CONSERVATION DES SOUCHES INDUSTRIELLES

a) Repiquages successifs

C’est la méthode la plus courante en laboratoire , on effectue des repiquages

réguliers sur gélose inclinée ou en bouillon.
- Incubation aux températures optimales de croissance
- stockage à des températures basse ( 4 à 10 °)
La fréquence des repiquages dépend de la nature e la souche et de ses conditions
de croissance
- Repiquage journalier ou hebdomadaire des souches les plus fragiles
- Repiquage bi ou tri annuels pour la majorité des bactéries ,des streptomycètes
et sporulés
Les risques du repiquage :
- contaminations
- Perte de caractères et apparition de caractères nouveaux par mutations
- Chute de viabilité
Ces risques augmentent avec le nombre de repiquages ,ex cas de Streptomyces
erythreus mutant producteur d’erythromycine, des le 4 ième repiquage 50 % des
colonies ne sporulent plus et ne produisent que que 3 % de la quantité normale
d’ ATB donc le repiquage successif est à éviter dans ce cas :
Toutefois cette méthode peut être améliorée en utilisant des milieux et des
conditions de culture qui maintiennent les spores dans un état de métabolisme
réduit ou les protège contre la déshydratation en utilisant des milieux pauvres
(terre) ,immersion sous huile minérale (huile de paraffine)

* Culture sur gélose à l’extrait de terre en culot

On prépare une gélose molle à l’extrait de terre :1 kg de terre dans 2 litres
d’eau stérilisées 1 h à 30 °c et filtrée que l’on ensemence par une piqûre
centrale. Dés que les cultures commencent à se développer les tubes sont
conservés à +4°C
 *) Stabilisation sur terre
Applicable au souches sporulées ( Pénicillium, Aspergillus, Bacillus,
Streptomyces)
D’abord il faut préparer une suspension de spores en utilisant des milieux
spéciaux
Puis préparer un mélange de 20 % terre , 78 % de sable, 2% de carbonate de
calcium à et répartir dans des tubes à raison de quelques grammes et stériliser 8
à 15 heures à 130 °c
Après refroidissement on ajoute quelques gouttes de la suspension de spores , on
évapore l’excès d’eau dans un dessiccateur sous vide . les tubes sont scellés et se
conservent plusieurs années sans germer à température ordinaire

b) Congélation
La réussite de la congélation est liée à la température de congélation, vitesse de
refroidissement , la présence d’un cryoprotecteur, la température de stockage et
la décongélation
Au cours de la congélation peut se former des cristaux de glace intra et
extracellulaire qui peuvent désorganiser les membranes et les parois cellulaires
ce qui entraîne la mort des cellules d’ou donc nécessité de l’addition d’un
cryoprotecteur tel que :
Dimethylsulfoxyde (DMSO) , glycérol, (pénètrent dans la cellule)
Polyéthylènes glycol (PEG), polyéthylènes pyrolidone (PVD) ne pénètrent pas
dans la cellule
Protéines du sang, sérum , lait

c) Lyophilisation
C’est une technique très utilisée efficace et économique pour conserver les
spores pendant des durées très longues (30 ans)
Le principe consiste en une déshydratation d’une suspension congelée de micro-
organismes par sublimation sous pression réduite .L’eau est évaporée passe de
l’état solide à l’état gazeux sans passer par l’état liquide. Les cellules
lyophilisées peuvent être conservées très longtemps si elles sont protégées de
l’o2 de l’humidité et de la lumière
Au cours de la lyophilisation les spores sont soumises à des variations extrêmes
d’environnement (congélation, dessiccation )qui vont entraîner des altérations
cellulaires variées d’ou donc le contrôle des propriétés des souches lyophilisées
est indispensable car elles peuvent perdre certaines propriétés après
lyophilisation
Conditions de réussite de la lyophilisation : l’âge de la culture est important, les
cellules doivent être jeunes et la croissance se situe entre la fin de la phase
logarithmique et le début de la phase stationnaire
Les agents protecteurs peuvent être ajoutés au milieu de lyophilisation et il
doivent avoir les propriétés suivantes :
- Caractère hydrophile pour empêcher la dessiccation totale qui dénature le
DNA
- Inertie totale : les substances utilisées : lait écrémé et albumine du sérum
ENSEMENCEMENT : LES INOCULA INDUSTRIELS
(Cas particulier des champignons filamenteux , inoculum sporal )

Au laboratoire ou en milieu industriel le principe de l’inoculation est toujours le

même :
Il faut ensemencer largement le milieu afin que la souche se développe
suffisamment pour supplanter les contaminations éventuelles
A chaque stade, il faut surveiller les contaminations , les bactériophages et les
mutations qui sont des causes de la baisse des rendements
Pour réussir une production microbiologique, le matériel vivant doit
répondre aux exigences suivantes :
Qualité :
La culture doit posséder une capacité maximale de production. Des tests de
stérilité servent à détecter la présence éventuelle de contaminants à tous les
stades de la préparation des inocula (inoculum sporal , précultures ,culture
principale).
Des prélèvement sont étalés sur des milieux gélosés ou inoculés en milieux
liquide propices au développement des divers groupes de micro-organismes.
Cette analyse est complétée par un examen microscopique.
Quantité :
Les cellules ou les spores puis les cultures de propagation doivent être en
quantité suffisante pour permettre une inoculation optimale de la culture
suivante.
La quantité de matériel d’inoculation des précultures et des cultures principales
peut influer spectaculairement sur les caractères morphologiques des cultures et
sur leur productivité. Pour chaque souche et chaque procédé la quantité
optimale d’inoculum pour les différents stades doit être déterminée.
Axénie : la souche choisie ne doit pas être contaminée tout au long du procédé
de fabrication par d’autres micro-organismes

Culture en Milieu solide

Ces milieux sont répartis dans des tubes à essai ou dans des bouteilles de Roux.
C’est le procédé habituel pour la reprise de croissance des souches et l’analyse
des populations ainsi que pour la détection des contaminants.
Parmi les milieux gélosés favorables au développement de nombreux
champignons, il est possible de citer les milieux suivant : Milieu extrait de malt
et de levure ; milieu aux flocons de pomme de terre-glucose : milieu peptone -
glucose ,
Les milieux au céréales ( riz , avoine , millet ou orge perlé) : présentent une
surface totale nettement supérieure à celle des milieux gélosés avec une
formation de spores par unité de surface du même ordre de grandeur .
Les grains sont légèrement humidifiés avec une solution nutritive favorisant la
sporulation .Après stérilisation (45 minutes à 121 °C), ces grains sont séparés
par agitation manuelle puis inoculés avec une suspension des spores préparés
dans le milieu de sporulation.
Après incubation les spores sont récupérées par addition d’un milieu de
protection et agitation intense .

Culture en Milieux liquides :

C’est la méthode idéale pour obtenir des inocula de grand volume facile à
manipuler. Cependant, beaucoup de champignons ne sporulent pas aisément en
cultures liquides agitées.
Le milieu sorbose - tryptone se révèle favorable à la sporulation de nombreux
champignons . Sa formule est la suivante : sorbose, 50 grs ; tryptone (bacto), 5
grs ; KH2PO4, 0.25 grs ; MgSO4, 7 H2O , 0.25 grs ; Ca(NO3)2,4 H2O , 0.25
grs ; KCl , 0.125 grs ; traces de Fe , Zn , Mn ; eau , amener à 1000 ml ; pH 6.2 -
6.5.
Les spores sont récupérées par filtration sur laine de verre , puis centrifugées.
Elles sont ensuite mises en suspension dans un milieu de protection et
conservées à basse température.

Inoculum Végétatif : (pré culture , culture de propagation ,pied de cuve)

Avec l’inoculum sporal sont inoculés , en Erlenmeyers , puis en bioréacteurs des
milieux de propagation permettant une germination rapide des spores et une
croissance intense des hyphes .
Les concentrations en nutriments peuvent être progressivement augmentées.
Des milieux de propagation de composition qualitative proche du milieu de
production permettant de réduire la phase de latence , et donc de diminuer les
temps d’incubation.
Généralement les milieux de propagation contiennent des substrats naturels (
extraits de malt, extraits de levure, peptone , caséine …). Voici un exemple de
ce type de milieux :
- Extraits de malt liquide , 20 grs ; extraits de levure , 4 grs ; KH2PO4 , 0.5
grs ; MgSO4, 7H2O, 0.2 grs ; eau , amener à 1000 ml ; pH , 5.8 .
Le type de milieu de propagation , les conditions d’incubation et sa durée
influent sur les taux de production obtenus dans la culture principale. Pour éviter
des retards de production dus à des « accidents » , les cultures de propagation de
faible volume sont souvent dédoublées.
RECAPITULATIF

On réalise une suspension de spores que l’on dilue et que l’on repique à la
surface d’un tube gélosé inclinée .Puis on fait un preinoculum dans un milieu
liquide en fioles Erlen meyers ou Fernbach incubés sur de agitateurs rotatifs. Il
est indispensable que le milieu choisi donne une grande quantité de spores par
fragmentation du mycélium .On passe ensuite à l’atelier dans un petit
fermenteur de 300 à 500l puis dans un fermenteur plus grand (germinateur) de
3000 à 5000l qui sert de pied de cuve

Grace à un récipient métallique mobile dénommé bazooka on ensemence

aseptiquement le fermenteur à l’aide d’air comprimé stérile dont la pression
chasse le contenu du récipient dans le fermenteur

Toute la tuyauterie est stérilisée par la vapeur.