Contrdle bactériologique de la qualité de Peau L'analyse bactériologique de l'eau de consommation consisterait a la recherche des micro-organismes Pathogénes qu’elle peut contenir. Cette perspective est impossible a réaliser on raison du nombre important de tests & effectuer, des difficultés qu’elles présentent et de leur cofit. La grande majorité des micro-organismes pathogénes sont éliminés par la matiére fécale ou tes urines Ainsi, Vestimation de leur présence en recherchant des germes fScaux qui les accompagnent est plus simple. Ces germes sont appelés alors des indicateurs de contamination fécale, ce sont des saprophytes, toujours isolés du tube digestif de homme ou de I’animal. Ils sont en outre plus résistants ‘que Jes germes pathogénes dans "environnement. Pour toutes ces raisons, leur mise en évidence est relativement simple, facile mettant ceuvre des techniques peu cofteuses La flore fécale est extrémement variée, mais trois facteurs doivent étre pris en considération pour le choix d’un germe témoin de contamination fécale ; Sa spécificité : un germe peut étre exclusivement d'origine fécale. Sa sensibilité et son importance quantitative : la recherche sera d’autant plus facile que le germe sera présent en plus grande abondance dans I’intestin de l'homme et |’animal. Sa résistance : plus la bactérie est résistante, plus les chances de Visoler seront grandes, dans le temps. La prise en considération des ces facteurs conduit a faire lee recherches suivantes : 1. Dénombrement des germes totaux. 2- Recherche et dénombrement des coliformes fécaux. 3. Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux. 4- Recherche et dénombrement des Clostridium sulfuto-réducteurs. - Recherche des bactériophages. . Analyse de Peau: Préiévement : L’échantillon qui doit étre soumis analyse sera prélevé soigneusement dans un récipient stérile dans des conditions d’asepsie rigoureuse et de telle sorte qu’il soit représentatif de I’eau a analyser. L’analyse devra suivre rapidement le prélévement ( au maximum 8h) de l’échantillon qui sera toujours transporté et stocké au froid a+ 4°C. 1-Dénombrement de la flore aerobie mésophile totale (FTAM) : Ui s’agit de micro-organismes se développent bien sur milieu ordinaire ce qui exclut un nombre important de germes : bactéries filamenteuses, bactéries sulfureuses, des germes anaerobies stricts.... Etc. Cependant la grande majorité de la flore banale et pathogéne pourra se développer. La technique consiste simplement @ incorporer une quantité d’ean connue ou ses dilutions sur un milieu gélosé (GN, PCA). Deux séries de boites de Petri (expérience en double pour chaque dilution)sont ensomencées. On incube & la température 20-22 °C durant 72 h pour les germes saprophytes et & 37°C pour les germes pathogénes. Répétée dans le temps, cette technique quantitative renseigne sur |’évolution du nombre de micro- organismes dans une neppe et par voie de conséquence sur le degré de protection que lui confére son site géologique : la constance du nombre de germes indique que la nappe évolue peu et qu'elle est relativement protégée des contaminations. Au contraire, de grandes variations sont un signe de fragilite de la protection en méme temps que lee signes d’ une contamination. 2-Recherche et dénombrement des coliformes fécaux : Selon !’Organisation Internationale de Normalisation (1.5.0), les coliformes sont des bacilles Gram négatif, non sporulés, oxydase négative, aérobies anaerobies facultatif, capables de se multiplier en présence de sels biliaires ou d'autres agents ayant de propriétés analogues, capables de fermenter le lactose avec production d’acides et de gaz en 48 h a des températures de 30 235°C. On appelle coliformes fécaux, les coliformes résidents du tube digestif de homme et I’animal. Ce sont des thermotolérants capables de se développer a 44°C, cette catégorie inclut exclusivement E. cold, 1- les techniques sur miliewx guides : Le test original de mise en évidence des coliformes supporte Ie test de présomption, de confirmation et de démonstration (figure). ‘L’étape présomptive : Elle est exécutée au moyen de tubes inoculés par trois volumes différents d’échantillon pour donner une estimation du nombre ie plus probable (NPP) de coliformes dans l'eau. Le milieu utilisé est un bouillon lactosé (au pourpre de bromocresol BCPL) munis de cloche de Durhan pour la mise en évidence de la production de gaz, aprés 24 448 h d’incubation a une température de 30a 35°C. Las tubes oit le lactose est fermenté (virage de couleur du bleu au jaune) avec production de gaz sont retenus, Ils contiennent éventuellement des coliformes (test présomptif). Raq: sily a virage de Pindicateur sans production de gaz le résultat est considéré comme négatif. ‘Le nombre de coliformes est évalué en se reportant aux tables de Mac Grady pour calculer |’indice NPP. Les résultas de cette culture doivent étre confirmer car il existe de fausses réactions dues a la fermentation du lactose par d’ autres bactéries, autre que les coliformes (Bacillus , Clostridium). Le test confirmatif : La confirmation des coliformes est réalisée @ partir des bouillons lactosés positifs par subculture & une température de 35 4 37°C sur un milieu plus spécifique (bouillon Jactosé a la bile et au vert brillant BLBVB) munis de cloche. La croissance avec dégagement de gaz constitue une confirmation. Malheureusement, les coliformes comprennent une large gamme de bactéries dont la source principale peut ne pas étre le systéme intestinal. Pour faire face a cette difficulté, plusieurs techniques ont été développé permetiant de verifier la présence des coliformes fScaux dans | eau.C _| Echantillon ¢*eau Inoculation de 15 tubes : S avec 10m d°échantilion, 5 avec 1,0ml d°échantillon et S avec 0,1 ml d’échantillon a are ae een emma ee eee elena) Bouillon en concentration double Bouillon en concentration normale ood F ] c T ] C y if T] | a Ji JUUUY J ec 2 10 19 19 10 10 19 10 01 01 01 O1 2 ny (al) (al) Bouillon lactosé ou lauryl tryptose Présomptf négatif. zh —L Apres 24h incubation Lrabsence de gaz dans 30.a35°C les tubes de bouillon lactosé les tubes de bouillon traduit sont examiner pour verifier Pabsence de coliformes. | La prodnetion de gaz. = RL. Aucun gaz produit ‘Le groupe coliforme est absent. “Toutes les cultures présornptives Positives sont utilisées pour inoculer des tubes de bouilion lactos¢ & la bile et au vert, brillant. Incubation & 30~35°C pendant a 48h Test posit : production de gaz Utiliser les tubes confirmatifs positifs pour} \\Y_ dtterminer le nombre le NPP. Postif Negatt Bouillon lactosé ‘Les boites de milieu gélosé EMB alabileet aa ont striées & partir des tubes positife vert brillant et incuber & 35°C pendant 24h, aprés 24 h d'ncubation faire une coloration de Gram & partir du tube incline. Si les bactéries sont des batonnets (Gram —nonsporulans et produisent de gaz a partir du lactose ‘Utilise les colonies de colifermes pour inoculer Le test démonstretif ext positif. la GN inclinée et untube de bouillonLe test démonstratif : La chatimandtasid> 1a présence des coliformes thean) est réalisée a partir des miliewx présomptifS ou confirmatifs ( BCPL ou BLBVB), par subculture of isolement sur un milien solide sélectif pour les Entérobactéries, par exemple une gélose lactosée EMB. On incube 4 une température de 30 a 35 °C pendant 24 h, La mise en évidence et le dénombrement d’£. cofi peuvent étre effectuer & partir des tubes positifs (présomptif ou confirmatif)par le test de Mackenzi : ensemencement d’une eau peptonée ot d’un tube de BLBVB avec cloche et incubation a 44 + 0,5°C pendant 48 h. la production @'indole sur une eau peptone et la culture avec production de gaz sur BLBVB caractérisent E. coll. Ces techniques de recherche et dénombrement des coliformes sur milieux liquides, sont rigoureuses et précises mais elles sont longues et nécessitent un matériel important et un personnel de qualité, On tend a les remplacer actuellesment par des techniques plus simples et plus spécifiques. 2-Les techniques sur membrane filtrante : L’eau est filtrée a l'aide @’appareils spéciaux (figure) de conception simple, a travers une membrane ou un filtre moléculaire en cellulose ou acétate de cellulose, Les germes en suspension dans l'eau sont retenus sur la membrane. Celle ci, déposée sur un milieu approprié, permettra aux bactéries de puiser a travers la membrane les substrats nutritifs nécessaires & leur croissance et de former des colonies. Pour les coliformes, deux membranes sont utilisées lune est incubée pendant 24 h a 37 °C (coliformes totaux), !’autre est incubé pendant 24 h a 44 °C (coliformes thermotolérants). Ce procédé a l’avantage d’étre extrémement rapide tout en stant rigoureux et simple. Il est spécialement indiqué dans le contrOle des eaux de distribution qui sont habituellement peu souillées plutét que dans Penalyse des eaux de qualité bactériologique inconnue qui sont susceptibles de contenir un nombre éleve de germes. 3-Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux : du point de vue physiologique les Streptocoques sont regroupés en deux entités ( enterocoques et non enterocoques). Les enterocoques sont trés résistants, généralement résidents du tube digestif (il existe des enterocoques @habitat non fécal). Les Streptocoques fécanx sont les Streptocoques classés dans le groupe sérologique D de Lancefield Streptococcus fecalis, Streptococcus faeclum, Streptococcus durans Streptococcus bovis, Streptococcus equinus. Ils sont caractérisés par leur aptitude a cultiver dans des conditions hostiles de croissance. Ils supportent, la présence d’agents chimiques inhibiteurs comme le téllurite de potassium, Pazothydrate de sodium ou I’éthylviolet. Leur recherche met a profit cette propriété. Dans des milieux contenant de I’azothydrate de sodium et éventuellement de I’éthylviloet (milieu de Rhote et de Litsky), ils se multiplieront seuls tandis que les autres micro-organismes qui les accompagneat sera totalement inhibé. Comme pour les coliformes, le dénombrement des Streptocoques fScaux est basé sur le succession de deux milieux liquides : présomptif et confirmatifTest présomptif : La numération présomptive est réalisée l'aide de milieu & Pazide (milieu de Rothe): cing tubes & double concentration sont ensemencés avec 10 ml d’eau, 2 tubes a simple concentration avec 1 ml d'eau et 1 tube de milieu & simple concentration avec 1 ml de chaque dilution. Aprés une culture pendant 4h &37 °C, les tubes positifs (présentent un trouble) sont présumés contenir un enterocoque. Test confirmatif : La confirmation est réalisée par une subculture pendant 24 a 48 h a 37 °C sur milieu de Litsky. Une culture positive avec éventuellement [apparition d'une pastille violette traduit la présence d’enterocoque. Les streptocoques fécaux constituent des indicateurs trés fiables d’une pollution ancienne : sont plus résistants que les coliformes fécaux. Ils ont une relative spécificité d’habitet : contamination humaine (Streptococcus fecalis) et contamination animale (Streptococcus bovis). 4- la recherche et le dénombrement des Clostridium sulfito-reducteurs (BSR) : les Clostridium sulfito-reducteurs, principalement Clostridium perffingens, sont des anaerobies srtictes, sporulés, hotes intestinaux du tube digestif de Phomme. Les Clostridium sulfito-reducteurs ont la propriété commune de réduire les sulfites de sodium en sulfures de fer. Le dénombrement des anaerobiessulfito-réducteurs est réalisé en tube de gélose profonde en utilisant des milieux sulfités : milieu VF (viande de foie) sulfité. Destruction des formes végétatives : L’échantilion de 250 ml d’eau a analyser est placé dans grand tube (220 x 22 mm) et porté au bain - marie & 75 ou 80 °C pendant 5 10 mn. Préparation du milien: Faire fondre de 250 ml de gélose VF au bain-marie bouillant et y maintenir pendant 10 mn. Reffoidir a 50°C environ et ajouter 2,5 ml d’alum de fer et 6,25 mi de sulfite de sodium, Répartir dans quatre tubes stériles, 1 ml d'eau traitée précédemment, couler dans chacun d’eux 20 ml du milieu, mélanger doucement sans incorporer d’air, reffoidir et incuber &37 °C pendant 24 & 48h. On distingue aprés culture des colonies entourses d’une auréole noire par formation de sulfure de fer, cette coloration facilite leur dénombrement. Les bactéries sulfito-reductrices détectées appartiennent trés souvent & I’ espéce Clostridium perfringens mais il est impossible de le conclure a priori. Le test confirmatif de la présence de Clostridium perfringens nécessite !’isolement et I”identification de ce germe. 6- Recherche des bactériophages fécaux : Dans tous les milieux od végétent des bactéries, on peut rencontrer des bactériophages qui parasitent et se développent a leurs dépens.Les bactériophages fScaux stant en faible quantité pour pouvoir etre décelés directement sur Péchantillon, ce dernier est enrichi en lui inoculant, aprés addition d’un bouillon nutritif, une souche E. coli, La mise en évidence de ces bactériophages se fait en deux temps : -En premier temps, on assure leur développement dans un milieu péptoné ensemencé avec une abondance suspension d’une culture £. coli (souche sélectionnée pour sa sensibilits). On rajoute & 56 mi de bouillon nutritif, $0 ml d’eau a analyser. On mélange et on rajoute 20 gouttes Pune culture jeune en eau péptonée dE, coli (au moins de 9h). Incuber & 37 °C durant 10 h (cette Stape constitue la multiplication des phages). . ~ Aprés cet enrichissement éventuel, on recherche leur présence sur un milieu solide ensemencs avec la méme souche £. cofi en déposant sur surface une goutte du milieu chanfi% a 56 °C pendant 40 mn pour détruire les gormes tout en conservant les bactériophages résistants. A l’endroit du dépét on observera aprés 5 & 6 hune zone de lyse totale ou subtotale, ga. résene de bactériophages.