Module 

: ichtyopathologie bactérienne et thérapies

Date  / / 2023

Nom : MEFTAH
Prénom : amira
Spécialité : aquaculture M1

TP : N°01

TITRE : isolement des bactéries à partir

d’un poisson

Plan de travail
 introduction
 Objectif du TP 
 Matériels et méthodes 
 Résultats
 Conclusion 

2022/2023
  Introduction
l’isolement est une technique permettant de séparer les micro-organismes présents dans un mélange
microbien. La technique de l’isolement présente deux applications :
- Dans le cadre d’un mélange bactérien, l’isolement est utilisé au préalable de l’étude du mélange.
L’isolement permet ainsi de séparer les différents membres du mélange et de les étudier de façon séparée.
- Dans le cadre d’une culture pure (une seule espèce), cette technique permet de vérifier sa pureté.
Certains milieux qui seront utilisés pour isoler les bactéries

Milieu De Chapman est utilisé pour l'isolement des Staphylocoques pathogènes qui donnent des
colonies jaunes par fermentation du mannitol et virage du rouge de phénol. la présence de chlorures de
sodium (7.5%) qui inhibe la plupart des bactéries à Gram négatif et à Gram positif Grâce à cette
fonctionnalité, nous pouvons sélectionner des bactéries et pour  La différenciation est basée sur la capacité à
fermenter ou non le mannitol (le seul sucre du milieu). S'il y a fermentation, cela induit une acidification qui
entraîne, à des niveaux de PH inférieurs à 6.9, une coloration jaune du milieu en présence de rouge de
phénol (indicateur de PH).
Milieu (ss) La gélose Salmonella-Shigella ou gélose SS est un milieu sélectif et différentiel pour
l'isolement des bacilles entériques pathogènes, en particulier Salmonella et Shigella .La gelose (ss) est un
milieu sélectif inhibant les bactéries à grame positif et pour Une différenciation supplémentaire reposant sur
la production d’hydrogène sulfuré (H2S) est possible grâce à la présence de thiosulfate de sodium et de
citrate de fer. Elle se traduit par des colonies noir ou à centre noir.
Milieu hektoen milieu pour l'isolement de Shigella et de Salmonella ,la gelose hektoen est un milieu
selectif par la presence de sels biliair et de colorants qui inhibe la plupart des organismes à Gram positif, ce
qui permet uniquement aux bacilles à Gram négatif de se développer sur la gélose.La forte concentration de
sels biliaires inhibe partiellement ou totalement la plupart de la flore coliforme non pathogène du tractus
intestinal ; Une différenciation supplémentaire reposant sur la production d’hydrogène sulfuré est possible
grâce à la présence de thiosulfate de sodium et de citrate de fer. Elle se traduit par des colonies noir ou à
centre noir, coloration due à la formation de sulfure de fer .
La gélose King A est utilisée pour la caractérisation des Pseudomonas par la mise en évidence de la
production de pyocianine
 La gélose King B permet la production de fluorescéine (ou pyoverdine), pigment jaune-vert fluorescent
sous lumière ultra-violette, par certains Pseudomonas. Le milieu est utilisé principalement dans l’analyse de
l’eau pour la détection et la différenciation de Pseudomonas aeruginosa qui produit ce pigment fluorescent
contrairement à certaines espèces de Pseudomonas qui n’en produisent pas.
Le dénombrement microbiologique sur milieu solide est une technique scientifique de comptage
de micro-organismes , dans ce TP on va faire un dénombrement sur un milieu GN
Milieu gélose nutritive ou gélose nutritive ordinaire ou encore gélose ordinaire est un milieu d'isolement
non sélectif . La gélose nutritive est dépourvu d'indicateur, d'agent sélectif, d'ingrédients différentiels et de
substances enrichissantes, donc utilise pour une meilleure expression de la pigmentation, test biochimique et
même pour le sérotypage.

 Objectif du TP :
 Le but de notre manipulation de denombrement est d’évaluer le nombre de bactéries
présentes dans notre echentiioln par dénombrement de la flore totale après en les cultivant
sur le milieu GN
 Le but des techniques de numération (ou dénombrement) est de déterminer la concentration
en bactéries contenues dans une préparation initiale. Elles nécessitent une ou plusieurs
dilutions décimales (au dixième).
  Matériels et méthodes :
les matériels utilisé
 Echantillon serdine  agitateur
 Milieux de culture  ciseaux
 Etaloir +ance  tube en verre
 eau distillé  6 tubes à essai et porte-tubes
 étuve  Micro pipette Pipettes
 bec benzen
Les étapes de manipulation
 Nous prenons une sorte de poisson par exemple la sardine et on fait la dissection et on prélève le tube
digestif ( la présence des flore)
 On prépare la solution mère apartir des organe qui on obtenue de poisson ( on les bien ecrasse ) et on
ajoute l’eau physiologique l’eau peptoné ou bien solution de renger

 A partir de ce tube (solution mère ) on a fait notre ensemencement ou bien l’isolement dans des milieu
spécifique
 On a pris 5 différent milieux culture
 Dans Milieu SS (milieu selectif)  on a pris 0.1 ml de la solution mère et on l’a mis au centre de la boite
de pétrie et avec un étaloire on a étalé sur toute la surface de la boite après on a mis dans l’étuve à 25°C
- 37°C pendant 24heures à 48heures.
 Dans Milieu Chapman  on a pris 0.1 ml de la solution mère et on l’a mis au centre de la boite de pétrie
et avec un étaloire on a étalé sur toute la surface de la boite après on a mis dans l’étuve à 25°C - 37°C
pendant 24heures à 48heures
 Dans Milieu Hektoen on a pris 0.1 ml de la solution mère et on l’a mis au centre de la boite de pétrie et
avec un étaloire on a étalé sur toute la surface de la boite après on a mis dans l’étuve à 25°C - 37°C
pendant 24heures à 48heures
 Dans Milieu king A et milieu king B on a pris 0.1 ml de la solution mère et on l’a mis au centre de la
boite de pétrie et avec un étaloire on a étalé sur toute la surface de la boite après on a mis dans l’étuve à
25°C - 37°C pendant 24heures à 48heures
 D'autre part, on fait la dilution pour le dénombrement

on a réaliser une dilution a partir de la solution mère

on a pris 5 tubes d’essai et on a prélève 1ml de la solution
mère on a mis dans le premier tube et on complet avec
l’eau distillé puis on a pris &ml de premier tube
on le mis dans le deuxième tube et on complet
avec l’eau distillé ainsi de suit

 Puis De chaque dilution on prélève 0,1 ml et on ensemence une boite de Petri avec un milieu de culture
(gélose nutritive) puis on étale le prélèvement (0,1ml) avec un râteau. On laisse quelques minutes puis on
incube dans un incubateur à 30° C pendant 24H
  Resultat
Milieu chapmane
Les staphylocoques aureus forment des colonies pigmentées, entourées d’une auréole jaune due à la
fermentation du mannitol. Les staphylocoques non pathogènes forment en général de petites colonies rouges
qui ne modifient pas la teinte du milieu.
le changement de couleur du milieu démontre la fermentation du mannitol, PAS la couleur de la
colonie.
- Plusieurs espèces de Staphylococcus autres que S. aureus sont positives au mannitol et produisent des
colonies de couleur jaune entourées de zones jaunes.
Milieu ss
Les colonies lactose-négatives sont incolores. Les colonies lactose-positives sont roses à rouges. Les
colonies produisant du H2S ont un centre noir..
Si nous apparaissons:
 Colonie incolore Cela signifie là: Shigella spp. et Salmonella spp. non productrices de H2S.
 Colonies à grands centres noirs à périmètre clair Cela signifie là: Salmonella spp. productrice de
H2S.
 Colonies translucides, plus petites que Salmonella, à centre noir. Cela signifie là: Proteus
 Partiellement ou totalement inhibée Gram positif
Milieu hektoen
La fermentation d'au moins un des sucres se traduit par une coloration "saumon / jaune / orange" des
colonies. L'absence de fermentation se traduit par une coloration bleue ou verte des colonies. La production
d’hydrogène sulfuré (H2S) est caractérisée par des colonies noir ou à centre noir
Si nous apparaissons:
 Grande taille, de couleur jaune à saumon, inhibition possible de certaines souches E. coli
 Taille variable, de couleur bleu-vert à bleue ou saumon, la plupart des souches étant de couleur noire au
centre ou sur toute leur surface Proteus
 De couleur bleu-vert à bleue, la plupart des souches étant de couleur noire au centre ou sur toute leur
surface .Tous les sérotypes de Salmonella ont cet aspect sur gélose HE à l'exception du sérotype Typhi,
qui est un faible producteur de H2S, et de rares souches de Salmonella fermentant le lactose. Salmonella
 Couleur verte, humides shigella
 de couleur verte à marron pseudomonase
 la croissonce des bacteries a gram positive tres faible ou bien nulle
milieu kig A et B
Pseudomonas aeruginosa, autrement connu sous le nom de bacille pyocyanique, , bacille du pus bleu , est
une bactérie gram-négative du genre Pseudomonas. Les bacilles sont fins, droits et très mobiles grâce à
un flagelle polaire : ciliature monotriche, dépourvus de spores et de capsules. Ils apparaissent la plupart du
temps isolés ou en diplobacilles
Le milieu GN
Après incubation, on ne considère que les boites de GN où on peut compter facilement le nombre de
colonies apparues. Pour une même dilution, on refait plusieurs essais, pour avoir un nombre moyen et
augmenter la précision du dénombrement. Parmi les boites comptables on ne considèrera que la boite qui a
donné un nombre de colonies compris entre 30 et 300 colonies. Si le nombre est inférieur à 30, il n’est pas
statistiquement significatif. Si le nombre est supérieur à 300, on risque de sous-estimer le nombre de
bactéries du fait qu’il peut y avoir une compétition entre ce grand nombre de bactéries vis à vis des éléments
nutritifs disponibles et vis à vis de l’espace et par la suite une inhibition d’une bonne proportion de cellules
au niveau de la boite. Après avoir choisis la boite on dénombre les colonies puis on applique la formule
suivante : N=n x 1/D x 10 UFC/ml N le nombre dans la solution mère ; n le nombre des colonies compté sur
la boite ; D : facteur de dilution ; 10 volume ensemencé 0,1ml L’unité utilisée est l’Unité Formant Colonie
(U.F.C.) : c’est une unité plus précise que l’unité bactéries/ml dans ce cas. Car on compte le nombre d’unités
qui forment des colonies, quelque fois, plusieurs bactéries côte à côte pouvant donner une même colonie. Il
est donc plus exact de parler du nombre d’unités formant colonies que de nombre de bactéries
Conclusion :