 1 1
d<4 10>
M in = sin 0
tan V(100) V{771} tan tan

<410> 1 h1 h2 1 1
dM in = sin 0 tan
V(100) V{771} tan tan
Ces dernires valeurs sont comparer avec d0 = 0 1 V<110> et 1<410> = 2 .

avec :
1 =
cos
V<410> + V<110> (cos + sin )

1<410> <410>
= 0 + dM in tan

1<410> <410>
= 0 tan + dM in
1.5.5 Calcul des diffrents paramtres

Pour obtenir une ouverture de 40 m de ct et une profondeur h2 = 325 m :
Les donnes
30.96
54.7
25.2
hw 525 m
h2 325 m
w 40 m
V<110> 0.006 m/min
V<410> 0.343 m/min
V(100) 0.26 m/min
V{771} 0.38 m/min
TABLE 1.1 Usinage : tableau des donnes.
partir de la relation (1.1) nous trouvons :
h = 242.62 m
Et par consquence (en prenant pour la valeur 3%(2h) 1 ) :
1. Valeur choisie arbitrairement.

h1 = h tan = 342.66 m
3%(2h) = 14.55 m
6.49 m
2a 145 m
Les valeurs maximales
0 = h = 155.57 m
d0 = 0 + a = 221.58 m
d<4 10>
M ax = 518.43 m
<410>
dM ax = 387.29 m
Les valeurs minimales
0 = h = 155.57 m 1
d0 = 0 V<110> 1 = 151.37 m
d<4 10>
M in = 296.46 m
<410>
dM in = 240.83 m
TABLE 1.2 Usinage : tableau des valeurs de dM ax et de dM in .
Pour les valeur maximales comme d<4 10>

M ax > d0 cest larrte <410> qui arrive la
premire au point O. Pour les valeurs minimales, comme d<4 10>
M in < d0 cest larrte
<410> qui arrive la premire au point A.
Donc, la valeur de d est situe entre d<4 10> <410>
M ax et dM in , dans notre cas nous la choisirons
telle que :
d<410> <410>
M ax + dM in
d= = 407.44 m
2
1.5.6 Rsultats Exprimentaux

Sur la base des techniques de compensation dcrites ci-dessus, nous avons ralis
un masque lithographique permettant dobtenir les ouvertures pyramidales (huit au total)
connectes des sillons. La technique de photolithographie nous permet de transposer
ce masque sur un wafer de silicium de taille 4 pouces. Ensuite nous procdons la gra-
vure KOH de la face arrire du wafer. La figure 1.14 montre une photo MEB de la face
infrieure de la plateforme. Nous distinguons sur cette dernire face les microcanaux
connects aux micro-ouvertures qui dbouchent sur lautre face.
Ouverture
pyramidale
1
microcanal
F IGURE 1.14 Image MEB de la face infrieure.
La figure 1.15(a) montre une vue rapproche de lune des ouvertures, o nous pouvons
voir clairement la connexion ouverture-canal. La figure 1.15(b), une vue rapproche dun
angle droit parfaitement compens.
(a) Image MEB dune ouverture pyramidale. (b) Image MEB dun angle droit.
F IGURE 1.15 Images MEB illustrant la technique de gravure utilise.

1.6 Usinage de la face suprieure 27
1.6 Usinage de la face suprieure

Sur cette face nous usinons les ouvertures et les canaux ncessaires laccueil, au
transport et limmobilisation de lovocyte, ainsi que les ateliers danalyse. La technique
de gravure retenue pour atteindre ce but, est la gravure RIE profonde (Deep Reaction Ion
Etchnig) en raison de la facilit quelle nous offre pour obtenir des structures de gomtrie
varies [37].
1.6.1 Mise en uvre exprimentale

1
La gravure sche ou gravure ionique ractive profonde (DRIE) met en uvre des plas-
mas. Elle consiste bombarder la surface dun substrat plac dans une enceinte sous vide
avec un flux de gaz ionis. Le mcanisme de la DRIE est physico-chimique. Il rsulte de
la combinaison dune attaque chimique et dun bombardement ionique. La superposition
dun bombardement ionique de faible nergie une attaque chimique dans le plasma per-
met de contrler lanisotropie de la gravure en activant lattaque sur les surfaces soumises
au bombardement ionique. Le principe repose sur une dcharge capacitive entre deux pla-
teaux parallles (lectrodes) baignant dans un plasma ractif. Le wafer de silicium est
plac dans une enceinte sous vide. Un flux gazeux de C4 F8 et SF6 ml loxygne est
ionis en traversant un champ radiofrquence (RF) avant datteindre la surface du wafer
graver. La couche de protection de silice (SiO2 ) ouverte par une attaque chimique joue
le rle de masque.
Nous utilisons alternativement les gaz C4 F8 et SF6 . Le SF6 pour la gravure et le C4 F8
(polymre) pour protger les flancs donnant naissance des flancs verticaux. Un champ
lectrique vertical oriente le plasma vers le bas donnant une gravure profonde. Notons
qu laide de cette technique nous pouvons obtenir des structures facteur de forme le-
ve. Il faut noter que cette technique donne naissance de micro-pics de silicium dus
une re-dposition du matriau dans les surfaces graves. Ces micro-pics sont gnrale-
ment appels herbe . Pour les liminer nous plongeons les chantillons dans un bain
KOH pendant quelques secondes.
1.6.2 Rsultats exprimentaux

Rsultats exprimentaux concernant la plateforme
Les rsultats exprimentaux obtenus laide cette technique sont prsents sur la
figure 1.16. Nous y reconnaissons notamment les zones de dpt et de collection des
cellules, les ouvertures qui servent la fois de systme daspiration et de sites dimmo-
bilisation. Sur cette figure, nous observons galement les sillons destins a recevoir les
fibres optiques (systmes danalyse) ainsi que le canal principal qui permet de canaliser
le liquide de vie cellulaire et donc damliorer la manipulation des cellules.
Structure de plaquage des fibres
Collection Dpt
Ouverture Canal
1
Sillons pour fibres
F IGURE 1.16 Image MEB de la face suprieure.
Les autres structures qui apparaissent sur cette figure sont destines au plaquage et
au collage des fibres optiques. Il faut galement noter que les fibres optiques doivent tre
parfaitement positionnes. Pour cela, des butes sont amnages proximit du canal
principal. Cet aspect fait lobjet dune autre partie qui traite des postes danalyse optique
des cellules.
Aprs la gravure le wafer est dsoxyd, puis lgrement oxyd (thermiquement) pour
obtenir une fine couche homogne de silice (SiO2 ) sur toute la surface ainsi qu lin-
trieur des ouvertures. Les plateformes acquirent ainsi une proprit primordiale pour
notre application : la non-embryotoxicit.
Rsultats exprimentaux concernant les ouvertures
La plateforme contient huit ouvertures destines dune part laspiration du milieu

de vie, piger les ovocytes sur des sites danalyses dautre part. La figure 1.17 montre
une vue rapproche sur lune des ouvertures. Nous constatons que sa dimension corres-
pond au micromtre prs la taille dsire, ce qui montre lefficacit des techniques de
compensation utilises mis au point.
1.6 Usinage de la face suprieure 29
1
F IGURE 1.17 Image MEB dune ouverture.
Rsultats exprimentaux concernant les postes danalyses

Prsentation schmatique
Il est vident que toutes les analyses effectues sur lovocyte doivent prsenter un
caractre non invasif. La cellule ne doit subir aucun traumatisme susceptible de dtriorer
son quilibre physiologique ou sa morphologie car aprs caractrisation, si la cellule est
juge apte, elle est destine tre fconde. Cest donc dans ce contexte que nous avons
opt pour des systmes danalyse optique. Il sagit ici de deux ateliers de mesures (figure
1.18).
Le premier est ddi la mesure du spectre de transmission de lovocyte. La mthode
consiste bloquer un ovocyte entre deux fibres optiques. La lumire issue dune fibre
mettrice traverse la cellule puis elle est collecte par une fibre rceptrice (figure 1.18(a)).
Lanalyse du spectre de transmission permet dobtenir des informations pertinentes
sur diffrentes caractristiques des cellules, en particulier sur leur degr de maturit[45].
Cet aspect sera trait plus en dtail dans la partie 1.10 de ce chapitre. Le deuxime atelier
est ddi la mesure du pH membranaire de lovocyte. La mesure repose sur lutilisa-
tion dune fibre clive lextrmit de laquelle un fluorophore spcifique est dpos. La
longueur donde de fluorescence varie avec le pH du milieu en contact avec la fibre. Une
mesure du pH membranaire peut tre effectue si lovocyte est en contact avec la fibre (fi-
gure 1.18(b)), ce qui explique la forme triangulaire des butes, et la position excentrique
de la micro-ouverture.
Canal principal Ovocyte Micro-ouverture Canal principal Fluorophore
Ovocyte
Micro-
ouverture
Fibre collectrice Bute fibre Fibre mettrice Bute fibre Fibre optique
(a) Mesure de spectre de transmision. (b) Mesure du pH membranaire.
1
F IGURE 1.18 Schma de principe des ateliers de mesures.
Rsultats exprimentaux
La figure 1.19, montre des vues rapproches. Sur la figure 1.19(a), nous reconnaissons
les sillons pour les fibres destines la mesure du spectre de transmission de lindice
de rfraction de la cellule ( noter la bonne gomtrie des butes de fibres ainsi que de
louverture daspiration). La figure 1.19(b), montre la bute pour la fibre de mesure du pH
membranaire. Nous remarquons lvasement du canal principal cet endroit ainsi que le
dcalage de louverture daspiration vers les butes. Ceci permet de positionner la cellule
en contact avec la fibre sans risquer de lendommager.
(a) Bute (mesure transmission). (b) Bute (mesure pH).
F IGURE 1.19 Rsultats exprimentaux ateliers danalyses.
Il faut conclure de ces rsultats que le procd DRIE que nous avons utilis est par-
faitement adapt la gravure de motifs de grandes dimensions ( zones de dpt et de
collection des cellules), mais galement la dfinition de motifs beaucoup plus petits (
butes carres ou triangulaires).
1.7 La partie verre 31
1.6.3 Conclusion
Les tudes dcrites dans cette partie concernent la ralisation de la partie silicium de
notre microsystme. Cette tape, ncessite lutilisation de deux techniques diffrentes de
gravure du silicium et lexploitation de chacune des deux faces du wafer.
Dans un premier temps, nous avons dcrit la face infrieure de cette partie silicium.
Nous avons mis au point une structure de compensation spcifique nous permettant dob-
tenir des microsillons connects des ouvertures pyramidales lors dune gravure humide
(bain KOH) qui seffectue sur une paisseur denviron 325 m. Il est important de no-
ter que notre mthode est simple et facile mettre en uvre. Elle ncessite une seule
opration de lithographie et une seule tape de gravure.
Dans un deuxime temps, nous avons prsent la gravure de la face suprieure. Sur
1
cette face nous avons utilis la technique de gravure sche (DRIE) qui nous a permis
dobtenir des structures de diffrentes gomtries. Ce type de gravure ne ncessite au-
cune compensation particulire au niveau du masque de photolithographie. En revanche
la qualit des flancs implique une adaptation des paramtres de gravure. Il faut noter la
grande prcision de cette technique ainsi que sa rapidit. Elle ne ncessite quune tape
de lithographie et une quarantaine de minutes pour effectuer le processus de gravure. En
fait, nous arrtons le procd ds que les ouvertures daspiration atteignent la dimension
dsire (ici 40 m de ct). Cette gravure doit tre suivie par une gravure KOH pendant
quelques minutes pour liminer lherbe produite dans le fond des structures graves.
1.7 La partie verre

Pour assurer ltanchit des microsillons usins sur la face infrieure de la plateforme
silicium, nous utilisons un wafer en verre(pyrex 7740). Dans ce wafer nous allons raliser
des ouvertures qui permettent la liaison entre le systme daspiration et la plateforme
silicium. Dans cette partie nous dcrivons les techniques de ralisation des ouvertures.
1.7.1 Prsentation schmatique
La ralisation des ouvertures dans ce wafer ncessite la gnration dun masque litho-
graphique.
La figure 1.20 reprsente un schma dune par-
tie du masque. Les croix sur le schma reprsentent
les endroits de perage des ouvertures. Les petits
cercles facilitent le reprage des ouvertures et les
grands cercles facilitent le positionnement des connec-
teurs microfluidiques lors de leurs collages sur la
1 plaquette de verre. La transposition du masque sur
Croix de repre Cercles d'alignement Verre un wafer en pyrex demande lutilisation dune tech-
pour perage des connecteurs
nique appele Lift-off [46]. Cette dernire permet
de raliser des motifs en chrome-or sur le wafer
F IGURE 1.20 Une partie du
en verre. Il faut noter que les croix reprsentent
masque pour les ouvertures.
lemplacement des futures ouvertures et que cha-
cune delles doit tre parfaitement positionne par rapport lextrmit du canal qui lui
correspond.
1.7.2 Rsultats exprimentaux
Lusinage de la partie verre se dcompose donc en deux parties : la lithographie et le

perage. La figure 1.21 (a) montre une vue du wafer de verre prt pour le perage. La fi-
gure 1.21 (b) montre les ouvertures dans le wafer raliss par perage mcanique (usinage
diamant). Leur diamtre est de 1mm, dimension adapte aux connecteurs microfluidiques
commerciaux.
(a) Avant perage. (b) Aprs perage.
F IGURE 1.21 Wafer de verre (4 pouces) aprs lift-off.

1.8 Assemblage du microsystme 33
1.8 Assemblage du microsystme
A ce stade les principales parties du microsystme ont t ralises. Il nous reste les
assembler pour obtenir un microsystme complet. Dans cette partie, nous allons dcrire
les techniques et les mthodes utilises pour effectuer cet assemblage.
Nous commenons par la soudure de la partie infrieure du wafer silicium sur le wafer
de verre, afin dassurer ltanchit des microcanaux. Pour cela nous utilisons une tech-
nique appele soudure anodique (anodic bonding). Cette dernire est utilise pour souder
hermtiquement du verre du mtal [47] ou des semi-conducteurs [48, 49]. Pour les sou-
dures faisant intervenir du silicium, le verre pyrex 7740 est particulirement bien adapt 1
[50]. Dans notre cas il est important daligner les deux wafers, afin que les ouvertures du
verre concident avec les extrmits des microcanaux de la partie silicium. Nous devons
donc effectuer une soudure avec alignement. Lalignement des deux wafers est effectu
sur un aligneur de type EVG. Les deux wafers (silicium-pyrex) aligns et plaqus lun
contre lautre sont transports dans le bti de soudure anodique. Nous appliquons une
certaine pression sur les deux wafers avant de crer un vide lger dans la chambre de
soudure. Nous portons ensuite la temprature des wafers aux alentours de 400 C.
Dans ces conditions, les ions sodium prsents
dans le verre acquirent une grande mobilit. Une
tension leve (>1 kV) est alors applique entre le
pyrex et le silicium. Les cations migrent en direc-
tion de la cathode tandis que les anions immobiles
forment une couche de charges ngatives au voisi-
nage de linterface verre-silicium. Ce phnomne
gnre des forces lectrostatiques puissantes lin-
terface qui plaquent les wafers lun contre lautre.
La soudure est tablie grce des interactions chi-
miques entre les atomes de silicium et les anions.
F IGURE 1.22 Face infrieure
Nous avons ainsi ralis avec succs une sou- aprs la soudure anodique.
dure totalement tanche et rsistante. La rsistance
a dailleurs t mise lpreuve lors de la dernire tape constitue par le dcoupage
des wafers la scie diamant. Nous obtenons ainsi une plateforme finie dont une vue de
dessous est prsente sur la figure 1.22.
1.8.1 Montage des connecteurs microfluidiques
Afin, dtablir une connexion tanche entre la plateforme et le systme daspiration,

des connecteurs microfluidiques commerciaux ont t utiliss (figure 1.23).
1
F IGURE 1.23 Montage des connecteurs microfluidiques.
Ces derniers sont colls sur la partie verre juste en face des ouvertures. Nous avons
parfait ensuite le collage par une tape dtuvage 65 C pendant 90 minutes.
Un premier test dtanchit du systme a t effectu avec de leau. Cet essai confirme
la bonne tenue des diffrents assemblages comme lillustre la figure 1.24.
Goutte d'eau Capillaire
F IGURE 1.24 Test des connecteurs.
1.8.2 Montage des fibres optiques et des capillaires microflui-

diques
Il sagit ici de fibrer le composant et dtablir la connexion entre la plateforme et
le systme daspiration. En ce qui concerne le fibrage du composant, la plateforme est
place sur un dispositif de fibrage spcialement conu pour cette opration (figure 1.25).
Pour le capteur pH membranaire, nous utilisons une fibre de 100 m de cur. Pour le
systme de mesure de spectre de transmission, nous utilisons une fibre de 50 m de cur
pour lmission et une autre de 100 m pour la collection. Les extrmits des fibres sont
clives.
1.8 Assemblage du microsystme 35
1
F IGURE 1.25 Dispositif de fibrage de la plateforme.
Sous binoculaire nous plaons les fibres dans leurs sillons respectifs. Nous les fai-
sons ensuite glisser dans les sillons (platine de translation) jusqu ce quelles arrivent en
contact avec les butes de fibre (figure 1.19). Nous nous assurons que les fibres sont bien
au fond des sillons, en utilisant une petite masse qui vient sinsrer dans des structures
spcialement graves sur la plateforme (figure 1.16). Le collage des fibres est assur par
le dpt de petites quantits dune colle biocompatible dans les endroits prvus pour cela
sur la plateforme. Le rsultat du montage des fibres est visible sur la figure 1.26(a).
En ce qui concerne la connection de la plateforme un systme daspiration nous
utilisons des capillaires de 125 m de diamtre. Sur la figure 1.26(b), nous montrons la
face infrieure de la plateforme aprs le montage des capillaires.
(a) Connexion des fibres optiques. (b) Connexion des capillaires.
F IGURE 1.26 Plateforme et les connexions associes.

1.8.3 Montage exprimental pour la manipulation et lanalyse

de lovocyte
Le systme utilis pour la manipulation et lanalyse des ovocytes est prsent sur la
figure 1.27. Il est compos de :
Une binoculaire dote dune camra CCD (Charge-Coupled Device), qui permet
dobserver et denregistrer les manipulations en temps rel.
Un systme daspiration compos de micro-injecteurs et de capillaires relis la
plateforme.
1 Un systme danalyse compos, dune source de lumire blanche connecte la
fibre mettrice, un spectromtre connect dun ct la fibre rceptrice et de lautre
un PC muni dun logiciel danalyse des spectres.
Spectre Image Camera

enregistr plateforme CCD
Micro-injecteur
Source de Spectromtre Micro-systme

lumire
F IGURE 1.27 Montage exprimental pour la manipulation et lanalyse dun ovocyte.
Il faut noter que les rsultats qui vont tre prsents ne concernent que le dplacement,
le pigeage dovocytes et la mesure du spectre de transmission. La mesure du pH mem-
branaire a t reporte. En effet la mesure du pH ncessite de mettre lovocyte en contact
avec un fluorophore. Ce dernier doit tre incorpor un polymre dpos en bout de fibre.
La mise en point dun tel polymre embryo-compatible et rsistant (pas de contamination
de la cellule) ncessite de longues tudes que nous navons pas pu inclure dans le travail
prsent ici.
1.9 Rsultats Exprimentaux . . . 37
1.9 Rsultats Exprimentaux des Manipulations de

billes et dovocytes
Dans un premier temps, le microsystme a t valid avec des billes en polystyrne
qui prsentent le mme diamtre que les ovocytes. Dans un deuxime temps, une srie
dexprimentations a t effectue au CHU de Besanon sur des ovocytes surnumraires.
1.9.1 Validation du microsystme avec des billes en polysty-

rne
1
Les billes sont dposes dans lun des deux rservoirs de la plateforme silicium dans
un milieu liquide. Nous avons film le dplacement des billes dune ouverture une autre
laide de la camra CCD. Au cours des exprimentations nous avons constat que le
dplacement des billes dans leau et avec des micro-injecteurs, sest rvl impossible. Il
semblerait que des effets de surface (non identifis) provoquent ladhrence des billes sur
le silicium oxyd. La force de trane ncessaire la mise en mouvement des billes est
alors importante. Nous avons donc utilis un liquide plus visqueux (huile) et remplac les
micro-injecteurs par des seringues.
La figure 1.28 montre une bille dans diffrentes positions pendant son dplacement.
Sur la figure 1.28(a) nous voyons la bille prs de la premire ouverture. Laspiration du
liquide travers la premire ouverture entrane le dplacement de la bille et son posi-
tionnement sur louverture (figure 1.28(b)). Laspiration du liquide travers la deuxime
ouverture accompagn par son expulsion de la premire ouverture permet le dplacement
et le positionnement de la bille sur la deuxime ouverture (figure 1.28 (c)). La rptition
de lexpulsion et de laspiration entrane le dplacement de la bille dune ouverture une
autre tout au long de la plateforme (voir les figures (d) (e), (f), (g), (h) et (i)). Enfin, il faut
noter le parfait positionnement des billes sur les ouvertures ce qui dmontre lefficacit
de notre technique.
(a) (b)
Bille
Ouverture
(c) (d)
(e) (f )
(g) (h)
(i)
1 mm
F IGURE 1.28 Le dplacement et limmobilisation dune bille en polystyrne.

1.9 Rsultats Exprimentaux . . . 39
1.9.2 Validation du microsystme avec des ovocytes surnum-

raires
La manipulation et lanalyse des ovocytes sont effectues lhpital (CHU Saint
Jacques de Besanon) dans un environnement spcifique la FIV. Nous avons utilis
des ovocytes surnumraires pour nos exprimentations. Nous respectons en cela les indi-
cations du comit dthique local.
Nous avons commenc par verser une quantit du milieu de vie cellulaire et puis nous
avons purg le systme en faisant circuler le milieu de culture travers les capillaires et
les microcanaux. Ensuite, lovocyte est introduit manuellement dans le liquide laide
dune micropipette dans lun des deux rservoirs (figure 1.29(a)). Nous aspirons ensuite 1
le milieu travers la premire ouverture laide du micro-injecteur. Lovocyte soumis au
mouvement du fluide se dplace jusquau niveau de louverture o il est immobilis. Pour
dplacer lovocyte vers louverture suivante, nous aspirons le liquide depuis la deuxime
ouverture et au mme moment nous expulsons un peu de liquide de la premire ouverture.
La rptition de lexpulsion et de laspiration entrane le dplacement de lovocyte dune
ouverture une autre tout au long de la plateforme figure 1.29. Enfin, il faut noter le
parfait positionnement de lovocyte sur les ouvertures ce qui dmontre une deuxime fois
lefficacit de notre technique.
(a) (c)
(b)
Ovocyte
(d) (e) (f )
(g)
1 mm
F IGURE 1.29 Le dplacement et limmobilisation de lovocyte.
La figure 1.30 reprsente deux vues rapproches de lovocyte positionn dans les ate-
liers danalyse. Sur la figure 1.30 (a) nous voyons lovocyte pig au niveau de latelier
de mesure du pH. Nous notons le bon contact entre la fibre et lovocyte. La figure 1.30 (b)
montre limmobilisation de lovocyte sur latelier de mesure du spectre de transmission.
L encore il faut noter la trs grande prcision dimmobilisation offerte par ce microsys-
tme.
Fibres
1 Ovocyte Fibres
Optiques
Ovocyte
Optiques
Canal Canal
200 m
200 m Principal Principal
(a) Mesure pH. (b) Mesure spectre de transmission.
F IGURE 1.30 Caractrisation de lovocyte.
1.10 Mesure des proprits optiques des ovocytes

avec un microsystme spcifique
1.10.1 Premier microsystme
Dans cette partie, nous prsentons un nouveau microsystme ddi la mesure des
proprits optiques des ovocytes. Ce dernier est constitu de deux partie, silicium et verre.
La partie silicium est compose principalement dune cuve et de deux sillons face face
(figure 1.31). Les mesures sont effectues sur un ovocyte plac dans la cuve entre deux
fibres optiques fixes dans les deux sillons. Le faisceau issu de la fibre mettrice (50 m de
cur) est collecte par la fibre rceptrice (100 m de cur) aprs avoir traverser lovocyte.
Lanalyse de lintensit lumineuse collecte permet de calculer lindice de rfraction de la
cellule. Par ailleurs, ltude du spectre de transmission fournit des indications sur le degr
de maturit des ovocytes.
1.10 Mesure des proprits optiques. . . 41
Cuve d'analyse Rceptacle

200*200
sillon fibre mettrice sillon fibre rceptrice
F IGURE 1.31 Schma de principe du systme.
1
La partie silicium du microsystme est usine par DRIE double face sur un wafer 3
pouces. Aux extrmits des sillons (ct cuve) nous avons usin des butes pour maintenir
les fibres une distance constante de part et dautre de la cuve. Aux autres extrmits (ct
externe) nous avons ralis des largissements des sillons pour permettre de contenir la
fibre avec sa gaine en plastique, ce qui empche son clivage au contact avec larte du
microsystme. Le rceptacle permet de prdisposer la cellule avant son transfert dans la
cuve danalyse. Les autres structures sur le schma sont utilises pour le plaquage et le
collage des fibres. Sur la figure 1.32, nous montrons des vues rapproches des composants
du microsystme.
(a) Gnrale. (b) La cuve. (c) En cours de test.
F IGURE 1.32 Vues rapproches du composant.
Nous distinguons bien les butes de positionnement des fibres optiques. Elle montre
galement une vue rapproche de la cuve danalyse ainsi quun ovocyte captur dans
cette dernire. Bien que ce microsystme nous ait permis damliorer nos connaissances
des procds DRIE, soudage anodique ..., il na pas permis un positionnement assez prcis
des cellules pour effectuer des mesures appropries. Un deuxime systme mieux adapt
a donc t ralis. Ce dernier sera utilis sur le micromanipulateur utilis en routine dans
le centre de procration mdicalement assiste de Besanon.
1.10.2 Second microsystme

En exploitant les techniques de gravure de silicium mises en uvre pendant la rali-
sation du premier microsystme, nous avons ralis le deuxime systme. Un schma de
principe de ce dernier est montr sur la figure 1.33 (a). La figure 1.33 (b) montre deux
vues rapproches sur le microsystme, la partie de gauche montre une vue rapproche sur
le centre du systme, nous distinguons les deux fibres (mettrice et rceptrice) et la mi-
cropipette pour positionner la cellule. Tant dis, que la partie de droite montre un ovocyte
positionn prs de la fibre mettrice.
1
Silicium
Fibre Fibre
mettrice rceptricetrice
Verre soud au silicium
(a) Systme de mesure.
500m
140m
Micropipette de contention
(b) Positionnement de lovocyte.
F IGURE 1.33 Systme de mesure des proprits optiques des ovocytes.
1.10.3 Mesure de lindice de rfraction des ovocytes

La mthode pour estimer lindice de rfraction des cellules consiste mesurer linten-
sit lumineuse collecte pour diffrentes positions de lovocyte entre les fibres optiques
[51]. Nous considrons que la cellule se comporte comme une micro-lentille. Dans ce
cas, lintensit lumineuse collecte dpend de la position de la cellule entre les fibres (fi-
gure 1.34 (a)). Dans notre cas, nous prendrons une mesure avec la cellule place contre la
fibre mettrice, une autre au centre et dernire avec lovocyte contre la fibre collectrice.
Nous obtenons ainsi trois points exprimentaux (figure 1.34 (b)). Ensuite, nous utilisons
un modle informatique (trac de rayon ralis par C. Pieralli charg de recherche au
1.10 Mesure des proprits optiques. . . 43
laboratoire) qui permet de calculer des intensits lumineuses collectes pour chaque po-
sition et pour des valeurs variables de lindice de rfraction (fitting sur lindice). Nous
considrons que nous avons calcul la bonne valeur de lindice quand lcart entre thorie
et exprimentale est minimis (au sens des moindres carrs). Dans notre cas, nous avons
mesur un indice de rfraction n = 1, 36.
n = 1.36
1 n=1.36 Meilleur fitting
n=1.32
0.9
n=1.3
n=1.36
0 x 0.8 Exp
.
n=1.36 1
0.7
n=1.32 Tho.
. Exp
. n=1.36
0.6 n=1.32
n=1.3 Tho.
n=1.3
0 x Position 1 Position 2 Position 3
(a) Principe de la mesure. (b) Comparaison entre les rsultats expri-

mentaux et thoriques.
F IGURE 1.34 Mesure de lindice de rfraction des ovocytes.
nous apercevons, sur la figure 1.34(b), que la valeur dindice n = 1.36 ne permet
pas une parfaite superposition des donnes exprimentales et numriques. Ceci est d au
fait que nous navons pas fait intervenir les pertes optiques dans la cellule. Un modle
numrique plus complet est en cours dlaboration.
1.10.4 Estimation de la maturit des cellules

Le degr de maturit des ovocytes est un lment essentiel de la cellule fconder.
Nous avons pu estimer ce dernier grce lanalyse du spectre de transmission avec notre
systme. Sur la figure 1.35 nous montrons une comparaison entre la forme du spectre
de transmission dun ovocyte mature et dun ovocyte immature. La principale diffrence
entre les deux spectre est visible dans la position du maximum et la largeur mi-hauteur
des spectres. Nous pouvons galement noter la prsence dun paulement dans le spectre
correspondant une cellule immature. Il faut noter que ces mesures ont t effectues sur
plusieurs ovocytes (matures et immatures) et le rsultat tait toujours prsente le mme
aspect.
Nous noterons enfin quun tel systme doit permettre la mesure simultane de trois
paramtres indpendants : indice, perte et maturit. Si nous restreignons ltude un
seul point de mesure (cas du Lab On Chip microfluidique prsent plus haut), ce simple
systme peut se comporter comme un capteur de maturit (figure 1.35).
Maxima
1
0.8 MATURE IMMATURE
paulement
(normalise)
0.6
Intensit
0.4
is
.(ta
y
n
I)u
le
rN
d
m
o
1 0.2
0
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Longueur donde (nm)
Largeur
F IGURE 1.35 Estimation de la maturit des cellules.
1.11 Conclusion
Dans ce chapitre nous avons ralis un Lab On Chip ddi laccueil, le transport
et limmobilisation dun ovocyte qui fera lobjet danalyse par des systmes danalyse
intgrs. En premier lieu nous avons prsent une configuration gnrale du Lab On Chip
et de ses diffrents composants. Nous distinguons notamment, une partie silicium, une
partie verre et une partie analyse. Nous avons commenc par prsenter la partie silicium
du microsystme, do une plateforme silicium pour laccueil des cellules a t ralise,
en utilisant les techniques dusinage dun wafer de silicium de coupe <100>. Deux types
dusinage ont t utiliss sur les deux faces du wafer :
La face infrieure : est ddie au transport et limmobilisation de lovocyte travers
un rseaux de microcanaux dbouchant dans des ouvertures sur la face suprieure.
Lobtention de ces derniers est atteint aprs usinage humide (KOH) o nous tions
amener prsenter des techniques de compensation nous permettant dusiner, des
microsillons formant un angle droit et connects des ouvertures pyramidales.
La face suprieure est ddie pour laccueil et lanalyse de lovocyte, o nous avons
utilis la technique de gravure sche appele DRIE.
Il faut noter que seulement aprs cette gravure nous parvenions dboucher les ou-
vertures pyramidales ralises sur la face infrieure du wafer. Nous avons dmontr aussi
quun usinage de trois sillons sur cette face nous permettra dintgrer des fibres optiques
pour lanalyse des ovocytes. Aprs la description des deux techniques de ralisation, nous
avons dmontr la validit de ces techniques par les rsultats exprimentaux.
Lautre partie du microsystme est constitu un wafer en verre, usin dans des sites
bien dfinis pour raliser des ouvertures de 1mm de diamtre. Sur ce wafer galement
1.11 Conclusion 45
nous avons ralis des cercles en or pour faciliter le collage des connecteurs microflui-
diques. Nous avons ainsi mis en vidence les techniques dusinage du verre et la technique
de dpt de lor.
La dernire partie a t destine aux rsultats exprimentaux obtenus par la manipula-
tion de billes en polystyrne et des ovocytes. En premier lieu nous avons utilis des billes
en polystyrne, qui ont la mme taille que celle des ovocytes. Les rsultats de dplace-
ment et dimmobilisation de ces derniers ont dmontr lefficacit de notre technique, ce
qui nous a encourag faire des manipulations avec des ovocytes surnumraires.
Nous avons ralis une exprimentation de la plateforme laide dovocyte surnum-
raires. Ces derniers sont dposs dans lun des deux rservoirs de la plateforme silicium,
laspiration du milieu de vie par les ouvertures provoque le dplacement de lovocyte jus- 1
quau point daspiration. Ainsi le transport de lovocyte est accompli par des aspirations
squentielles ralises travers les ouvertures. Il faut noter la prcision de limmobili-
sation des ovocytes et cela notamment sur les sites danalyses. Enfin, des analyses ont
t effectues sur les ovocytes notamment ceux du spectre de transmission et ils ont don-
ns des rsultats encourageants. Ces derniers vont nous permettre de se concentrer dans
un avenir proche sur les systmes danalyse pour la caractrisation des ovocytes avant et
aprs fcondation.
II
Lab On Chip pour le transport et
le contrle qualit du greffon
cornen.in vitro
Sommaire Chapitre
2.1 Gnralits
2.2 La greffe de la corne
2.3
2.4
2.5
2.6
Comportement optique de la corne
Dispositif exprimental . . .
Tests sur site
Conclusion
2
Etude du spectre de Transmittance
de la corne
L
e contrle de la qualit des cornes destines la greffe consiste en un examen
microscopique aprs sa coloration par le bleu trypan 0, 3 filtr. Il est impratif
de trouver une nouvelle mthode de contrle car le bleu trypan, produit que
les biologistes utilisent actuellement dans le cadre du contrle de la viabilit
endothliale, sest avr toxique et mutagne et sera sans doute interdit dans lavenir.
Les cellules qui couvrent les surfaces, particulirement les cellules endothliales, sont
intimement lies la transparence de la corne, puisquelles sont responsables de main-
tenir ltat de dturgescence du stroma. Issue de cette constatation, lide directrice du
projet est de raliser des mesures optiques de la transmittance lumineuse pour, ensuite,
corrler cette transmittance au nombre de cellules endothliales vivantes.
Lide de caractriser les cornes par la mesure de leur transmittance nest pas nou-
velle. Parmi tant dautres, des travaux [52] ont t raliss luniversit de Sao Paulo au
Brsil sur un systme permettant la mesure de la transparence de cornes in vitro. Tou-
tefois, le lien entre la transmittance et le nombre des cellules endothliales na pas t
exprimentalement mis en vidence.
2.1 Gnralits
2.1.1 Anatomie
La corne est la partie transparente antrieure du globe oculaire, en forme de calotte
sphrique lgrement saillante. Cest le premier lment rfractif de lil, comptant pour
les deux tiers du dioptre oculaire.
Elle couvre environ un cinquime de la surface de lil. Elle mesure en moyenne, chez
ladulte, 1, 1cm de diamtre. Son paisseur diminue de la priphrie (environ 600m)
49
50 Etude du spectre de Transmittance de la corne
vers le centre (environs 500m). Le rayon de courbure de la face antrieure est de 7, 8mm,
6, 8mm celui de la face postrieure et dindice de rfraction de 1, 377. La corne a be-
soin de larmes pour laider liminer les lments indsirables. Elle reoit son milieu
nutritionnel travers lhumeur aqueuse contenue dans la chambre antrieure. Grce la
corne et au cristallin, on peut voir les objets les plus loigns comme les plus proches.
Le rle de la corne se rsume essentiellement trois activits :
la protection de lil des lments indsirables comme les salets et les germes ;
la focalisation de la lumire sur la rtine de lil ;
le filtrage des rayons UV provenant du soleil.
2.1.2 Histologie
2
La corne est compose de trois couches de cellules et de deux membranes, on dis-
tingue dans lordre (figure 2.1) :
lpithlium cornen ;
la membrane de Bowman ;
le stroma cornen ;
lendothlium cornen.
Cellules Epithliales
membrane de Bowman
Stroma
Cellules Endothliales membrane de Descemet
Chambre Antrieure
F IGURE 2.1 Structure de la corne.
Lpithlium
Lpithlium cornen est la couche qui couvre la surface de la corne, elle est forme
de 5 7 couches de cellules. La couche basale est forme de cellules cubiques reposant sur
une lame basale, et, est accroche trs fortement au stroma par des complexes dadhsion
(hmidesmosomes). Il a un rle de barrire et facilite la dispersion du film lacrymal la
surface de la corne.
2.1 Gnralits 51
La membrane de Bowman
La membrane de Bowman se situe entre la couche basale pithliale et le stroma. Son

paisseur est de 8 14 m mesure au centre de la corne. Elle est compose de fibres
collagnes, mesurant 24 27 m de long et 20 30 m de diamtre, rparties au hasard
dans la substance fondamentale. Cette couche est dpourvue de cellules, hormis de fines
expansions des cellules de schwann entourant les terminaisons nerveuses qui la traversent.
Elle est difficile percer et protge ainsi la corne des blessures. Toute fois, elle ne se re-
nouvelle jamais et par consquent une lsion de celle-ci est dfinitive.
Le stroma
2
Le stroma cornen reprsente la majeure partie de lpaisseur de la corne. Il est
constitu deau et de fibres Collagnes denviron 36 nm de diamtre, groupes en la-
melles parallles la surface cornenne. Le stroma contient plus de 200 lamelles de 1
2 m dpaisseur chacune. Larrangement des fibres dans une lamelle donne est trs or-
donn formant des colonnes parfaitement parallles. Cette formation donne la corne sa
clart, sa solidit et sa gomtrie. Elle contient aussi des cellules appeles les kratocytes
disperses entre les lamelles formant un rseau de liaisons dans toute la corne. Elles oc-
cupent 3 5 % du volume du stroma. Ce dernier a une forte tendance absorber leau
et gonfle en raison de la nature hydrophilique du proteoglycan qui compose la matrice
entourant les fibres collagnes.
La membrane de Descemet
Lame basale de lendothlium dune paisseur de 10 m 12 m. Elle est solide et

trs lastique tout en tant permable leau. La membrane de Descemet est une mem-
brane collagnique acellulaire entre le stroma postrieur et la monocouche endothliale.
Elle est en continuit avec le rseau trabculaire en priphrie de la corne. La jonction
Descemet-stroma est riche en fibronectine, qui joue un rle dans ladhsion des deux
structures. Elle est synthtise par les cellules endothliales et spaissit avec lage.
Lendothlium
L endothlium cornen est une monocouche cellulaire formant une mosaque hexa-
gonale. Ses cellules ne se rgnrent pas. Le nombre de ces cellules - et donc la densit
cellulaire, en cellules par mm2 - reflte la bonne qualit de la corne. Lors dune greffe de
corne, ce critre est important pour le mdecin, qui va limplanter sur lil dun patient.
Dautres critres aussi important lors de la greffe sont la transparence du greffon (qui
lheure actuelle reste un critre subjectif) et la morphomtrie cellulaire. Les cellules qui
couvrent les surfaces, particulirement les cellules endothliales, sont intimement lies
la transparence de la corne, elles sont responsables du maintien de ltat de dturges-
cence du stroma - cest le mcanisme par lequel le stroma reste dans un tat dhydratation
quilibre [53, 54, 55]. Elles pompent lexcs de fluide pour empcher son gonflement
[56], et par consquent son endommagement. La dgradation de lendothlium peut me-
ner dme cornen et entrane un aveuglement. Actuellement la seule thrapie possible
est la transplantation cornenne.
2.2 La greffe de la corne

2.2.1 Les maladies de la corne
Lorsque la corne devient opaque, lil devient non voyant (20 % des ccits). Le
traitement ne peut alors tre que chirurgical, on compte aujourdhui en France, peu prs
2 7000 patients malvoyants en attente dune greffe de corne.
2.2.2 Lintervention chirurgicale

Le but de lintervention est de remplacer la corne malade par une corne saine et
transparente, prleve plusieurs jours auparavant sur un donneur dcd. Au cours de
cette intervention, le chirurgien peut associer dautres gestes chirurgicaux : chirurgie de
la cataracte, changement dimplant intraoculaire, vitrectomie, chirurgie du glaucome
La greffe de la corne est ralise le plus souvent sous anesthsie locale et ncessite
une hospitalisation de 2 6 jours suivant les habitudes des diffrentes quipes mdicales.
Les suites opratoires ne sont pas douloureuses et le traitement post-opratoire se rsume
le plus souvent linstillation de collyres antibiotiques, anti-inflammatoires et cicatrisants.
La cicatrisation est cependant lente et ncessite 3 6 mois, voire parfois un an dans
certains cas pour apprcier le rsultat visuel dfinitif. Le pronostic de lintervention est
bon avec 90 % de greffons transparents, 5 ans aprs la chirurgie.
2.2.3 Le prlvement et la conservation du greffon avant la

greffe
Avant de pouvoir tre greffe, la corne est dabord prleve [57] sur un donneur d-
cd puis conserve obligatoirement dans le laboratoire dune banque de cornes agres.
Ces diffrentes activits doivent respecter un certain nombre de grands principes prvus
par les lois dites " biothiques " du 29 juillet 1994, savoir : respect du corps humain, gra-
tuit du don, anonymat donneur-receveur avec cependant traabilit, consentement pra-
lable et prsum du donneur, scurit sanitaire.
Le prlvement
Le prlvement de la corne est ralis dans des conditions de strilit chirurgicale
soit dans un bloc au cours dun prlvement multi-organes (20 % des prlvements), soit
au dpt mortuaire dans une salle strile rserve aux prlvements lorsquil sagit dun
prlvement cur arrt (80 % des prlvements). Dans ce dernier cas, le prlvement
2.2 La greffe de la corne 53
peut tre ralis dans les 24 heures suivant le dcs. Seule la corne est prleve, le globe
oculaire lui mme reste en place et en particulier liris qui lui donne sa couleur. La res-
tauration tgumentaire comprend la mise en place dun couvre il transparent afin de
permettre au globe de conserver son galbe. Le respect anatomique du dfunt est ainsi
parfaitement conserv ce qui constitue un lment dterminant dans lacceptation du pr-
lvement par les familles.
Un prlvement sanguin, posteriori, est ralis pour les analyses srologiques obli-
gatoires.
La conservation du greffon dans la Banque des cornes

Une fois prleve, la corne est place dans un flacon de milieu de conservation scell
et tiquet puis transfre dans les 24 heures dans le laboratoire de culture pour y tre 2
value puis conserve (figure 2.2). Le transport seffectue la temprature ambiante.
F IGURE 2.2 Conservation de la corne aprs prlvement.
Le mdecin responsable de la banque des cornes doit sassurer de la parfaite excu-

tion de lensemble des oprations de prlvement (absence de contre indication au pr-
lvement, rencontre effective avec la famille, ralisation des Srologies, bonne tenue des
documents officiels). Il est ensuite charg de valider le greffon sur le plan sanitaire (s-
curit bactriologique, validation histologique) puis de lattribuer une quipe de greffe.
Tous ces contrles sont raliss pendant la priode de conservation du greffon.
Le contrle de la validit endothliale

A son arrive dans le laboratoire de la banque des cornes, le greffon bnficie dun
premier contrle avant sa mise en conservation proprement dite. Cette tape est indispen-
sable afin dliminer les greffons dficients. Ce contrle de qualit consiste en un examen
microscopique aprs coloration de la corne par le bleu trypan 0, 3 filtr. Afin dviter
toute contamination il doit tre ralis dans des conditions dasepsie stricte sous hotte
flux laminaire. Un comptage cellulaire endothlial est ralis dans la zone centrale laide
dune grille millimtrique place dans lun des oculaires du microscope. Le nombre de
cellules mortes (colores en bleu) est compt sur 1 mm2 .
Un consensus existe sur les critres de non conformits imposant la mise lcart du
greffon[58] :
2 densit cellulaire endothliale infrieure 2000 cellules/mm2 ;
pourcentage de cellules mortes suprieur 2 % ;
aspect irrgulier de la mosaque cellulaire endothliale ;
plis transverses de cellules endothliales mortes ;
opacit stromale diffuse.
Les cornes dclares conformes sont ensuite dposes dans un flacon de milieu de
conservation.
Note :
Les cornes sont conserves dans un milieu qui les fait gonfler pour faciliter le comp-
tage des cellules endothliales. Avant la greffe de 48 heures, les cornes sont dplaces
dans un autre milieu de conservation pour quelles retrouvent leurs tailles initiales.
La conservation de la corne en organoculture +31 C

Les cornes sont conserves en organoculture. Cette technique initialement dcrite par
Doughman en 1974 [59] puis modifie par Pels en 1983 [60], a t introduite en France
en 1986 par Delbosc [61]. Cette technique est actuellement la plus utilise en Europe.
Son principe est de maintenir la viabilit du tissu cornen, en particulier l endothlium,
en stimulant ses activits mtaboliques. Les milieux de conservation est constitu essen-
tiellement dun milieu nutritif, de srum de veau ftal, dantibiotiques, dantifongiques,
dun indicateur color de pH et de substances tampon. Lanneau cornosclral est sus-
pendu par un fil dans un flacon en verre contenant 50ml de milieu de conservation. Le
flacon est ensuite dpos dans un incubateur dont latmosphre est maintenue une tem-
prature constante de +31 C. Le milieu est renouvel de moiti aprs 15 jours.
La conservation en organoculture permet :
une scurit microbiologique bien suprieure toutes les autres techniques de conser-
vation [62] ;
lallongement du dlai de conservation dune semaine un mois. Ce dlai offre
le temps suffisant pour la ralisation des srologies sur le donneur et la possibilit
dexamens plus complexes (PCR (Raction en Chane de Polymrase.)). Il per-
2.2 La greffe de la corne 55
met des changes entre banques ( temprature ambiante). Il permet galement la

constitution dun stock de greffons disponibles pour les situations durgence, ainsi
quune meilleures planification des interventions.
Plusieurs contrles sont raliss au cours de la conservation du greffon cornen.
Le contrle microbiologique
Lors de la conservation en organoculture, la couleur du milieu est contrle tous les

jours. Un virage au jaune ou une turbidit indique une infection. La corne doit alors tre
dtruite. Un contrle bactriologique est ralis sur le milieu de prlvement puis sur le
milieu de culture la fin de la conservation.
2
Le contrle srologique du donneur
La priode de conservation permet la recherche des diffrentes maladies infectieuses

potentiellement transmissibles. Les examens obligatoires sont :
Srologie HIV1 et HIV2, recherche de lantigne p24,
Srologie HTLV I, II,
Srologie des hpatites B et C,
Srologie syphilitique.
Un chantillon de sang est par ailleurs conserv pendant 30 ans dans une srothque.
Le contrle de viabilit endothliale
Un dernier contrle de viabilit est systmatiquement ralis 24 48 heures avant la

greffe lors de la conservation en organoculture.
La corne est dclare conforme si :
Il ny a pas dantcdent contre-indiquant la greffe chez le donneur,
les srologies lgales sont ngatives chez le donneur,
le contrle microbiologique du milieu de conservation est ngatif,
la qualit de la corne est satisfaisante lors des deux contrles.
2.2.4 La cession de la corne

Aprs conservation en organoculture, la corne est place, sans suture, dans un flacon
de milieu dit de dturgescence contenant du dextran. Ce flacon de transport contenant le
greffon peut tre maintenu temprature ambiante pendant 2 3 jours avant dtre greff,
ce qui permet un transport ais vers un centre greffeur loign.
2.2.5 La greffe de la corne lEtablissement Franais du

Sang (EFS)
LUTCG (Unit de Thrapie Cellulaire et Gnique.) EFS-Bourgogne Franche Comt,
est implique dans la greffe des cornes, avec les travaux de mise au point dun mode de
conservation des greffons cornens par organoculture +31 C. Aujourdhui, traitant plus
de 1700 greffons par an, elle est la premire banque de cornes en France. Le contrle est
trs strict. En consquence, il ny a que 40 50% des greffons prlevs qui sont greffs.
2.3 Comportement optique de la corne

2 La corne, tant un tissu avasculaire, constitue une barrire anatomique et physiolo-
gique protectrice vis--vis des structures internes de lil. Optiquement, elle assure les
deux tiers du pouvoir de rfraction de lil en transmettant un spectre de longueur donde
compris entre 310 nm (ultraviolet) et 2500 nm (infrarouge).
2.3.1 Transmission de la lumire

Le taux de transmission de la lumire par la corne augmente avec la longueur donde
dans le spectre visible (environ 86 % 400 nm et 94 % 600 nm). Les longueurs donde
ultraviolettes sont fortement absorbes par la corne.
Lindice de rfraction des fibres collagnes est de 1, 47 et celui de la substance fon-
damentale est de 1, 34. Cette diffrence dindice de rfraction cre une dispersion de la
lumire au niveau de chaque fibre. Nanmoins, les effets des fibres sannulent entre eux
grce luniformit du diamtre et de la distance interfibres, et seule persiste la propa-
gation dans le sens des rayons lumineux, permettant ainsi la transmission de la lumire
travers le stroma (thorie propose par Maurice) [63]. Cette uniformit est cependant
relative, et la transmission de la lumire travers le stroma est favorise par le fait que le
diamtre des fibres et la distance interfibres sont plus petits que la longueur donde de la
lumire.
2.3.2 Rfraction de la lumire

Linterface antrieure air-corne un pouvoir rfractif trs lev (48 D) qui reprsente
80 % du pouvoir rfractif total de lil (60 D). Cette interface est elle-mme constitue
de deux interfaces successives : air (indice de rfraction 1, 000) / film lacrymal (1, 336)
puis film lacrymal (1, 336) / corne (1, 376) ; le pouvoir rfractif de linterface antrieure
correspond la somme du pouvoir rfractif de ces deux interfaces successives. Linterface
postrieure humeur aqueuse-endothlium cornenne un pouvoir rfractif plus faible, car
la diffrence dindice des deux milieux corne (1, 376) et humeur aqueuse (1.336) est
infrieur celui de linterface antrieure. Sa valeur est de 5 D. Le pouvoir rfractif
total de la corne est donc de 43 D en moyenne. Linterface antrieure air-film constitue
2.3 Comportement optique de la corne 57
la premire que traverse la lumire, par consquent, la qualit de la vision dpend de la

rgularit surfacique de l pithlium (figure 2.3).
F IGURE 2.3 Rfraction de la lumire par la corne[56].
2.3.3 Rflexion de la lumire
La corne se comporte galement comme un miroir convexe. Une source lumineuse

place 50 cm de la corne donne une premire image rflchie par la face antrieure de
la corne, situe 6 7 mm en arrire de celle-ci, et une deuxime image rflchie par
la face postrieure, de plus petite taille (image de Purkinje). La taille de limage rflchie
(reflet cornen) est donc fonction du rayon de courbure cornen.
Les surfaces antrieure et postrieure de la corne et du cristallin constituent quatre
surfaces de rflexion qui permettent lobtention des quatre images de Purkinje. La pre-
mire et la quatrime image de Purkinje sont en gnral utilises pour lenregistrement
de la direction du regard dans la technique Dual-Purkinje Image qui utilise la position
relative de ces rflexions pour calculer la direction du regard (figure 2.4).
Iris
Lentille Corne
Rayons
lumineux
1ere Image 2eme Image 3eme Image 4eme Image

de Purkinje de Purkinje de Purkinje de Purkinje
2 F IGURE 2.4 Reprsentation de lil et des quatres images de Purkinje.
2.4 Dispositif exprimental pour la mesure de la trans-

mittance de la corne
2.4.1 Description du dispositif de mesure
Nous avons, tout dabord, mis en place un dispositif optique de mesure de transmis-
sion relativement classique dot dun systme dclairage de Khler en lumire blanche,
permettant une illumination optimale des chantillons. La lumire transmise est collecte
par un objectif de microscope et injecte dans une fibre optique de 100 m de diamtre
de cur relie un Spectromtre, de manire visualiser le spectre en transmission de
lchantillon. Le montage exprimental est compos dune source de lumire blanche,
clairant un filtre infrarouge (F1 ) travers un verre dpoli. La lumire est ensuite projete
sur un diaphragme de champs (DC) laide dune lentille (L1 ), un diaphragme douver-
ture (DO) est plac au plan image. La lentille L2 collimate le faisceau issu de DO. Afin
dliminer les effets de linstabilit de la source nous ralisons des mesures relatives. Pour
cela, une lame sparatrice divise le faisceau en deux, lun constitue le faisceau de rf-
rence et lautre le faisceau de mesure. Le faisceau de rfrence rflchi par le miroir M
est focalis sur une fibre optique (100 m de cur) laide de lobjectif O1 . Le faisceau
de mesure traversant la corne est focalis grce lobjectif O2 sur la deuxime fibre. Les
signaux optiques guids par les fibres sont injects dans un Spectromtre (Ocean Optics
4000) deux entres. Ce dernier est reli une unit danalyse spectrale (figure 2.5(a)).
La figure 2.5(b) montre le dispositif exprimental mis en uvre pour les mesures de
la transmission.
2.4 Dispositif exprimental . . . 59
Source de lumire blanche
FI: Filtre infra rouge
Li : Lentilles biconvexes Dpoli
Oi : Objectifs de microscope FI
Fi : Points focaux F1
DC: Diaphragme de Champ
DO: Diaphragme d'Ouverture L1
DC
S: Sparatrice
pK: Plan Khler
M: Miroir F2
DO
FO: Fibre optique
Spe: Spectromtre
UA: Unit d'analyse L2
M S
F3
O1
Corne
F4
pK
O2
FO
2
UA Spe.
(a) Schma du dispositif.
Support
Cornes
Fibre
Optique
Spectromtre
(b) Montage exprimental du dispositif.
F IGURE 2.5 Dispositif exprimental pour la mesure de la transmission.

2.4.2 Caractrisation du dispositif.

Dans le but de caractriser le dispositif exprimental, la transmittance est calcule
partir des mesures obtenues dun chantillon de rfrence (filtre) dont les caractristiques
sont connues.
Dfinition de la transmittance
Considrons un faisceau lumineux dintensit I0 traversant un milieu absorbant dpais-

seur l et ressort avec une intensit I (figure 2.6).
I0 I
F IGURE 2.6 Transmission de la lumire par un objet absorbant.
La transmittance T dun milieu sexprime comme tant le rapport :

I
T = (2.1)
I0
O I et I0 sont relies par la relation de Beer-Lambert,
I = I0 el (2.2)
: le cfficient dabsorption ;
l : lpaisseur travers par la lumire ;
Calcul de la transmittance
La lumire recueillie par le Spectromtre est convertie en donnes numriques, qui

sont analyses par lunit de calcul. La transmittance est calcule daprs lquation (2.1)
en tenant compte de lintensit relative au courant dobscurit Ib (). On en dduit la
relation :
I() Ib ()
T = (2.3)
I0 () Ib ()
O I() et I0 () sont respectivement les intensits transmises avec et sans chantillon.
Rsultat
Le rsultat obtenu est compar celui donn par le document de rfrence. Les fi-
gures 2.7(a) et 2.7 (b) montrent un cart entre les deux spectres de moins de 8/1000. Le
dispositif rpond bien aux attentes de nos expriences.
100
90
2
80
70
Transmittance (%)
60
Courbe exprimentale

50
Courbe de
rfrence
40
30
20
10
0
400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700
Longueur donde (nm)
(a) Courbes de transmittance exprimentale et de r-

frence.
1
0.9
0.8
0.7
Diffrence (%)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700
Longueur donde (nm)
(b) Diffrences des courbes de transmittance.
F IGURE 2.7 Transmittance spectrale.

2.4.3 Mesures effectues sur des cornes en dehors du milieu

de conservation
Dans ce cas, le filtre est remplac par des cornes non-conformes - cornes mises
lcart lors de la slection des greffons. Le principe du calcul de la transmittance demeure
identique, sauf quil est ncessaire de tenir compte de toutes les interfaces engendres par
le support de la corne. Ce dernier doit remplir certaines exigences dont :
la transparence pour permettre la mesure optique ;
la biocompatibilit du matriau ;
Centrage de la corne par rapport au faisceau incident.
2
Ralisation du support
Dans une boite de ptri, nous avons ralis le support de cornes en PDMS (polydime-
thylsiloxane ((C2 H6 OSi)n ), matriau biocompatible rentrant, frquemment, dans la fabri-
cation des systmes microfluidiques. Le support est de gomtrie permettant un maintien
physique de la corne durant les mesures, et un repositionnement fidlement rptitif sous
le faisceau lumineux. Sa conception est illustre dans la figure 2.8. Il est compos de :
une partie sphrique concave pour que la corne puisse y tre loge ce qui permet
son centrage ;
un mplat. Celui-ci doit permettre la corne de prsenter la surface explorer
durant les mesures.
A-A
PDMS Boite de ptri
A A
F IGURE 2.8 Schma du support.
Cette ralisation est obtenue par moulage dun modle (figure 2.9) conu cet effet
en tenant compte du rayon de courbure moyen des cornes.
Partie
Mplat
sphrique
Systme
de maintien
F IGURE 2.9 Modle servant la ralisation du support.

2
Procdure du moulage
Le PDMS est un lastomre transparent de type silicone. Il est obtenu partir dun
mlange, au rapport de 10 : 1 en volume ou en poids, de DMS (Dimethylsiloxane) et
un agent polymrisant. Aprs dgazage, le mlange est coul dans une boite de ptri
o le modle est pos pour en raliser lempreinte. Dans la figure 2.10, nous montrons
linjection de ce polymre.
F IGURE 2.10 Injection du PDMS dans la boite de ptri.
Aprs polymrisation lair libre pendant 24 heures ou dans un four (65 C)pendant
3h30, nous obtenons aprs dmoulage, le support montr dans la figure 2.11(a). Dans la
figure 2.11(b), on trouve limage dune corne positionne dans le support.
(a) Le support en PDMS. (b) Corne positionne dans

le support.
2 F IGURE 2.11 Vue de dessus du support de cornes.
Mesures et calcul de la transmittance

Procdure de mesure
Avant deffectuer les mesures, la source est mise en marche pendant 30 min environ
pour la stabiliser.
Les mesures sont effectues selon le protocole suivant :
relever de lintensit spectrale transmise de la source I0 () ;
relever de lintensit spectrale transmise par le support de cornes Is () ;
acquisition de dix spectres dune mme corne dans son support It (), de manire
limiter les erreurs ; calcul de lcart type sur lensemble des mesures.
Les diffrentes interfaces intervenant dans le calcul de la transmittance de la corne

sont les interfaces air-corne, corne-support et support-air mentionnes dans la figure
2.12. Dans cette dernire on distingue plusieurs strates dont on calcul leurs intensits
transmises sparment.
I0 I0
Corne
Ic
hC
hs
Is It
(a) Support seul. (b) Corne dans son support.
F IGURE 2.12 Schma reprsentant le principe de la mesure de la transmittance.

Lintensit transmise par le support est donne par la relation :
I() = I0 ()es ().hs (2.4)
Lintensit transmise par la corne et son support est donne par la relation :
It () = I0 ()e(c ().hc +s ().hs ) (2.5)
Avec c et s respectivement les cfficients dabsorption du support et de la corne.

Daprs la figure 2.12(b), Ic () scrit :
2
c ().hc
Ic () = I0 ()e (2.6)
O hc reprsente lpaisseur de la corne. On en dduit la relation :
It () = Ic ()es ().hs (2.7)
Sachant que la transmittance Tc () de la corne sexprime par le rapport Ic ()/I0 (), des
relations prcdentes (2.1), (2.2), (2.3), et (2.4), on en dduit la relation de la transmittance
de la corne
It ()
Tc () = (2.8)
Is ()
Donc, pour son calcul il suffit de mesurer uniquement It () et Is (), valeurs donnes par
le spectromtre.
Nota : lintensit relative au courant dobscurit Ib () est dduite de toutes les valeurs
mesures.
Rsultats
Les rsultats obtenus aprs le calcul de la transmittance de la corne sont les suivants.
Nous distinguons dans la figure 2.13 respectivement le spectre dmission de la source
2.13(a) et la courbe de transmittance de la corne 2.13(b). Dans cette dernire nous ob-
servons un pic dabsorption que nous avons isol. En effet, ce pic savre correspondre au
pic dabsorption du milieu de conservation de la corne quon se doit de corriger.
Nous pouvons donc en dduire que la mesure que nous faisons ne tient pas uniquement
compte de la rponse de la corne, mais galement du milieu de conservation dont elle est
imprgne, qui se trouve lintrieur du tissu cornen. Par consquent, on sest propos
de rincer les cornes dans un milieu de rinage pour extraire le milieu de conservation de
la corne.
(a) Spectre de la source.

2
Pic
(b) Transmittance de la corne.
F IGURE 2.13 Rsultat des mesures de la corne hors milieu.
Elimination du milieu de conservation
Le rinage des cornes nest pas instantan, par consquent lopration dure quelques
fois plusieurs heures. De ce fait, afin de dterminer le temps de rinage ncessaire lex-
traction du milieu, nous avons ralis des mesures par intervalle de temps dune heure.
Il en ressort quil faut un rinage dau moins 4 heures pour que linfluence du milieu
soit nettement rduite. Les figures 2.14 (a), (b) et (c), montrent la diminution du pic
de la courbe de transmittance spectrale de la corne en fonction du temps de rinage.
Lamplitude du pic T , mesure entre le premier coude ( = 600nm) et le minimum
la courbe ( = 562, 95nm), passe de T = 12% (figure 2.14(a)) moins de 4% (fi-
gure 2.14(c)). Toutefois les mesures sur des cornes rinces ne sont pas commodes. En
effet, elle reprsentent deux inconvnients majeurs : dune part, un rinage suprieur 3
heures dune corne nest pas pratique pour le praticien ou la personne qui soccupe des
mesures. Dautre part, nous constatons une translation de la courbe vers le bas (diminution
de la transmittance) ceci est due une opacification de la corne au fil du temps.
(a) Corne rince une heure. 2
(b) Corne rince deux heures.
(c) Corne rince trois heures.
F IGURE 2.14 Estimation du temps ncessaire lextraction du milieu de la corne.

Conclusion
Des mesures et constatations prcdentes, il convient de maintenir les cornes dans

leur milieu de conservation pour effectuer les mesures de transmittance. Ceci nous confronte
linconvnient de linfluence du milieu que nous essayons de relever dans ce qui suit.
2.4.4 Mesures effectues sur des cornes dans le milieu de

conservation
La mthode utilise dans le cas des mesures dans le milieu de conservation est peu
2 diffrente de celle utilise dans le cas des mesures hors milieu, si ce nest que le support
prcdent nest pas adapt aux nouvelles mesures. Lorsque le milieu est ajout, du fait
de la diffrence de densit la corne remonte en surface et rend son positionnement sous
le faisceau lumineux plus dlicat. Ainsi, des mesures ont t effectues pour mettre en
vidence les fluctuations du positionnement.
La figure 2.15, illustre le rsultat de plusieurs mesures (10) de lintensit spectrale de

la corne. Lcart en amplitude est relativement important de lordre de 4, 3%.
265
250 mesure 1
mesure 2
mesure 3
225 mesure 4
mesure 5
200 mesure 6
mesure 7
175 mesure 8
Intensit (u.a)
mesure 9
mesure 10
150
Moyenne
125
100
75
50
25
0
475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800
Longueur donde(nm)
F IGURE 2.15 Spectres des mesures effectues dans le premier support.
Pour corriger ce problme, un nouveau support en PDMS mieux adapt a t mis au

point confrant la corne un positionnement stable dans son milieu.
Ralisation dun nouveau support pour la corne
Nous avons ralis un autre support en PDMS, cette fois, dans des puits de rinage
qui, tant dune part, plus profonds que les boites de ptri, permet de contenir une quantit
suffisante du milieu. Dautre part, il permet de positionner la corne avec prcision sous
le faisceau lumineux et lempche de flotter. La figure 2.16, montre la structure dun tel
support.
Milieu Corne 2
Puit PDMS
(a) Schma de principe. (b) Image du support.
(c) Inclusion de la corne dans le

support.
F IGURE 2.16 Support pour le positionnement de la corne sous le faisceau lumineux.
En coupe transversale, la figure 2.16(a) montre le positionnement, de la corne par

le support en PDMS (Polydimethylsiloxane.). Les figures 2.16(b) et 2.16(c) reprsentent
respectivement, le support vide et le support contenant la corne dans son milieu de
conservation. Cette nouvelle conception a permis une stabilit value dans les rsultats
obtenus.
(u.a)
F IGURE 2.17 Spectres des mesures obtenus laide du nouveau support.
Ces derniers sont illustrs dans la figure 2.17 o lcart mesur est denviron 1% soit,
une amlioration denviron 3%.
Le calcul est plus rigoureux en considrant tous les lments influant sur la transmit-
tance de la corne. De ce fait, dans les calculs, une correction est faite sur leffet du milieu
contenu dans la corne.
Lorsque le support est rempli dune certaine quantit du milieu reprsent par la hau-
teur hm0 sur la figure 2.18(b), et, en introduisant une corne dpaisseur hc , une variation
de la hauteur du liquide de h est induite. La hauteur du milieu devient hm2 reprsente
sur la figure 2.18(c).
I0 I0 I0
h
Milieu I Im 1 hm1 hm2

m0 hm0
hs Corne
hc
Is Im 0 It
(a) Support seul. (b) Milieu dans le support. (c) Corne corne immerge dans le mi-
lieu.
F IGURE 2.18 Schma reprsentant le principe de la mesure de la transmittance.

Pour se faire, trois mesures sont prises :

Une mesure du support vide (figure 2.18(a)).
Une mesure du milieu dans le support (figure 2.18 (b)).
Une mesure de la corne dans le support immerge dans le milieu (figure 2.18(c)).
Lintensit Is transmise par le support dpaisseur hs et de cfficient dabsorption s
est donc,
Is () = I0 ()es ().hs (2.9)

Lintensit Im0 transmise par le milieu dans le support
Is () = I0 ()e(s ().hs +m ().hm0 ) (2.10)

m ()tant le cfficient dabsorption du milieu. Do :
2
Im0 () = Is ()em ().hm0 (2.11)
La mesure It de la corne dans son milieu est,
It () = I0 ()es ().hs em ().hm1 emc ().hmc (2.12)

O,
hmc est la hauteur de la corne contenant le milieu.
mc () est le cfficient dabsorption de la corne et du milieu absorb. Ce cfficient
peut-tre dissoci en deux parties, en loccurrence c ()le cfficient dabsorption intrin-
sque de la corne et m () le cfficient dabsorption du milieu relatif son volume.
Dans une premire approche considrant hm la hauteur du milieu quivalente, nous pou-
vons crire :
hmc .mc () = hc .c () + hm .m () (2.13)

hm1 = hm2 hmc et hm2 = hm0 + h
hm1 = hm0 + h hmc
De lquation 2.12, nous dduisons :
It () = Is ()em ().(hm0 +hhmc +hm ) ec ().hc () (2.14)

La transmittance de la corne est donne par : Tc = ec ().hc
It () = Is () Tc em ().(hm0 +hhmc +hm ) (2.15)

Daprs la relation (2.11), nous avons :
Im0
m = hm1 ln( Is
)
0
La relation (2.15) devient :

h+hm hmc Im0

(1+ ) ln( )
It () = Is () Tc e hm0 Is
(2.16)
Im0
It () = Is () Tc e(1+) ln( Is
)
(2.17)
h+hm hmc
O : = hm0
2
: cfficient exprimental trs infrieur 1.
Nous dduisons la relation de la transmittance de la corne :
k
It () Is ()
Tc = (2.18)
Is () Im0 ()
O : k = 1 +
Conclusion
La transmittance de la corne est une fonction dun cfficient k, trs proche de 1, et

qui dpend des lments exprimentaux.
Comme cest difficile de connatre exactement la valeur de k, nous le faisons varier

par calcul pour liminer le pic dabsorption (leffet du milieu).
Validation exprimentale
A partir de nouvelles mesures effectues sur une corne dans son milieu de conser-
vation. Nous faisons varier le cfficient k afin doptimiser les rsultats pour permettre
llimination totale de leffet du milieu sur la transmittance de la corne (extinction du
pic dabsorption).
La figure 2.19, montre les courbes de variation de la transmittance pour quelques
valeurs de k calcules. La valeur optimale est k = 1, 04. Par consquence, la transmittance
de la corne correspond la courbe ou k = 1, 04.
2.5 Tests sur site 73
100
90
80
70
Transmittance (%)
60
k=1.04
50
40
30
20 k=1.00 k=1.02
10
0
500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800
2
Longueur donde(nm)
F IGURE 2.19 Elimination de leffet du milieu.
2.5 Tests sur site

Aprs la caractrisation du dispositif exprimental et les conditions de travail, en le-
vant toutes les rserves relatives aux paramtres qui influencent la mesure de la transmit-
tance, savoir le calcul thorique, lalignement du systme optique et le positionnement
des cornes.
Les mesures sont ralises sur des cornes non-conformes, au sein de lEFS (Etablis-
sement Franais du sang), selon le protocole que nous avons nonc auparavant. Le but
de ces mesures est de :
corrler le nombre de cellules endothliales et la transmittance des cornes,
dtudier lvolution de la transmittance de la corne en fonction du temps (plu-
sieurs jours).
Aprs chaque srie de mesures les cornes sont remises dans leurs milieux initiaux,
et, sont conserves pour les mesures suivantes.
2.5.1 La transmittance en fonction du nombre de cellules en-

dothliales
Nous savons que le nombre des cellules endothliales prsent dans une corne est li
sa transparence. Une corne contenant plus de cellules endothliales transmet plus de
lumire. Dans la figure 2.20, nous comparons la transmittance de trois cornes contenant
un nombre diffrent de cellules.
100
C1 = 2400 cellules
90 C2 = 2300 cellules
C3 = 1200 cellules
80
70
Transmittance (%)
60
C1
50 C2
40
30 C3
20
10
2 0
500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800
Longueur donde(nm)
F IGURE 2.20 Comparaison entre la transmittance de cornes contenant un nombre dif-

frent de cellules.
Discussions et interprtations
Dans la figure 2.20, sont illustres trois courbes de transmittance correspondant trois
cornes contenant un nombre diffrent de cellules endothliales. Ces trois courbes sont
dcales lune de lautre, dans le sens dcroissant de la transmittance, en fonction du
nombre de cellules quelles contiennent. Le rsultat de la comparaison entre les transmit-
tances de la corne 1, 2 et 3 semble corroborer avec notre hypothse de dpart. En effet,
le nombre de cellules Ci=1,2,3 et les transmittances correspondantes Ti=1,2,3 suivent une
variation cohrente tel que,
C1 iC2 i C3 = T1 iT2 i T3
Les deux premires courbes (ordre dcroissant) sont assez proches vu que le nombre
de cellules C1 et C2 sont peu diffrents, tant dis que lcart avec la troisime courbe
est plus important au mme titre que le nombre C3 par rapport aux autres. Leurs trans-
mittances moyennes est faible de lordre de 44 %, 42 % et 24 % respectivement. Selon
la bibliographie [52] la transmittance des cornes nest pas dans la gamme des cornes
susceptibles dtre greffes, malgr un nombre acceptable de cellules C1 et C2 . Ceci, a
constitu probablement la rserve, objet de leurs dclassement, en rfrence de la contre
indication mdicale.
Cela reste vrai mme aprs plusieurs jours o nous constatons une perte de cellules
dans toutes les cornes.
2.5 Tests sur site 75
2.5.2 Evolution de la transmittance de la corne avec le temps

La dure entre le prlvement des cornes et la greffe peut tre plus au moins longue.
De ce fait, il est important dtudier lvolution des caractristiques des cornes en fonc-
tion du temps. Il est bien connu que les cornes dans leur milieu de transport perdent
environ 3 % de leurs cellules endothliales par jour. Le but est de chercher trouver
une relation entre la transmittance et la diminution du nombre de cellules pour dfinir un
temps limite de conservation dans le milieu de transport (dturgescence). A ce titre, nous
avons effectu des mesures sur les cornes prcdentes pendant plusieurs jours, et nous
avons trac leurs transmittances.
Discussions et interprtations
2
Lvolution de la transmittance des cornes dans le temps a t tudie sur une du-
re de sept jours. Au pralable nous avons eu la confirmation que pendant les 48 heures
de transport les cornes restent stables. Les mesures sont reprises aprs 72 heures (3me
jours). A partir de cette date les mesures sont prises a une intervalle de 48 heures. Les
courbes reprsentes sur la figure 2.21, montrent la dcroissance de la transmittance en
fonction du temps. Nous constatons que la baisse de la transmittance est plus importante
partir du 7me jour, figures 2.21(a) et 2.21(b). Les transmittances moyennes, de quelques
cornes, en fonction du temps sont reprsentes dans la figure 2.21(C). Leurs sens de va-
riation est dcroissant avec une faible pente jusquau 5me jour et une pente relativement
rapide au-del. Nous pouvons dire que la vitesse de dgradation des cornes sacclre
aprs quelques jours de conservation dans le milieu de dturgescence. Il semblerait contra-
dictoire de constater (figure 2.21 (C)) quune corne dote dun nombre rduit de cellules
endothliales (C4 = 960), transmet plus quune corne contenant un nombre de cellules
plus important (C2 = 2300). Ceci nest pas faux, car au cours de nos manipulations nous
avons constat cette anomalie dans le cas de toutes les cornes non-conformes. En effet,
pour cette catgorie de cornes, des fluctuations importantes sont enregistres.
1er Jour
3ime Jour
5ime Jour
7ime Jour
2 (a) Corne contenant 2320 cellules.
1er Jour
3ime Jour
5ime Jour
7ime Jour
(b) Corne contenant 2400 cellules.
(c) Transmittance moyenne en fonction du temps.
F IGURE 2.21 Evolution de la transmittance des cornes en fonction du temps.

2.6 Conclusion 77
2.6 Conclusion
En passant en revue ce chapitre, nous pouvons faire une synthse qui a trait au dispo-
sitif de mesure, ses caractristiques et aux rsultats obtenus. Par rapport au dispositif,
nous avons conu et ralis un premier support de cornes adapt au dispositif qui nous
a permis daborder des mesures prliminaires. Dans la procdure de mesures, le rinage
des cornes est un passage oblig pour liminer leffet du rsidu du milieu restant dans
la corne. Mais ce rinage prsente un inconvnient majeur relatif aux dlais importants
des oprations. Par consquent, nous avons contourn cela en effectuant des mesures sur
des cornes dans leur milieu de conservation. Aussi, nous avons constat des anomalies
induites par les instabilits de positionnement des cornes. Ceci nous a conduit la ra-
lisation dun deuxime support pour palier cet inconvnient. Cette ralisation nous a
permis de rsoudre le problme de positionnement. Il reste liminer leffet du milieu
2
rsiduel. A cet effet, dans nos calculs nous lavons pris en compte, il se traduit par un fac-
teur k qui est optimis, pour chaque corne. Dans les rsultats prsents, contrairement
ceux obtenus par dautres auteurs [52], le pic dabsorption est infiniment rduit, do une
mesure plus rigoureuse est obtenue.
Une relation formelle entre le nombre de cellules endothliales et la transmittance nest
pas encore tablie, nanmoins nous avons mis en vidence une corrlation troite entre
ces deux paramtres. Malgr une tude exhaustive tant quantitative que qualitative, il nen
demeure pas moins que certains points restent lucider. Cette constatation est sine qua
non aux travaux mens sur des cornes conformes afin de mieux cerner la relation trans-
mittance/nombre de cellules. Chose que nous navons pas obtenue en vertu de la rgle-
mentation en vigueur. Au demeurant, des cornes dorigine animales peuvent promouvoir
ce travail.
Sommaire Chapitre
3.1 tat de lart
3.2 Approche conceptuelle
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
Ralisation de microcapteurs . . .
Caractrisation des capteurs
Etude des capteurs microsystmes
Intgration des capteurs . . .
Conclusion
3
Microcapteurs pour la dtection de
bactries
U
ne fois le prlvement de la corne effectu, pour une ventuelle greffe, celle-
ci est conserve dans un milieu de conservation. Dans le but de prvoir tout
risque de contamination bactriologique, la corne est contrle quotidienne-
ment par une mesure de son pH par colorimtrie. La variation de pH, traduit
une infection bactrienne et induit un virage de la couleur du milieu du rouge au jaune
ou conduit une turbidit. Notre travail consiste dvelopper un capteur de pH potentio-
mtrique de taille micromtrique afin de pouvoir suivre la variation de la concentration
en protons, localement et en continu. Loriginalit de notre dmarche est de proposer un
pH-mtre bas sur lutilisation dun polymre en guise de transducteur prsentant une r-
ponse linaire du pH en fonction du potentiel variant entre 3 et 11 units. Le capteur de
pH repose sur un revtement dune surface mtallique par lectropolymrisation de mo-
nomres la surface dune lectrode. Les polymres lectrodposs permettent la mesure
du pH via les groupements amines primaires prsents qui peuvent tre protons. Cest
la variation de la densit de charge la surface du polymre qui permet la transduction
du signal chimique en signal lectrique. Ce microcapteur potentiomtrique, entirement
solide, offre la possibilit de mesurer des pH ou un gradient de pH dans des applications
dont le suivi est primordial.
3.1 tat de lart
3.1.1 Introduction
Un capteur est un dispositif lectronique servant transformer une grandeur physique,
chimique ou biologique, appele mesurande, en une autre grandeur (souvent un signal
lectrique) exploitable. Il comprend un lment transducteur qui fournit une grandeur, le
plus souvent lectrique, constituant le signal de sortie. Le capteur de pH est un capteur
79
80 Microcapteurs pour la dtection de bactries
chimique puisquil traduit la concentration dune espce en solution, en loccurrence la

concentration des ions H + .
On caractrise un capteur selon plusieurs critres dont les plus courants sont : la gran-
deur physique mesure, ltendue de mesure, la reproductibilit , la sensibilit , la prci-
sion, la linarit et la rsolution (figure 3.1).
Signal
3 Reproductibilit
Pente = Sensibilit
Limite de dtection Grandeur mesurer
Dynamique Saturation
F IGURE 3.1 Les critres de qualit dun capteur chimique.
3.1.2 Dfinition du pH
Le pH, qui varie de 0 14 en solution aqueuse, traduit la concentration des protons
en solution. En 1909 le biochimiste Danois Soren Sorensen a dvelopp lchelle des pH
(figure 3.2) et introduit la dfinition du pH comme loppos du logarithme dcimal de
[H + ] :
pH = log([H + ]) (3.1)
Neutre
Acidit Basicit
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
F IGURE 3.2 chelle du pH.

.
En ralit, le comportement des ions en solution ne dpend pas de leur concentration

mais de leur activit. Dans le cas des solutions trs dilues (infrieur 0, 001 M) on
peut ngliger la diffrence entre la concentration et lactivit. Donc, la dfinition la plus
rigoureuse est :
3.1 tat de lart 81
pH = log([aH + ]) (3.2)
qui est parfois appel le pH thermodynamique. En fait, tous les pH-mtres mesurent la
valeur thermodynamique du pH, comme prsente dans lquation de Nernst.
Lquation de Nernst
Elle dcrit la diffrence de potentiel, entre une lectrode, dite de travail, immerge
dans une solution contenant un couple redox ox/red et une lectrode dite de rfrence,
en fonction des concentrations des ions qui participent la raction.
0 RT aox
Eox/red = Eox/red + ln( ) (3.3)
nF ared 3
E 0 : le potentiel standard de la raction (mesur dans les conditions standards) ;
aox et ared : les activits chimiques de loxydant et du rducteur ;
R : la constante des gaz parfaits (8, 31J/mol/ k) ;
T : la temprature absolue mesure en Kelvin ;
F : le nombre de Faraday (96496J/V ) ;
n : le nombre dlectrons changs.
Pour mesurer une tension entre une lectrode de travail et une lectrode de rfrence,
nous utilisons un voltmtre haute impdance dentre (principe du pont wheatston) qui
garantit quaucun courant ne passe travers le circuit et donc quaucune raction aux
lectrodes na lieu.
Llectrode de travail peut intervenir directement dans la raction redox si elle est
constitue dun mtal M oxydable. La demi-quation rdox scrit dans ce cas :
+ ,s
Mn + ne M
Si llectrode est en mtal pur, cest--dire, si elle nest pas constitue dun alliage,
alors lactivit de M solide est unitaire. Lquation de Nernst pour ce type de raction
redox est alors :
0 RT
Eox/red = EM n+ /M + ln(asM n+ )
nF
Influence du pH
Les ions H + en solution aqueuse sont des oxydants. Ils peuvent tre rduits directe-
ment en dihydrogne H2 , ou participer la rduction dautres espces pour permettre la
formation de la molcule deau. Dans ce cas lquation de Nernst permet de quantifier
trs aisment linfluence du pH sur le potentiel dquilibre du systme.
Dans les conditions standards (25 C, P = 1 bar) et pour n = 1, la relation de Nernst

scrit :
+
0 [H ]
Eox/red = EM n+ /M + 0.059 log (3.4)
[red]
do

0
Eox/red = EM n+ /M + 0.059 log(pH) (3.5)
avec

0 0
EM n+ /M = EM n+ /M 0.059 log([red]) (3.6)
3 Lunit de E est le Volt (V ).
3.1.3 La mesure du pH
Le pH peut tre mesur par diffrentes mthodes, dont deux sont largement utilises.
La premire, la plus simple, est assez prcise utilise le papier pH. La deuxime, plus on-
reuse mais plus prcise, qui repose sur une mesure potentiomtrique, utilise les lectrodes
de pH en verre et les pH-mtres.
Les mthodes de dtections communes

Gnralement, les mthodes de mesure du pH peuvent tre classes en quatre cat-
gories : les indicateurs ractifs colors, les bandes de pH (papier pH), les mthodes
lectrodes mtalliques (lectrode dhydrogne, lectrode la quinhydrone et lectrode
dantimoine) et les mthodes dlectrodes de verre.
Les indicateurs colors tel que le rouge phnol ou lorange mthyle, sont des composs
organiques qui changent de conformation avec lactivit des ions dhydrogne, entranant
un changement du maximum dabsorbance du compos et par consquent un changement
de couleur.
Les bandes de pH sont des bandes de papier sur lesquelles sont fixs des indicateurs.
Immerges dans le liquide dessai, elles montrent une couleur particulire correspondant
au pH de la solution. Une couleur standard est compare pour donner la valeur du pH
grossire. Cette mthode est simple mais peu prcise : une concentration leve en sel, la
temprature ou des substances organiques dans le liquide dessai induisent des erreurs.
Electrode lhydrogne est le moyen de rfrence pour toutes les mthodes de mesure de
pH. Lactivit des ions hydrogne est dtermine par mesures potentiomtriques laide
dune lectrode standard hydrogne et dune lectrode de rfrence. Llectrode stan-
dard hydrogne se compose dune lectrode en platine dans une solution dhydrogne
3.1 tat de lart 83
1M . Cependant, sa mise en uvre est relativement complexe, peu pratique et dangereuse.
Electrode la quinhydrone cest une mthode potentiomtrique pour la dtermination

du pH. Elle est utilise avant lintroduction de llectrode de verre. La quinhydrone est un
mlange quimolaire cristallis de benzoquinone (ou quinone) et dhydroquinone. Quand
on le dissout dans leau, la quinhydrone forme un couple oxydant/rducteur dpendant
du pH. Le potentiel redox de lquilibre rsultant est proportionnel au pH de la solution.
Une lectrode de platine est utilise pour mesurer ce potentiel redox. Llectrode quin-
hydrone est souvent utilise pour vrifier le bon fonctionnement dun systme de mesure
redox ou pour quilibrer dautre lectrode de rfrence[64]. Cette mthode est peu utilise
cause de sa mauvaise reproductibilit.
Electrode dantimoine est similaire llectrode la quinhydrone, les rsultats obtenus

avec cette mthode sont peu reproductibles ce qui limite son champ dapplication [65].
3
Electrode de verre, cause des difficults rencontres
avec llectrode dhydrogne et les lectrodes m-
talliques mentionnes ci-dessus, llectrode de verre
est utilise couramment et considre comme la m-
thode de rfrence de mesure du pH, en raison de sa
rponse quasi-Nernstienne, de sa reproductibilit et
de sa dure de vie. Elle est constitue dune mem-
brane de verre sous forme de bulbe qui permet le Rfrence au
passage des ions H + slectivement, et une solution calmol ou
Ag/AgCl
Jonction
concentre de HCl lintrieur en contact avec une
lectrode de rfrence (figure 3.3). Son principe de Electrode au
calmol ou
Solution sature
en KCl
fonctionnement repose sur la diffrence de concen- Ag/AgCl Verre spcifique
+
tration en ions hydroniums H3 O existant de part
et dautre de la membrane de verre, qui gnre un F IGURE 3.3 Schma dune lec-
potentiel lectrique, appel potentiel de membrane. trode de verre.
Celui-ci est proportionnel au pH de la solution aqueuse dans laquelle llectrode est plon-
ge. Les mesures du pH de solutions aqueuses laide dune lectrode de verre ncessitent
au pralable une procdure de caractrisation avec des solutions tampons. Cependant,
celle-ci est difficile miniaturiser et ne peut tre employe dans des applications in vivo
en raison de sa nature fragile.
Les capteurs de pH base de fibres optiques

Leurs principes reposent sur des molcules dont les proprits spectrales dpendant
du pH : on mesure alors les changements spectraux. En voici quelques exemples :
Une sonde de pH labore partir de fibres optiques recouvertes de bleu de mthy-
lne recueille les ondes vanescentes[66]. La rponse obtenue est linaire de pH 3
pH 9.
Un indicateur color fluorescent immobilis dans une matrice hydrogel est poly-
mris sur la fibre optique[67]. Les sondes fonctionnent dans la gamme de pH 6-8
et possdent un temps de rponse de 500 secondes.
Un colorant, le mrocyanine, dpos sur une fibre polie montre une variation de son
absorption en fonction du pH et ainsi, un changement de son indice de rfraction
une longueur donde donne[68]. En outre la gamme dynamique de la sonde est
fonction de lpaisseur du film du colorant dpos. La rponse obtenue est linaire
dans la gamme de 11, 5 13.
Mesure du pH par variation de masse

Une sonde de pH construite partir dun hydrogel sensible au pH est couple une
sonde dont la frquence de rsonance correspond la charge de masse applique [69]. Le
3 changement moyen de la frquence de rsonance est de 506Hz/pH pour une chelle de
4, 4 8, 5, et une rsolution de 0.02 unit de pH.
Les ISFETs
Un dveloppement relativement rcent dans la mesure de pH est lintroduction de la
technologie des transistors effet de champ (ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transis-
tor.)) comme alternative llectrode de verre puisquils sont raliss avec les technolo-
gies silicum, permettant la miniaturisation du capteur. De plus, ils peuvent tre raliss
partir de matriaux biocompatibles. Les plus courant pour les applications biomdicales
comportent une membrane en oxyde de silicium recouverte de nitrure de silicium (figure
3.4).
Oxyde de Oxyde de
Si3N4 platine
passivation silicium
F IGURE 3.4 Schma dun ISFET (reproduction de[70]).
Pour une surface active de lordre de la centaine de micromtre carr, ces capteurs
fournissent une rponse prsentant une sensibilit comprise entre 45 et 55mV /pH [70,
71]. Certains lutilisent galement comme transducteur les oxydes de mtaux de transi-
tion.
3.1 tat de lart 85
Les oxydes de mtaux

Les oxydes des mtaux sont employs en tant que transducteur pour dvelopper des
lectrodes de pH. Par exemple, nous pouvons citer les oxydes de platine (Pt/PtO2 ), de
plomb (Pb/PbO2 ), dantimoine (Sb/Sb2 O3 ), diridium (Ir/IrO2 ), de ruthnium (Ru/RuO2 )
et des bronzes (W/W2 O3 ). Les deux derniers semblent les plus appropris pour tre utili-
ss en tant que transducteur puisquils permettent dobtenir une rponse quasi-Nernstienne
[72]. Cependant, ils savrent toxiques.
Les Capteurs imageurs de pH

Un capteur dimagerie de pH bas sur les caractristiques du courant photolectriques
dans les semi-condcuteurs (silicium) est utilis pour lanalyse de la surface des dentines
caries extrait des dents humaines [73]. La distribution de lacide ou de la base sur la 3
surface de dentine a t dtecte comme une valeur de pH et considre comme une image
de pH. Le capteur fonctionne comme un rseau de plusieurs lments de dtection, qui
est bas sur un capteur potentiomtrique lumire adressable, compos dune structure
de Si3 N4 /SiO2 /Si. La surface sensible au proton est en contact avec un lectrolyte, un
faisceau de lumire est projet sur le ct du silicium avec un potentiel de polarisation
entre llectrolyte et la face de silicium [74]. Les rsolutions spatiales et de pH du capteur
sont respectivement 100 m et 0.1 pH.
Les Capteurs de pH bass sur un cantilever nano structur

Un capteur de pH ultra sensible a t ralis laide dun microcantilever [75]. Le
microcantilever est fabriqu partir de wafers de silicium sur isolant (SOI), ensuite un
polymre compos de poly (acide methacrylique) (PMAA) et poly (thylne glycol) di-
mthacrylate est rticul sur le microcantilever. Le changement du pH au dessus de pKa
du PMAA provoque la dilatation du polymre, cela induit un stress rversible la surface
du cantilever, il en rsulte un pliement du cantilever. La sensibilit obtenue est de 5.105
pH pour une dviation de courbure de 1nm.
Utilisation des polymres

Plusieurs recherches ont permis dtudier les polymres sensibles au pH, y compris
polypyrrole, polyaniline, etc. [76, 77], dans le but de dvelopper des capteurs de pH tout
solide. La polyaniline montre une rponse potentiomtrique linaire en fonction du pH
mais les rsultats diffrents, et aucune explication sur le mcanisme de transduction nest
encore avance. Ainsi, nous pouvons trouver dans la littrature des rponses linaires de
pH 1 7 avec une sensibilit de 62 mV/pH sur des lectrodes de platine de 1 mm de
diamtre [78] il y a aussi une rponse de 86 mV/pH de pH 2 9 sur des lectrodes
micromtriques en tflon [79].
Les rcents travaux de Lakard et al. [80]ont montr une rponse linaire pour les lec-
trodes de platine (dune surface de 0, 785mm2 ) modifies par des films polymres de
polythylnediamine, de polyaniline et de polypyrole. Les sensibilits obtenues sont res-

pectivement de 46 mV/pH, 52 mV/pH et 48 mV/pH pour des pH de 2 10 [80]. Le
mcanisme de rponse au pH peut tre reprsent par la formule suivante :
NH2 + H+ NH+
3
N H3+ + OH N H2 + H2 O
Les lectrodes de rfrence

Llectrode de rfrence par excellence est llectrode standard hydrogne (SHE
(Standard Hydrogen Electrode.)). Son inconvnient majeur est sa mise en uvre qui
savre complique. Il existe aussi llectrode sature au calomel qui est compose dun
3 fil de mercure recouvert de chlorure de mercure plong dans une solution sature de chlo-
rure de potassium (KCl). Du fait de sa toxicit, elle est de plus en plus remplace par
llectrode au chlorure d argent (SRE (Silver Reference Electrode.) ). Cette dernire
repose sur le mme principe que la prcdente, le mercure tant remplac par largent.
Toutes ces lectrodes de rfrence ont un potentiel constant et connu quel que soit le pH
de la solution dans laquelle elles sont plonges. Lutilisation de pseudo lectrodes de rf-
rence est une alternative. Constitues simplement dun fil de mtal (platine ou argent par
exemple), elles ont lavantage de ne pas ncessiter de solution sature et de possder une
faible impdance. Cependant, le potentiel nest pas connu et dpend de la solution dans
laquelle elles sont immerges.
Conclusion
Il y a un intrt considrable utiliser des polymres comme transducteurs puisquils
ont comme avantages leur faible cot, facile synthtiser en couches minces. Ces carac-
tristiques leurs confrent un grand champ dapplication. De plus, la biocompatibilit de
certains polymres offre la possibilit de les utiliser dans le domaine de la science du vi-
vant. De plus notre savoir faire dans ce domaine tait un prcurseur de notre engagement
dans cette voie.
3.2 Approche conceptuelle 87
3.2 Approche conceptuelle

Le dispositif conu sur lequel porte notre travail sapparente un Lab On Chip
(figure 3.5). Ce dernier rempli plusieurs fonctions :
contenir le milieu de conservation dans lequel est plong le greffon ;
jouer le rle de support transparent permettant deffectuer les mesures optiques ;
mesurer localement le pH grce linclusion de fils micromtriques et de canaux
permettant un renouvellement continu du milieu de conservation et le positionne-
ment de la corne par fluidique.
Lensemble doit tre biocompatible, strilisable et rutilisable.
(a) Vue gnrale.
(b) Vue en coupe.
F IGURE 3.5 Schma de principe de la mesure du pH de la corne.
Ce dispositif rpond particulirement au besoin des mesures de pH avec une prcision

satisfaisante. En effet, le contrle bactriologique du milieu est ralis par observation de
la variation de la couleur du rouge phnol. Le capteur que nous avons dvelopp apporte
une mesure sur une plus grande gamme de pH que lindicateur color (zone de virage
entre pH 6, 6 et 8, 4). De plus, la disposition de microcapteurs de pH rpartis autour de la
corne permet une mesure locale. Il est alors possible dobtenir un gradient de pH et de
dtecter prcocement toute infection.
3.3 Ralisation de microcapteurs chimiques de pH

3.3.1 Le principe du capteur
Description
3 Le capteur que nous allons raliser est de type potentiomtrique et ncessite deux
lectrodes pour fonctionner. La premire, llectrode de mesure, est en platine recouvert
par llectrodposition dun film mince de polymre faisant office de transducteur. Luti-
lisation du platine se justifie par le fait quil sagit dun mtal noble et qui possde un
excellent tat de surface. La deuxime, llectrode de rfrence, quant elle, est en argent
complex en surface par du chlorure dargent. Cette complexation offre une stabilit sa-
tisfaisante et meilleure que celle obtenue avec une simple lectrode dargent. De plus, son
laboration est relativement simple mettre en uvre puisquil suffit de plonger largent
dans une solution de chlorure de fer (FeCl3 ) pendant 50 s.
Grce un systme disolation dont nous parlerons ultrieurement, seules les extr-
mits des capteurs, cest--dire le chlorure dargent et le polymre lectrodpos, entrent
en contact avec la solution dont on souhaite dterminer le pH.
Principe de fonctionnement
Le polymre lectrodpos sur le platine, qui contient des fonctions amines pouvant
tre protones, est sensible aux changements de la concentration des protons H + . Le po-
lymre joue le rle de transducteur. Le principe de fonctionnement repose sur la variation
locale de la densit des charges au voisinage de llectrode modifie par le polymre qui
engendre un potentiel proportionnel au pH du milieu tudi (figure 3.6). Cette valeur de
diffrence de potentiel ddp (la diffrence de potentiel entre llectrode de rfrence et
llectrode de mesure) est mesure diffrentes valeurs de pH et constitue la caractrisa-
tion du capteur. Une rgression linaire permet dobtenir la relation :
E = A pH + B (3.7)
O A et B dpend du polymre dpos sur llectrode de platine.

A : la sensibilit du capteur ;
B : le potentiel standard de la raction.
Cette quation est calque sur lquation de Nernst dfini auparavant.
3.3 Ralisation de microcapteurs . . . 89
Polymre lectrodpos
Platine
H+
H+
H+
ddp
Argent Ag/AgCl
F IGURE 3.6 Principe de la mesure potentiomtrique.
3
3.3.2 Les polymres tudis
Nous avons tendu notre tude trois polymres dans le but de choisir parmi eux celui
qui donne la meilleure sensibilit.
Chacun des polymres est prpar par oxydation lectrochimique du monomre et

donne lieu la formation dun film, qui peut tre conducteur lectronique ou non, la sur-
face de llectrode de platine. Nous parlons galement dlectropolymrisation. Loxyda-
tion anodique des monomres lectroactifs est suivie par voltampromtrie cyclique, mais
peut tre ralise plus simplement par chronoampromtrie au-del du potentiel doxyda-
tion anodique des composs amins. Loxydation de la molcule du monomre est carac-
trise par un pic de courant faradique sur la courbe de la voltampromtrie cyclique.
Les monomres utiliss sont la glycine, lthylnediamine et laniline. Ils ont tous la
particularit de contenir un groupement amine primaire permettant leur protonation (mi-
gration du H + sur le doublet de lazote) ncessaire la mesure du pH. Les polymres qui
rsultent de leur oxydation anodique donnent des rponses aux variations de pH. De plus
ils sont fortement ancrs la surface de llectrode lors de llectropolymrisation [76].
Ils sont bon march, faciles lectrosynthtiser et biocompatibles.
Lthylnediamine (EDA)
Lthylnediamine est un solvant organique ainsi quune diamine primaire de formule
chimique C2 H8 N2 . Sa formule semi dveloppe est H2 NCH2 CH2 NH2 . Cest un sol-
vant non aqueux, irritant et difficile manipuler ; il doit tre manipul en bote gants
sous atmosphre contrle dargon. En effet, il ne doit pas tre pollu par la vapeur deau
et loxygne contenu dans lair ambiant car cela peut crer des ractions concurrentes
indsirables lors de loxydation anodique. Llectropolymrisation de lEDA, en milieu
anhydre, aboutit la formation de polythylnimine linaire (note PEI-L (Polythyl-

neimine Linaire.) ). Cest donc la PEI-L qui se retrouve dpose au niveau de llectrode
en platine.
Laniline
Connue galement comme phnylamine ou aminobenzne. Laniline est un compos
organique renfermant une fonction amine primaire, aromatique (figure 3.7). Elle a pour
formule : C6 H5 NH2 . Cest un liquide incolore, brunissant sous laction de lair et de la
lumire, lodeur trs dsagrable ; peu soluble dans leau.
3 NH2
F IGURE 3.7 Molcule de laniline.
Llectropolymrisation de laniline en polyaniline aboutit un polymre conducteur

lectronique, stable dans lair et insoluble dans la plupart des solvants organiques [81].
La Glycine
Il sagit du plus simple des acides amins, sa formule chimique est HO2 CCH2 NH2 . Il
contient la fois une fonction acide carboxylique et une fonction amine (figure 3.8). Il
est aussi ampholyte (peut se comporter comme un acide ou comme une base). Cet acide
amin peut tre lectropolymris en milieu aqueux en polyglycine.
NH2
H CH
COOH
F IGURE 3.8 Molcule de la glycine.

3.3.3 Electrodposition des polymres sur le platine

Les dpts de polymres sur le platine, quel que soit le support, ont t raliss par
voltampromtrie cyclique.
Les paramtres de llectrodposition, diffrents pour
chaque polymre, sont ajustables via le logiciel de pilo-
tage utilis. Ainsi, il est indispensable de fixer la plage de
balayage en potentiel, la vitesse de balayage et le nombre
de cycles effectus pour ces lectrodpositions.
Les lectrodpositions sont en gnral effectues dans
une cellule lectrochimique avec un montage tel quen fi-
gure 3.9. Nous pouvons y voir llectrode de rfrence en
argent (en haut), la contre-lectrode en platine ( droite)
et gauche llectrode de travail qui sera modifie. 3
Le principe du montage reste le mme quel que soit
le support (microsystme ou fils inclus dans un milieu) et
quel que soit le polymre.
F IGURE 3.9 Montage de
voltampromtrie cyclique.
Electrodposition de lthylnediamine
Nous avons ralis nos dpts de PEI-L par voltampromtrie cyclique, au contraire
de la glycine et laniline, dans un milieu hermtique afin dviter toute pollution provenant
de lair (oxygne et eau) qui peuvent entraner des ractions concurrentes. Les paramtres
de dpt sont : vitesse de balayage : 20mV /s, potentiel variant entre 0 et 5 V/SRE (Silver
Reference Electrode ou lectrode de rfrence en argent), sur 7 cycles. Le sel du fond
utilis est du LiTFSi.
5.0x10 - 4
scan 1
4.0x10 - 4 scan 2
scan 3
scan 4
3.0x10 - 4 scan 5
I (A)
scan 6
scan 7
2.0x10 - 4
1.0x10 - 4
0.0
0 1 2 3 4 5
E / SRE (V)
F IGURE 3.10 Voltamprogramme dune solution dEDA.
Sur le voltamprogramme (figure 3.10), nous constatons que le pic doxydation de

lEDA est +2, 6V /SRE lors du premier balayage. Lintensit anodique chute fortement
lors des balayages suivants, ceci traduit le phnomne de passivation de llectrode par
le dpt isolant du polymre. Ce phnomne est caractristique de la formation dun film
polymrique non conducteur.
Electrodposition de laniline
Le dpt de polyaniline par voltampromtrie cyclique a t ralis 20mV /s entre
0 et 1, 9V /SRE sur 3 cycles.
Lavantage pratique du dpt de la polyaniline par rapport aux dpts de polygly-
cine ou de PEI-L est son aspect vert-noir visible lil nu. Pour llectrodposition, 2M
dacide sulfurique (H2 SO4 ) sont ajouts la solution de laniline (0, 5M ).
3 4,0x10 - 4 scan 1
scan 2
scan 3
3,0x10- 4
-4
2,0x10
I ( A)
1,0x10- 4
0,0
- 1,0x10- 4
- 2,0x10- 4
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

E / SRE(V)
F IGURE 3.11 Voltamprogramme dune solution daniline.
Sur le voltamprogramme (figure 3.11), nous pouvons voir un pic doxydation

+1, 1V /SRE lors du premier cycle. Ce pic, caractristique de loxydation du groupement
amine de laniline, est galement visible lors des cycles suivants. Il indique que loxyda-
tion du groupement amine de laniline et des premiers oligomres de la polyaniline (note
PANI) se poursuit, mais aussi que la polyaniline est un polymre conducteur.
Electrodposition de la glycine
Pour le dpt de polyglycine, un sel de fond a t ajout la solution de glycine
utilise (0, 5 M ) afin dassurer une conductivit ionique entre les lectrodes. Il sagit ici
de ttrafluoroborate de sodium (NaBF4 ) ; 0, 3 grammes ont t ajouts dans 100 mL. Les
courbes de voltampromtrie cyclique obtenues lors de llectrodposition de la glycine
sont reprsentes sur la figure 3.12 (la vitesse de balayage est de 10 mV /s pendant 10
cycles entre 1, 4 et 1, 9 V /SRE).
Sur le voltamprogramme nous observons, lors du premier balayage, un pic doxyda-

tion +1, 75 V /SRE. Celui-ci tmoigne de loxydation lectrochimique de la glycine.
Nous pouvons noter, comme pour lEDA, le phnomne de passivation de llectrode par
le dpt de polymre isolant, caractristique de la formation dun film de polymre non
conducteur ; en effet, lintensit anodique chute fortement. La surface de llectrode est
recouverte dune couche mince de polymre essentiellement lors des premiers balayages
puisque sa croissance est lie au passage du courant.
-4
2,0x10
scan 1
scan 2
-4 scan 3
1,5x10
scan 4
scan 5
scan 6 3
I (A)
-4 scan 7
1,0x10 scan 8
scan 9
scan 10
-5
5,0x10
0,0
1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9

E / SRE (V)
F IGURE 3.12 Voltamprogramme dune solution de glycine.
Caractrisation des dpts

La caractrisation des dpts de polymres a t ralise par microscope force ato-
mique (AFM) en mode contact. Dans un premier temps, nous avons ralis une topo-
graphie de la surface de llectrode de platine avant les dpts lectrochimiques (figure
3.13(a)). La surface apparat homogne et uniforme avec une faible rugosit de surface et
nodules.
La surface de llectrode modifie par oxydation anodique de lEDA (figure 3.13(b))
prsente une surface totalement diffrente de celle du platine vierge. Les nodules mtal-
liques ont compltement disparus et limage prsente des stries dues au phnomne de
stick-slipping (coller-glisser) de la pointe AFM englue dans la matrice polymre.
En revanche, le dpt de la PANI est tellement important quil modifie radicalement
ltat de surface du platine et prsente une topographie qui nest plus aussi homogne
que dans le cas des dpts dus loxydation anodique de lEDA et de la glycine (figure
3.13(c)).
En ce qui concerne les lectrodes lectromodifies par loxydation anodique de la
glycine (figure 3.13(d)), nous pouvons remarquer que les nodules de platine ne sont pas
aussi contrasts que dans le cas de la surface du platine vierge. Nous remarquons aussi
que le dpt est moins pais que dans le cas de lEDA mais existe et assure une enveloppe
des billes de platine.
(a) Surface de Pt vierge. (b) Platine modifie par lEDA.
(c) Platine modifie par laniline. (d) Platine modifie par la glycine.
F IGURE 3.13 Images AFM en mode contact sur platine 1 1m2 .
3.4 Caractrisation des capteurs

Cette partie concerne la caractrisation des capteurs, cest--dire la rponse que nous
obtenons en fonction du pH. Lobjectif est dobtenir une rponse linaire du capteur sur
une gamme de pH la plus tendue possible.
3.4 Caractrisation des capteurs 95
3.4.1 Etude des capteurs filaires
Nous avons tout dabord commenc par ltude du comportement des polymres sur
des lectrodes filaires de taille millimtrique, afin de sassurer que nos rsultats taient
cohrents et conformes ceux de la littrature. Ensuite, nous avons tudi le comporte-
ment des lectrodes filaires de taille micromtrique en vue de les intgrer dans le support
des cornes.
3
Etude des lectrodes de taille millimtriques
Les lectrodes millimtriques de 2mm de diamtre sont constitues dun fil de platine
pig dans du verre(figure 3.14).
Llectrodposition seffectue au niveau de lex-

trmit en platine de ces lectrodes, pralablement
polies. La caractrisation de ces lectrodes consis-
tait plonger successivement chacune dentre elles
avec le fil dargent complex par FeCl3 (lectrode
de rfrence) dans diffrentes solutions de pH connu.
La diffrence de potentiel entre les lectrodes mil-
limtriques (lectrodes de mesures) et llectrode
de rfrence est mesure laide dun pH-mtre
en mode voltmtre de haute impdance dentre.
Nous obtenons ainsi des points exprimentaux (pH,
potentiel). En effectuant des rgressions linaires, F IGURE 3.14 Electrode millim-
nous pouvons calculer les diffrents coefficients des trique en verre.
droites reprsentant la diffrence de potentiel en
fonction du pH (E = f (pH)) ainsi que les coefficients de corrlation linaire. Les coeffi-
cients directeurs correspondent la sensibilit des capteurs de pH raliss. Cette mthode
est celle utilise pour toutes les caractrisations effectues sur lensemble des capteurs
raliss et tests.
Cas de la PEI-L
Les rsultats obtenus pour la caractrisation des lectrodes millimtrique modifies

par loxydation anodique de lthylnediamine sont les suivants (figure 3.15) :
250
ddp = - 46 pH + 363
200 r = - 0,989
150
100
50
ddp(mV)
0
-50
-100
-150
-200
2 4 6 8 10 12
pH
3
F IGURE 3.15 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par lEDA.
La sensibilit observe ici est denviron 46 mV/pH, celle-ci est comparable aux r-
sultats obtenus lors de prcdentes tudes au laboratoire [80].
Cas de laniline
Les rsultats obtenus pour la caractrisation des lectrodes millimtriques recouvertes

par la PANI par voie lectrochimique sont les suivants (figure 3.16). Les rsultats pris
en compte ci-dessous pour la caractrisation ne vont que de pH 3 9 car, conformment
aux rsultats que lon peut trouver dans la bibliographie, la linarit pour laniline ne
sobserve que jusqu pH 8 ou 9 [78].
150 ddp = - 65 pH + 357

r = - 0,975
100
50
0
ddp(mV)
-50
-100
-150
-200
-250
3 4 5 6 7 8 9
pH
F IGURE 3.16 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par laniline.

Cas de la glycine
Les rsultats obtenus pour la caractrisation des lectrodes millimtriques recouvertes

par la polyglycine par voie lectrochimique sont les suivants (figure 3.17).
La sensibilit obtenue est quasi Nernstienne puisque proche de 59 mV/pH. Le coef-
ficient de corrlation obtenu montre que la relation est linaire.
ddp = -54 pH + 730

600
r = - 0,998
500
400
3
ddp (mV)
300
200
100
2 4 6 8 10 12
pH
F IGURE 3.17 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par la glycine.
Conclusion
Les rsultats obtenus sur des lectrodes millimtriques montrent des relations li-
naires du pH en fonction du (ddp) dans une gamme qui stend de 3 11pH, dpendant
du type de polymre. Les droites linaires obtenues dans les trois cas tudis montrent
que le cas de la glycine se distingue par un coefficient de corrlation de 0.998. Aussi,
nous constatons que la sensibilit obtenue dans le cas de la glycine est quasi Nerns-
tienne, tandis que les sensibilits obtenues sur laniline et le PEI-L sont conformes la
bibliographie. Dans la partie qui suit, nous allons tudier des lectrodes de taille micro-
mtriques.
tude de fils micromtriques pigs dans des milieux dinclusion
Cette inclusion de fils dans un solide dilectrique facilement ralisable avait pour ob-
jectif de nous rapprocher au maximum du prototype final puisque des fils de platine y
seront inclus. Dans un premier temps, nous parlerons des essais raliss avec de la rsine
en milieu dinclusion, puis, du verre dans un second temps.
Fils de platine et d argent pigs dans de la rsine
Nous avons effectu des essais en incluant des fils mtalliques (platine et argent) dans
une rsine (e 501). Les fils de Pt et dAg sont, dun ct, relis aux appareils de mesures
et, de lautre ct, plongs dans une solution aprs avoir t polis (Pt) et complexs (Ag
par AgCl) (figure 3.18).
F IGURE 3.18 Fils micromtriques de platine et dargent pris dans de la rsine.
Les premires caractrisations ont donn de bons rsultats, mais au bout de cinq carac-
trisations, il nous tait impossible dobtenir des valeurs stables. Nous pensons que cette
rsine ragit chimiquement, empchant ainsi davoir des rsultats rptitifs sur de longues
priodes. Par consquent, nous avons opt pour un changement du milieu dinclusion des
lectrodes.
Fils de platine et dargent pigs dans du verre
Nous avons utilis le verre comme support de nos fils puisque celui-ci est couramment
utilis dans les lectrodes traditionnelles et pratiquement inertes. Nous avons donc fabri-
qu de telles lectrodes (figure 3.19) avec un fil de platine pig dans un tube en verre ; le
fil de platine utilis est de 76m de diamtre. Nous navons pas pu y inclure de fil dar-
gent car celui-ci possde un point de fusion trop bas pour rsister la chaleur de la flamme
ncessaire au faonnage de ces lectrodes. La rfrence utilise lors de nos caractrisa-
tions tait donc un fil dargent extrieur de 2mm de diamtre llectrode complexe en
surface par du FeCl3 .
F IGURE 3.19 lectrode en verre fabrique au laboratoire.
3
A chaque lectrodposition, une srie de dix mesures ont t effectues, afin dvaluer
la reproductibilit des mesures.
Cas de la PEI-L
Le potentiostat utilis et ceux disponibles au laboratoire de chimie nayant pas une

sensibilit infrieure au nanoampre, nous navons pas russi raliser des dpts lec-
trochimiques sur nos lectrodes de verre micromtriques. En effet lenregistrement du
voltammogramme est, pour nous, une assurance que le dpt sest droul correctement.
Cas de laniline
Les rsultats obtenus lors de la caractrisation du systme lectrodes micromtriques

sont les suivants (figure 3.20).
300
ddp = - 84 pH + 520
r = - 0,989
200
100
ddp(mV)
-100
-200
3 4 5 6 7 8
pH
F IGURE 3.20 Caractrisation dlectrodes micromtriques modifies par laniline.

La sensibilit obtenue est suprieure de celle de llectrode de verre (59 mV/pH).

Cette rponse super-Nerstienne est due probablement au non quilibre du processus pro-
tonation / deprotonation de la chane azote prsente dans le polymre [79].
Cas de la glycine
Les caractrisations ralises avec de telles lectrodes lectromodifies par de la gly-

cine ont donn les rsultats suivants (figure 3.21).
250
ddp = - 42 pH + 335
200 r = - 0,995
150
3 100
ddp(mV)
50
0
-50
-100
-150
2 4 6 8 10 12
pH
F IGURE 3.21 Caractrisation dlectrodes micromtriques modifies par la glycine.
Ces rsultats montrent que la plage de mesures du pH stend de 3 11, avec une
bonne linarit (coefficient de corrlation 0, 995). La sensibilit de telles lectrodes est
plus faible que pour des fils de taille millimtrique mais reste tout fait acceptable puis-
quelle est de 42 contre 54.
3.5 Etude des capteurs microsystmes

Paralllement la phase de validation des capteurs filaires, nous avons men une tude
sur la ralisation de ces capteurs sous une forme planaires : les microsystmes. Ce choix
tait motiv par plusieurs facteurs, citons :
la possibilit de les intgrer au support de la corne ;
tudier leur sensibilit en fonction de la taille ;
la fabrication en srie pour dautres applications que la corne.
Nous avons conduit une tude systmatique sur la rponse de ces capteurs en fonction
de leur taille. Pour caractriser notre capteur, nous avons ralis plusieurs tailles dlec-
trodes : entre 1000, et 10m de diamtre pour llectrode de mesure.
Nous allons dcrire dans ce qui suit les diffrentes tapes de la ralisation et de la
caractrisation de ces capteurs miniatures.
3.5 Etude des capteurs microsystmes 101
3.5.1 Etude de microsystmes sur substrat en silicium

Microsystmes lectrodes linaires
Schma et ralisation technologique
Notre but est de raliser un microsystme constitu de deux lectrodes, une lectrode
en platine et une lectrode en argent. Les lectrodes sont relies par des pistes des ter-
minaisons rectangulaires. Ces dernires assurent la connexion au circuit de mesure et/ou
au potentiostat qui est un appareil utilis dans llectrodposition. Ces architectures ont
t choisies pour mettre en vidence leffet de la gomtrie et pour optimiser linteraction
entre les deux lectrodes. Deux structures ont t retenues et reprsentes dans le schma
de principe (figure 3.22 (a)). Nous avons utilis un wafer en silicium oxyd thermique-
ment de 4 pouces de diamtre, de 525m dpaisseur. Deux masques lithographiques de
5 pouces sont ncessaires pour la ralisation de nos microsystmes. Le premier masque
3
dfinit les motifs de llectrode de travail (en platine). Le deuxime masque dfinit les
motifs de llectrode de rfrence (en argent). La transposition du masque sur le wafer
demande lutilisation dune technique appele Lift-off .
Nous obtenons les microsystmes par un dpt dune couche de 150nm pour chaque
lectrode. Il faut noter, quune couche daccroche en titane (10nm) est dpose avant le
dpt du platine et dargent. Cela nous a permet de raliser les motifs en titane-platine et
titane-argent sur le wafer (figure 3.22 (b)).
Platine
Silicum
Zones oxyd
de mesure
Argent
(a) Schma de principe. (b) Image relle.
F IGURE 3.22 Architectures retenues pour les microsystmes.

Discussion et Conclusion
Les lectrodpositions ralises par voltampromtrie cyclique sur llectrode de Pt

des microsystmes seffectuaient suivant le mme principe que celles effectues sur des
lectrodes de taille millimtrique. Nous avons toujours utilis un fil dargent en guise
dlectrode de rfrence, du platine comme contre-lectrode et, comme lectrode de tra-
vail, la piste en platine des microsystmes.
Pour caractriser nos capteurs, nous avons dpos la solution tampon de pH sur les lec-
trodes du capteur. Les rsultats obtenus ntaient pas fiables (mesures non stables) en
raison de ltalement de la solution sur les microsystmes. Nous avons tent plusieurs
solutions pour rsoudre ce problme, en essayant disoler la partie de mesure du reste du
microsystme pour contenir la solution de pH juste sur la partie de mesure. Mais nous
navons pas russi trouver une mthode fiable et reproductible. Pour contourner ce pro-
3 blme nous avons chang notre approche de caractrisation, puisque nous avons dcid
de plonger les microsystmes dans le milieu pH et non plus damener la solution sur le
capteur.
Comme nos microsystmes actuels ne sont pas adapts cette approche, nous avons
conu et raliser une nouvelle gnration de microsystmes plus adapts.
Microsystmes lectrodes parallles

Schma et ralisation technologique
Dans cette version, la configuration des lectrodes a t modifie dune structure o les
contacts lectriques sont placs de part et dautres de la zone de mesures en une structure
o les contacts sont du mme ct. Dans ces conditions, les microcapteurs peuvent tre
immergs sans que les contacts lectriques soient affects (figure 3.23(a)).
La nouvelle architecture permet disoler tous les circuits du microsystme au moyen
dune couche de silice (isolant sur le schma). Seules les zones de mesures (Pt et AgCl)
sont en contact avec la solution. Diffrentes tailles dlectrode vont tre testes
Platine
Verre
ou silicium
Argent
Zones
de mesure
Isolant
(a) Schma de principe. (b) Image relle.
F IGURE 3.23 Architecture et images des microsystmes raliss.

La ralisation des microsystmes ncessite, en plus des 2 masques lithographiques

pour titane-argent et titane-platine, deux autres masques. Le premier pour le dpt de la
couche daccroche sur les endroits des lectrodes o sera dpos la couche isolante et
lautre pour le dpt de la silice (figure 3.23(b)).
Les essais durant les mesures ntaient pas concluantes. En effet, ltape dindivi-
dualisation des capteurs a pour effet de mettre jour la tranche du wafer. Cette tranche
ntant pas oxyde, nous sommes en prsence dun semi-conducteur (type N) qui ragit
avec les lectrodes.
3.5.2 Etude des microsystmes sur substrat en verre 3

Suite aux prcdents rsultats o la nature semi conductrice du silicium na pas t fa-
vorable, nous avons opt pour la ralisation des microsystmes sur un substrat en verre vu
ses qualits disolant. Les tapes technologiques restent les mmes que pour les premiers
microsystmes. La figure 3.24 montre deux microsystmes raliss sur verre.
(a) Vue gnrale. (b) Zones actives.
F IGURE 3.24 Microsystmes tudis.
La connectique
Un point important amliorer tait la connectique depuis le capteur jusquau volt-

mtre ou jusquau potentiostat. Nous avons commenc, par tablir des connexions par la
soudure directe des fils, qui reliaient les microcapteurs au potentiostat ou au voltmtre.
Dans un premier temps nous avons utilis la soudure chaude. Dans un deuxime temps
nous avons utilis la soudure froid avec la pte dargent. Les rsultats de tests des
connecteurs ont montr la non fiabilit de ces deux mthodes. Enfin, nous avons utilis
une autre technique de connexion en utilisant des connecteurs commerciaux. Cette tech-
nique nous a oblig adapter larchitecture de nos microcapteurs celle des connecteurs
(figure 3.25). Les rsultats obtenus avec cette technique taient trs satisfaisants, donc
nous avons adopt cette dernire pour ltude de nos microcapteurs.
Connecteur
3 F IGURE 3.25 Mode de connexion utilis.
lectrodposition des polymres
Nous avons mis au point un nouveau systme plus pratique et mieux adapt pour
llectrodposition des polymres sur les nouveaux microsystmes en verre. La solution
du monomre est contenue dans un creuset en platine, qui joue le rle de contre-lectrode
galement. Le connecteur utilis nous permet dexploiter llectrode dargent du micro-
systme comme rfrence pour llectrodposition. La figure 3.26, montre une image du
systme reli au potentiostat.
(a) Vue densemble. (b) Vue rapproche.
F IGURE 3.26 Montage utilis pour llectrodposition.

3.5.3 Caractrisation des microcapteurs raliss
Nous sommes partis des capteurs de taille millimtrique (1mm de diamtre pour
llectrode de mesure) pour terminer avec des tailles micromtriques de 10m.
Cas de la PEI-L
Pour la caractrisation de la PEI-L (figure 3.27), nous avons trouv des sensibilits de
46mV /pH pour 1mm (figure 3.27 (a))et de 42 mV/pH pour 500m (figure 3.27 (b)) et
de 37 mV/pH 250m (figure 3.27 (c)). La sensibilit est acceptable ces tailles.
3
350
ddp = - 49 pH + 461 250 ddp = - 42 pH + 384
300 r = - 0,997 r = - 0,993
250 200
200 150
150 ddp (mV) 100
ddp(mV)
100
50
50
0
0
-50 -50
-100 -100
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
(a) Electrode de 1mm. (b) Electrode de 500m.
250 ddp = - 37 pH + 359

r = - 0,993
200
150
ddp (mv)
100
50
-50
2 4 6 8 10 12
pH
(c) Electrode de 250m.
F IGURE 3.27 Rponse dun microsystme en verre recouvert par lEDA.
Le potentiostat utilis et ceux disponibles au laboratoire de chimie nayant pas une

sensibilit infrieure au nanoampre, nous navons pas russi raliser des dpts lec-
trochimiques sur les lectrodes de taille infrieure 250m.
Cas de laniline
En ce qui concerne la caractrisation de polyaniline (figure 3.28), contrairement aux
rsultats obtenus avec les lectrodes de verre, nous avons trouv une linarit sur toute
la gamme de pH tudie. Ainsi, nous avons pu constater des sensibilits variant entre
68 mV/pH et 45 mV/pH.
300
300 ddp = - 68 pH + 527 ddp = - 52 pH + 417
r = - 0,991 r = - 0,994
200 200
100 100
ddp(mV)
ddp(mV)
0
0
3 -100
-200
-100
-300 -200
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
200 100
ddp = - 55 pH + 274 ddp = - 45 pH + 159
r = - 0,980 50 r = - 0,993
100
0
0 -50
-100
-100
ddp(mV)
ddp(mV)
-150
-200 -200
-300 -250
-300
-400 -350
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
(c) Electrode de 250m. (d) Electrode de 125m.
F IGURE 3.28 Rponse dun microsystme en verre recouvert par de la polyaniline.
Nous navons pas pu caractriser des microcapteurs infrieurs 125m avec la PANI
en raison de limpossibilit deffectuer les lectrodpositions pour les mmes raisons vo-
ques prcdemment dans le cas de la PEI-L.
Cas de la glycine
Pour la glycine (figure 3.29) nous avons obtenu des sensibilits dcroissantes de 52 mV/pH
pour 1mm 39 mV/pH pour la taille de 10m.
600
ddp = - 52 pH + 724
r = - 0,997 ddp = - 52 pH + 506
400 r = - 0.988
500
300
ddp (mV) 400
200
ddp(mV)
300
100
200
0
100 -100
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
450
ddp = - 45 pH + 522 ddp = - 50 pH + 505
3
400 400 r = - 0,990
r = - 0.990
350
300
300
250 200
ddp(mV)
ddp(mV)
200
100
150
100 0
50
0 -100
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
(c) Electrode de 250m. (d) Electrode de 125m.
600 350
ddp = - 45 pH + 620 ddp = - 39 pH + 429
r = - 0,996 300 r = - 0,995
500
250
400 200
ddp(mV)
ddp(mV)
150
300
100
200 50
0
100
2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12
pH pH
(e) Electrode de 60m. (f) Electrode de 10m.
F IGURE 3.29 Rponse dun microsystme en verre recouvert par la polyglycine.
Note
Les caractrisations de la polyglycine ont t effectues avec une solution de pH
5, 95 au lieu de 6, car la polyglycine un comportement particulier ce point qui se
traduit par une chute brutale de la ddp qui sexplique par lapparition dun composant
chimique spcifique([82]).
Les rsultats obtenus sur les microsystmes nous laissent penser que la glycine est le
meilleur polymre test, et qui sera par consquent le polymre utilis pour le systme de
la corne. En effet, il prsente la meilleure pente la taille (125m) avec un coefficient
de corrlation de 0.996. Nous avons ensuite entam une nouvelle srie de caractrisation
avec le polyglycine sur des lectrodes allant jusqu 10m de diamtre, ce dernier a
donn des rsultats satisfaisants avec une pente de 39 et un coefficient de corrlation de
lordre de 0, 993.
3.6 Intgration des capteurs filaires au support de la

3
corne
Aprs validation de la mesure de la transmittance (Chapitre 2) et du pH avec des
systmes spars, nous avons entam ltape de ralisation du systme de transport et
danalyse de la corne. A dfaut du verre nous avons ralis le dispositif en rsine pour
montrer la fonctionnalit de maintien dune corne bas sur la fluidique (capillaires) et
montrer une configuration de lemplacement des lectrodes de mesures du pH. Ce sys-
tme peut tre perfectionn par lintgration de plusieurs lectrodes autour de la corne,
afin de palier aux ventuelles pannes et en mme temps acqurir des donnes multiples.
Fabrication du support
Nous avons fabriqu des supports de cornes en rsine qui permettent :

le positionnement prcis de la corne durant les mesures en utilisant des capillaires,
pour viter tout stress de la corne au cours des mesures ;
les analyses optiques de la corne en utilisant un matriau transparent ;
les analyses bactriologiques de la corne par un rseau de microcapteurs.
Afin de raliser ce support, nous avons fabriqu un moule. Ce dernier est compos dune
demi sphre en PDMS (Polydimethylsiloxane). La demi sphre possde un mplat per-
mettant la corne de prsenter la surface explorer chaque mesure (figure 3.30). Des
canaux (1mm de diamtre) ont t ensuite usins, par voie mcanique, dans la rsine
aprs polymrisation (figure 3.31).
3.6 Intgration des capteurs . . . 109
Mplat
F IGURE 3.30 Demi sphre en PDMS.

3
Canaux Canaux
pour capteurs pour fluidiques
F IGURE 3.31 Support en rsine aprs perage des canaux.
La figure 3.32, montre le support final qui comporte :

Les microlectrodes pour la mesure du pH ;
Un systme de positionnement compos de :
canaux usins dans la rsine ;
capillaire pour la circulation du liquide, le positionnement et le maintien de la cor-
ne ;
connecteurs pour capillaires ;
seringues de commande du positionnement ou autres systmes pneumatiques auto-
matiss.
Electrode de
mesure en platine
Connecteur
Electrode de rfrence Capillaire

en Ag/AgCl
F IGURE 3.32 Support de transport et danalyse des cornes.
Conclusion
Le dispositif dans sa globalit remplit les fonctions escomptes tels que le position-
nement, les lectrodes de mesures, lergonomie et les mesures optiques de transmission.
Nanmoins, par rapport la reproductibilit des mesures de pH une autre rsine pour-
rait tre plus approprie. Cependant, une solution envisageable consiste intgrer un
microsystme finalis dans le support.
3.7 Conclusion
Le dveloppement des capteurs est pass par plusieurs tapes assujetties plusieurs
conditions qui, au cours de cette tude, ont t mises en exergue une une. Dune concep-
tion base sur la ralisation des microsystmes sur silicium, nous sommes passs une
conception ralise sur un substrat en verre. Le silicium de part ses proprits semi-
conductrices a engendr des problmes lectriques au niveau des surfaces clives, qui
ont t contourns par lutilisation de substrats en verre. Dans cette dernire version, des
connections (contacts) ont t adaptes pour tre relies dune faon pratique aux appa-
reils de fonctionnalisation et de mesures. Les rsultats obtenus sont pertinents du point de
vue de la rponse des sollicitations chimiques (pH).
Les essais prliminaires sont raliss dabord sur des surfaces millimtriques issues de
linclusion des lectrodes filaires dans des matrices de verre. Plusieurs monomres ont
t tests savoir laniline, la PEI-L et la glycine. Des rsultats obtenus, la glycine nous
offre une sensibilit quasi Nernstienne avec une sensibilit de 54 mV/pH contre 65 et 46
pour la PANI et la PEI-L respectivement.
3.7 Conclusion 111
Dans une deuxime tape, en prvision des dispositifs danalyses des cornes des lec-
trodes filaires micromtriques de diamtre de 76m ont t ralises puis tudies cet
effet. Nous avons constat une influence particulirement lors de llectrodposition de
la PEI-L, cette dernire na pas t fonctionnalise aprs plusieurs essais. Le comporte-
ment le plus proche de celui de Nernst est obtenu avec la glycine dune sensibilit de
42 mV/pH et un bon coefficient de corrlation (0.995). A noter quil est de 84 mV/pH
pour la PANI avec un coefficient de corrlation (0.989).
En parallle de ltude des lectrodes filaires, en prvision tendre notre application
dautres domaines o la miniaturisation est ncessaire. Nous avons men une tude sur
les microsystmes, en raison des possibilits quoffre la technique de photolithographie
vis--vis de la configuration des lectrodes et de leurs dimensions. Les diffrentes tailles
(lectrodes de travail) tudies sont 1000m, 500m, 250m , 60m et 10m combins
au trois types de polymres.
La PEI-L na pas donn de rsultat dans le cas des microsystmes de faibles dimensions
3
infrieures 250m, comme cela a t voqu prcdemment. En outre, son utilisation
obit des exigences trs strictes.
En ce qui concerne la PANI, les rsultats obtenus sont acceptables vu la reproductibit
des rsultats et les bonnes sensibilits acquises avec les microsystmes jusqu 125m.
Pour les tailles les plus petites ( partir de 60m) nous navons pas pu effectuer son lec-
trodposition pour les raisons avances prcdemment.
Quant la polyglycine, la sensibilit varie de 52 mV/pH de la plus grande dimension
(1000m) 50 mV/pH pour llectrode de 125m. Nous avons poursuivi dautres carac-
trisations avec le polymre retenu (la polyglycine) sur des lectrodes allant jusqu 10m
de diamtre, ce dernier a donn des rsultats satisfaisants avec une pente de 39 mV/pH
et un coefficient de corrlation de lordre de 0, 995.
Aprs synthse des rsultats nous pouvons conclure que les microsystmes sont fonc-
tionnels mme aux faibles dimensions. Par consquent, ils peuvent tre intgrs dans
diffrents systmes pour constituer un capteur entirement miniaturis et compact. La po-
lyglycine semble tre le matriau le plus appropri en rfrence des rsultats obtenus. Le
transducteur tant un polymre solide, cela confre au capteur des qualits de biocompa-
tibilit. Ainsi, des applications dans le domaine du vivant sont aisment envisageables. La
corne, cas de notre tude, peut tre caractrise par un tel capteur en ladaptant au sup-
port conu cet effet, dautant plus que les dispositions, notamment de positionnement
par fluidique, sont mis au point.
Notre tude, pour tre la plus exhaustive possible, pourrait tre complte par des tests
sur les phnomnes dhystrsis et de la dure de vie.
Conclusion gnrale
D
ans le cadre de cette thse nous avons dmontr la faisabilit de deux micro-
systmes dans le domaine mdical. Le premier est destin la fcondation in
vitro, le second au transport et au contrle qualit du greffon cornen. Pour r-
pondre aux besoins des praticiens nous nous sommes bass sur la technologie
silicium et PDMS associe la mtrologie optique.
Dans le cadre de la FIV nous avons ralis un Lab On Chip qui assure trois fonctions :
laccueil des ovocytes,
leur dplacement,
leur positionnement prcis sur des sites danalyse.
Pour atteindre nos objectifs dans ce projet, nous avons ralis une plateforme en sili-
cium pour laccueil des ovocytes. Pour une grande miniaturisation nous avons conu une
architecture qui intgre un systme de dplacement des ovocytes laide de canaux de
microfluidique associs laspiration du liquide qui constitue leur milieu de vie. Ce choix
se justifie par la contrainte dembryo-compatibilit du systme. Cest une mthode origi-
nale qui peut tre applique dans le domaine de la manipulation des cellules vivantes. En
effet laspiration, en sus de permettre le dplacement des cellules, constitue un outil trs
performant pour leur maintien, en vue par exemple dune caractrisation mcanique. Dans
ce domaine nous avons montr la possibilit de mesures optiques qui peuvent constituer
des mthodes pour la caractrisation des ovocytes avant leur fcondation. Les essais que
nous avons men dans ce domaine ont t effectus sur des ovocytes surnumraires. Ainsi
les rsultats de caractrisations optiques des ovocytes demandent tre confirms sur un
grand nombre dovocytes pour tre valids. Ce travail peut tre men laide dovocytes
danimaux. Il ouvre une perspective pour cette partie de notre thse.
Nous nous sommes intresss dans la deuxime partie de ce travail concevoir un

Lab On chip pour le transport et le contrle qualit du greffon cornen. Il sagit dans ce
113
domaine dapporter une solution au transport de la corne, qui se fait actuellement dans
des bouteilles en verre. Ce mode de stockage de la corne impose la manipulation de la
corne, tissu trs fragile, pour le test et lanalyse. Il nous restait rsoudre le problme
du contrle qualit qui se rduit au comptage de nombre de cellules vivantes (ce critre
constitue une norme sanitaire avant la greffe). Nous avons dmontr que la mesure de
la transmittance de la corne au cours de son stockage constitue une mthode pertinente
pour saffranchir du bleu trypan, produit toxique ncessaire pour le comptage des cellules
vivantes sous microscope. Afin deffectuer cette opration dans de bonnes conditions nous
avons ralis un Lab On Chip en PDMS (transparent) pour le stockage du greffon cornen.
Ce Lab On Chip assure ainsi lencapsulation de la corne tout en permettant la mesure
de la transmittance optique de celle-ci. Le maintien en vie de la corne est assur par un
systme de microfluidique.
Pour une analyse objective de la prsence de foyers infectieux dans la corne lors de
son stockage nous avons opts pour des capteurs ponctuels de pH. En effet pendant la
3 conservation de la corne destine la greffe, des bactries peuvent la contaminer ceci
se traduit par un changement de son pH. La mesure du pH se fait actuellement par colo-
rimtrie, une technique peu prcise et oprateur dpendante. Nous avons obtenu dans ce
domaine des rsultats pertinents. En effet, nous avons dmontr la faisabilit dun capteur
de pH dont le transducteur est de 10 m de diamtre, prsentant une rponse linaire entre
un pH de 3 11. Ce capteur peut tre utilis dans plusieurs domaines dapplications.
III
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IV
Index
Index
Acoustique, 8 Microfluidique, 911, 43
Aniline, 86, 90, 106 Microsystme, 4, 11, 31, 37, 41
Argent, 86, 91, 98, 101
Nernst, 81, 97
Bowman, 51
Ovocyte, 10, 39, 44
Capteur, 79, 88, 94, 105, 108, 111
Corne, 52, 5456, 58, 62, 72, 73, 75, 77,
PDMS, 63, 68
79, 87, 95, 100, 108, 111
PDMST, 108
Pinces Optiques, 5
Descemet, 51 Plateforme, 4, 10, 25, 28, 37, 44
Dilectrophorse, 7 Platine, 82, 85, 89, 97, 101
Polymre, 79, 85, 86, 88
Electrodes de rfrence, 86 Potentiomtrique, 79, 82, 85, 88
Endothlium, 51, 54 Potentiostat, 99, 101, 104
Epithlium, 50, 57
Ethylnediamine, 89, 91, 95 Silicium, 4, 9, 12, 25, 31, 44
Sillon, 11, 13, 17, 41
FIV, 3, 11, 39 Spectromtre, 58, 60
Stroma, 51, 54, 56
Glycine, 90, 92, 97, 100, 110
Gravure, 4, 12, 13, 18, 23, 27, 44 Transducteur, 79, 84, 86, 111
Transmittance, 49, 60, 77
Lab On Chip, 3, 11, 43
Lithographie, 9, 12, 15, 25, 31, 32 Verre, 4, 31, 32, 44
125
Glossaire
Asepsie consiste ne pas apporter de micro-organismes trangers au site concern (bac-

tries, parasites. . . ). Mthodes visant labsence de contamination microbiologique
dun site opratoire par exemple. page 81
Cellules de Schwann forment des couches de cellules qui recouvrent les segments de la
gaine de myline de certaines cellules nerveuses. page 76
Dynamique dun capteur cest la zone qui reprsente le domaine de rponse du capteur
avant saturation. page 126
Film lacrymal un mcanisme naturel visant protger la surface de lil des matires
irritantes comme la salet, la poussire et les autres particules se trouvant dans lair,
en plus de protger les yeux contre les infections. page 85
Humeur aqueuse un liquide transparent faible viscosit, dpourvu dlments figurs
du sang, continuellement filtr et renouvel qui, avec le corps vitr, maintient la
pression intra-oculaire et la forme du globe oculaire. page 74
Lift-off techniques de lithographie permet de structurer des couches minces mtalliques
dposes sur un substrat. page 153
Lithographie dsigne lensemble des oprations permettant de reproduire les motifs pr-
sentent sur un schma sur la surface dun substrat. page 169
Organoculture des milieux nutritifs drivs des mthodes de cultures cellulaires et ont
t mis au point uniquement pour la corne humaine. page 83
Proteoglycan une catgorie spciale de glycoprotines qui sont fortement glycosyle.
page 76
Solution tampon solution qui maintient approximativement le mme pH malgr laddi-
tion de petites quantits dun acide, dune base ou dune dilution. page 155
127
128 Index
Substance fondamentale un ensemble de protines (principalement dacide hyaluronique)

sur lequel se fixent les sels minraux pour former diffrents tissus conjonctifs.
page 76
Liste des Acronymes
DRIE . . . . . . . . . Deep Reaction Ion Etching.
EFS . . . . . . . . . . . Etablissement Franais du sang
FIV . . . . . . . . . . . Fcondation in vitro.
ICSI . . . . . . . . . . . Intra Cytoplasmic Sperm Injection.
ISFET . . . . . . . . . Ion Sensitive Field Effect Transistor.
PCR . . . . . . . . . . . Raction en Chane de Polymrase.
PDMS . . . . . . . . . Polydimethylsiloxane.
PEI-L . . . . . . . . . Polythylneimine Linaire.
SHE . . . . . . . . . . . Standard Hydrogen Electrode.
SRE . . . . . . . . . . . Silver Reference Electrode.
UTCG . . . . . . . . . Unit de Thrapie Cellulaire et Gnique.
129
Table des figures
1.1 Principe physique des pinces optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2 Schma de principe du "Lab On Chip". . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 Schma de principe des sites dimmobilisation. . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 Motif du masque non compens. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.5 Motif du masque compens. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.6 Apparition de la future ouverture pyramidale. . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.7 Evolution des plans lors de la gravure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.8 Connexion du canal avant la formation de louverture. . . . . . . . . . . . 17
1.9 Formation de louverture pyramidale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.10 : Larte <410> arrive la premire au point O. . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.11 : Larte <410> arrive la premire au point O. . . . . . . . . . . . . . . . 19
1.12 : Parcours du plan {771}. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
1.13 Schma de la sous gravure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.14 Image MEB de la face infrieure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.15 Images MEB illustrant la technique de gravure utilise. . . . . . . . . . . 26
1.16 Image MEB de la face suprieure. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
1.17 Image MEB dune ouverture. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
1.18 Schma de principe des ateliers de mesures. . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.19 Rsultats exprimentaux ateliers danalyses. . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.20 Une partie du masque pour les ouvertures. . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.21 Wafer de verre (4 pouces) aprs lift-off. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
1.22 Face infrieure aprs la soudure anodique. . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.23 Montage des connecteurs microfluidiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.24 Test des connecteurs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
1.25 Dispositif de fibrage de la plateforme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.26 Plateforme et les connexions associes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
131
132 TABLE DES FIGURES
1.27 Montage exprimental pour la manipulation et lanalyse dun ovocyte. . . 36

1.28 Le dplacement et limmobilisation dune bille en polystyrne. . . . . . . 38
1.29 Le dplacement et limmobilisation de lovocyte. . . . . . . . . . . . . . 39
1.30 Caractrisation de lovocyte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.31 Schma de principe du systme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.32 Vues rapproches du composant. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.33 Systme de mesure des proprits optiques des ovocytes. . . . . . . . . . 42
1.34 Mesure de lindice de rfraction des ovocytes. . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.35 Estimation de la maturit des cellules. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.1 Structure de la corne. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.2 Conservation de la corne aprs prlvement. . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.3 Rfraction de la lumire par la corne[56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.4 Reprsentation de lil et des quatres images de Purkinje. . . . . . . . . . 58
2.5 Dispositif exprimental pour la mesure de la transmission. . . . . . . . . 59
2.6 Transmission de la lumire par un objet absorbant. . . . . . . . . . . . . 60
2.7 Transmittance spectrale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
2.8 Schma du support. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.9 Modle servant la ralisation du support. . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.10 Injection du PDMS dans la boite de ptri. . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
2.11 Vue de dessus du support de cornes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
2.12 Schma reprsentant le principe de la mesure de la transmittance. . . . . . 64
2.13 Rsultat des mesures de la corne hors milieu. . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.14 Estimation du temps ncessaire lextraction du milieu de la corne. . . . 67
2.15 Spectres des mesures effectues dans le premier support. . . . . . . . . . 68
2.16 Support pour le positionnement de la corne sous le faisceau lumineux. . 69
2.17 Spectres des mesures obtenus laide du nouveau support. . . . . . . . . 70
2.18 Schma reprsentant le principe de la mesure de la transmittance. . . . . . 70
2.19 Elimination de leffet du milieu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.20 Comparaison entre la transmittance de cornes contenant un nombre dif-
frent de cellules. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
2.21 Evolution de la transmittance des cornes en fonction du temps. . . . . . 76
3.1 Les critres de qualit dun capteur chimique. . . . . . . . . . . . . . . . 80

3.2 chelle du pH. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.3 Schma dune lectrode de verre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.4 Schma dun ISFET (reproduction de[70]). . . . . . . . . . . . . . . . . 84
3.5 Schma de principe de la mesure du pH de la corne. . . . . . . . . . . . 87
3.6 Principe de la mesure potentiomtrique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.7 Molcule de laniline. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.8 Molcule de la glycine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.9 Montage de voltampromtrie cyclique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
3.10 Voltamprogramme dune solution dEDA. . . . . . . . . . . . . . . . . 91
TABLE DES FIGURES 133
3.11 Voltamprogramme dune solution daniline. . . . . . . . . . . . . . . . 92

3.12 Voltamprogramme dune solution de glycine. . . . . . . . . . . . . . . . 93
3.13 Images AFM en mode contact sur platine 1 1m2 . . . . . . . . . . . . 94
3.14 Electrode millimtrique en verre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.15 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par lEDA. . . . . . 96
3.16 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par laniline. . . . . 96
3.17 Caractrisation dlectrodes millimtriques modifies par la glycine. . . . 97
3.18 Fils micromtriques de platine et dargent pris dans de la rsine. . . . . . 98
3.19 lectrode en verre fabrique au laboratoire. . . . . . . . . . . . . . . . . 99
3.20 Caractrisation dlectrodes micromtriques modifies par laniline. . . . 99
3.21 Caractrisation dlectrodes micromtriques modifies par la glycine. . . 100
3.22 Architectures retenues pour les microsystmes. . . . . . . . . . . . . . . 101
3.23 Architecture et images des microsystmes raliss. . . . . . . . . . . . . 102
3.24 Microsystmes tudis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
3.25 Mode de connexion utilis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.26 Montage utilis pour llectrodposition. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.27 Rponse dun microsystme en verre recouvert par lEDA. . . . . . . . . 105
3.28 Rponse dun microsystme en verre recouvert par de la polyaniline. . . . 106
3.29 Rponse dun microsystme en verre recouvert par la polyglycine. . . . . 107
3.30 Demi sphre en PDMS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.31 Support en rsine aprs perage des canaux. . . . . . . . . . . . . . . . . 109
3.32 Support de transport et danalyse des cornes. . . . . . . . . . . . . . . . 110
Table des matires
I Lab On Chip pour la fcondation in vitro 1

1 Plateforme pour la FIV 3
1.1 tat de lart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.1.1 Les pinces optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1.2 La manipulation mcanique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.1.3 La dilectrophorse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1.4 Manipulation des cellules par ondes acoustiques . . . . . . . . . 8
1.1.5 La microfluidique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2 Schma de principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3 Choix de la technologie silicium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 Techniques dusinage du silicium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.5 Usinage de la face infrieure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.5.1 Gravure sans structure de compensation . . . . . . . . . . . . . . 14
1.5.2 tude thorique de la structure de compensation . . . . . . . . . 14
1.5.3 Rgles de dfinition de la structure de compensation . . . . . . . 17
1.5.4 Influence des sous gravures des plans {111} . . . . . . . . . . . . 23
1.5.5 Calcul des diffrents paramtres . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.5.6 Rsultats Exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
1.6 Usinage de la face suprieure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6.1 Mise en uvre exprimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6.2 Rsultats exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.6.3 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.7 La partie verre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
1.7.1 Prsentation schmatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
135
136 Table des matires
1.7.2 Rsultats exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.8 Assemblage du microsystme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.8.1 Montage des connecteurs microfluidiques . . . . . . . . . . . . . 33
1.8.2 Montage des fibres optiques et des capillaires microfluidiques . . 34
1.8.3 Montage exprimental pour la manipulation et lanalyse de lovo-
cyte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.9 Rsultats Exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
1.9.1 Validation du microsystme avec des billes en polystyrne . . . . 37
1.9.2 Validation du microsystme avec des ovocytes surnumraires . . . 39
1.10 Mesure des proprits optiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.10.1 Premier microsystme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1.10.2 Second microsystme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.10.3 Mesure de lindice de rfraction des ovocytes . . . . . . . . . . . 42
1.10.4 Estimation de la maturit des cellules . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.11 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
II Lab On Chip pour le transport et le contrle qualit du greffon

cornen.in vitro 47
2 Etude du spectre de Transmittance de la corne 49
2.1 Gnralits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.1.1 Anatomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.1.2 Histologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
2.2 La greffe de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.1 Les maladies de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.2 Lintervention chirurgicale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2.2.3 Le prlvement et la conservation du greffon avant la greffe . . . 52
2.2.4 La cession de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
2.2.5 La greffe de la corne lEtablissement Franais du Sang (EFS) . 56
2.3 Comportement optique de la corne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.3.1 Transmission de la lumire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.3.2 Rfraction de la lumire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.3.3 Rflexion de la lumire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.4 Dispositif exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4.1 Description du dispositif de mesure . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.4.2 Caractrisationdudispositif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
2.4.3 Mesures effectues sur des cornes en dehors du milieu de conser-
vation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
2.4.4 Mesures effectues sur des cornes dans le milieu de conservation 68
2.5 Tests sur site . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
2.5.1 La transmittance en fonction du nombre de cellules endothliales 73
2.5.2 Evolution de la transmittance de la corne avec le temps . . . . . 75
Table des matires 137
2.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
3 Microcapteurs pour la dtection de bactries 79

3.1 tat de lart . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.1.2 Dfinition du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
3.1.3 La mesure du pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
3.2 Approche conceptuelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
3.3 Ralisation de microcapteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.3.1 Le principe du capteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
3.3.2 Les polymres tudis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
3.3.3 Electrodposition des polymres sur le platine . . . . . . . . . . . 91
3.4 Caractrisation des capteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.1 Etude des capteurs filaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
3.5 Etude des capteurs microsystmes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.5.1 Etude de microsystmes sur substrat en silicium . . . . . . . . . . 101
3.5.2 Etude des microsystmes sur substrat en verre . . . . . . . . . . . 103
3.5.3 Caractrisation des microcapteurs raliss . . . . . . . . . . . . . 105
3.6 Intgration des capteurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
3.7 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
III Bibliographie 115

Bibliographie 117
IV Index 123
Index 125
Anne 2008
Rsum
Au cours de cette thse, deux Lab On Chip ont t raliss. Le premier est destin la
THSE
fcondation in vitro (FIV) et le second au transport et au contrle qualit dun greffon cor-
nen. Le Lab On Chip pour la FIV est constitu dune plateforme et dun ensemble de prsente
sondes permettant la caractrisation de lovocyte. La plateforme en silicium, assure le
maintien en vie de lovocyte en formant un rservoir pour le milieu de vie des cellules. Un LU.F.R. DES SCIENCES ET TECHNIQUES
rseau de microcanaux usin sur la plateforme permet daspirer le milieu des cellules et DE LUNIVERSIT DE FRANCHE-COMT
confre cette dernire les fonctions : de dplacement, de positionnement et dimmobi-
lisation de lovocyte. Des tests prliminaires, sur des ovocytes surnumraires, ont mon-
tr la faisabilit des analyses non invasives pour la caractrisation des ovocytes avant pour obtenir le
fcondation.
Actuellement, la manipulation de la corne, pour effectuer certaines analyses, risque de GRADE DE DOCTEUR DE LUNIVERSIT
lendommager. Pour rsoudre ce problme, nous avons dvelopp une mthode optique, DE FRANCHE-COMT
non invasive, pour caractriser ltat de la corne. Il sagit dune mesure de la transmit- Spcialit : Sciences pour Ingnieur
tance de la corne corrle avec le nombre de cellules vivantes. Afin de dtecter les
infections dans la corne, nous avons dvelopp des microcapteurs de pH. Ces derniers
offrent une mesure ponctuelle plus prcise. La caractrisation des microcapteurs a don-
ne des rsultats pertinents jusqu une taille de 10 m. Enfin, nous avons intgr un sys-
tme de capillaires pour maintenir la fois la corne dans son milieu de vie et pour la
positionner dune manire non invasive, afin deffectuer son analyse.
MICROSYSTMES ET MICROCAPTEURS
Mots cls : Lab On Chip, microsytmes, manipulation des cellules uniques, FIV, gravure
POUR LES SCIENCES DU VIVANT
humide KOH, gravure sche DRIE, microcapteurs, spectre de transmission de la corne,
polymres en couches minces, microlectrodes.
Abstract
In this thesis, two Lab On Chip has been realised. The first one is intended for in vitro fer-
tilization (IVF), the second for the transportation and quality control of the cornea. The
Lab On chip for IVF is formed of a platform and a set of probes. The platform is made of
silicon ; it forms a reservoir for the life fluid of the oocyte to keep it alive. On the plat-
par
form we machined a network of microchannels to aspire the life fluid ; this operation
Rabah ZEGGARI
gives the platform the functions of : transportation, positioning and immobilization of the
oocyte. A preliminary test, on supernumerary cells, demonstrates the feasibility of non
invasive tests for the characterization of the oocyte before fertilization. Soutenue le 24 avril 2008 devant la commission dExamen
Actually, the manipulation of the cornea, for execute some analysis, can cause damage
for it. To resolve this problem, we developed an optical method, so no invasive, for cha- Prsident du Jury H. MAILLOTTE Directeur de Recherche CNRS, Universit de Franche-Comt
racterization state of the cornea. It consist in the measure of cornea transmittance, that
measure is correlated with the number of living cells. To detect infections in the cornea, Directeur de thse T. GHARBI Professeur, Universit de Franche-Comt
we developed pH micro-sensors. The latter offer a more accurate measure. The charac-
terisation of the pH micro-sensors has yielded results relevant until a size of 10 m. Rapporteurs D. FELBACQ Professeur luniversit de Montpellier II
Finally, we incorporated a system of capillaries to maintain the cornea in his life fluid, also M.L HAJI Professeur luniversit de Rennes 1
for its positioning bynon invasive manner for analysis.
Examinateurs D. BARCHIESI Professeur, Universit de Technologie de Troyes
Key words : Lab On Chip, microsystems, single cell manipulation, wet etching KOH, dry G. HERLEM Matre de confrence (HDR), Universit de Franche-Comt
etching DRIE, IVF, microsensors, micromachining, corneal transmission spectrum, thin V. LAPIERRE Docteur en Medecine, Institut de cancrologie Gustave Roussy
polymers films, microelectrodes. B. WACOGNE Charg de Recherche CNRS (HDR), Universit de Franche-Comt

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Anne 2008

Un systme de microfluidique assure le dplacement et limmobilisation de lovocyte.

I Lab On Chip pour la fcondation in vitro 1

II Lab On Chip pour le transport et le contrle qualit du greffon

3 Microcapteurs pour la dtection de bactries 79

III Bibliographie 115

Plateforme pour la FIV

Nous avons donc entrepris la conception et la ralisation dune plateforme de ce Lab

Dans la premire partie, nous prsentons un schma de principe de la plateforme, nous

1.1 tat de lart

1.1.1 Les pinces optiques

F IGURE 1.1 Principe physique des pinces optiques

Cependant, la manipulation de cellules biologiques par laser trapping a des effets n-

1.1.2 La manipulation mcanique

de cellules ont t conus, notamment un dispositif permettant disoler et de collecter

1.1.4 Manipulation des cellules par ondes acoustiques

La diffrenciation entre les cellules et le srum physiologique dans lequel baignent,

1.2 Schma de principe

Connecteurs Sillons fibres Ovocyte Milieu Sens du dplacement Canal principal

Micro-canal Verre Ouverture Connecteur Silicium

F IGURE 1.2 Schma de principe du "Lab On Chip".

Sur la face suprieure du microsystme, nous usinons un canal de 200 m de lar-

1.3 Choix de la technologie silicium

1.4 Techniques dusinage du silicium

Face infrieure Ouverture

F IGURE 1.3 Schma de principe des sites dimmobilisation.

hw : paisseur du wafer (525 m).

h2 : profondeur laquelle louverture fera 40m de ct ;

La largeur de 40m pour la micro-ouverture daspiration na pas t choisie au hasard.

1.5 Usinage de la face infrieure

1.5.1 Gravure sans structure de compensation

= 54.7 : est langle entre les plans {111}

F IGURE 1.4 Motif du masque non compens.

1.5.2 tude thorique de la structure de compensation

Prsentation de larchitecture de la compensation

F IGURE 1.5 Motif du masque compens.

Lobjectif est de retarder linstant o les plans {411} commencent se dvelopper

1 F IGURE 1.6 Apparition de la future ouverture pyramidale.

F IGURE 1.7 Evolution des plans lors de la gravure.

F IGURE 1.8 Connexion du canal avant la formation de louverture. 1

F IGURE 1.9 Formation de louverture pyramidale.

En conclusion de cette partie, trois principales tapes se distinguent dans le processus

1.5.3 Rgles de dfinition de la structure de compensation

Calcul des valeurs maximales pour d

F IGURE 1.10 : Larte <410> arrive la premire au point O.

Maintenant, pour chacune des artes nous calculons la valeur correspondante de dM ax .

Le temps ncessaire ce parcours est :

F IGURE 1.11 : Larte <410> arrive la premire au point O.

Larte <410> arrive la premire au point O si : d<410>

Dans la pratique nous procdons comme suit :

Calcul des valeurs minimales pour d

Lide du calcul est la suivante :

De cette figure nous dduisons les expressions suivantes :

En ce qui concerne le paramtre dM in , le raisonnement sur lordre darrive des artes

Larte <410> arrive la premire au point O si : d<4 10>

Dans la pratique, nous procdons suivant le mme principe pour la dtermination de

1.5.4 Influence des sous gravures des plans {111}

= temps de gravure V<110>

F IGURE 1.13 Schma de la sous gravure.

Les valeurs minimales pour d sont donnes par :

Ces dernires valeurs sont comparer avec d0 = 0 1 V<110> et 1<410> = 2 .

1.5.5 Calcul des diffrents paramtres

partir de la relation (1.1) nous trouvons :