Travaux pratiques de Microbiologie

TP N° 4 : L’isolement à partir de différents

écosystèmes
 Les règles à suivre lors des séances de TP de Microbiologie
• Port de la blouse est de rigueur. La blouse en coton doit être boutonnée
•Nouer les cheveux longs (risque de brulure au contact de la flamme du bec
Bunzen)
•S’asseoir pour manipuler et pour observer au microscope
•Se laver les mains. Désinfecter la paillasse
•Eviter les courants d’air, limiter les déplacements, éviter de parler (Aucun
pipetage à la bouche)
•Ne pas porter ses doigts ou tout objet à sa bouche. Ne pas manger, boire,
fumer
•Eviter de mettre tout objet personnel en contact avec les bactéries
•Marquer soigneusement les lames, tubes, boites de Pétri etc. avec un feutre
indélébile
•Les manipulations seront faites dans un rayon de 10 cm autour de la
flamme du bec Bunzen
•Ne pas éteindre la flamme sans couper l’arrivée du gaz
•Ne pas laisser à proximité de la flamme des objets ou liquides
inflammables (papiers, alcool, etc..)
•A la fin des manipulations, les paillasses sont désinfectées à l’eau de javel
 INTRODUCTION

L’isolement permet d’obtenir des cultures pures

indispensables à toute identification bactériologique dont il
est la première étape.
Les techniques de sélection et d’isolement permettent
d’isoler un germe donné à partir d’un milieu complexe, de
séparer des germes différents au sein d’un mélange
microbien, de purifier une souche contaminée, de faire
l’étude quantitative et qualitative de la flore d’un
échantillon.
Le but final est l’obtention de souches pures qui pourront
alors être identifiées, étudiées et éventuellement comptées.
Définition/Principe de la technique

L’isolement consiste en un ensemencement microbien effectué dans un

but de séparation, de façon à obtenir des colonies nettement distinctes. Il
est réalisé pour :
L’obtention de cultures pures indispensables à toute étude et
identification bactériologique ou fongique.
 L’étude morphologique et macroscopique des colonies isolées.
Le contrôle des cultures.
 Objectif/But du TP

Différents isolements sont réalisés à partir de différentes

denrées alimentaires, eau de source, air, surface des
toilettes, mains avant et après désinfection, cheveux, bouche
afin de déterminer les microorganismes présents sur ces
écosystèmes sur le plan qualitatif et quantitatif.
 Matériels/Verreries/Produits/Consommables
Matériels Produits

•Boites de Petri • Milieux de culture bouillon et

•Micropipettes géloses : PCA, VRBL, BLBVB,
•Embouts jaunes et bleus stériles Rothe, Chapman
Bec bunsen •Eau physiologique
•Ecouvillons
•Etuve à 30 et à 44°C •Échantillons : eau de source, lait,
•Balance. viande hachée, yaourt
•Cloches de Durham
Protocole/mode opératoire
Suspension mère et dilutions décimales :
 Denrées alimentaires :
Introduire aseptiquement 1g de viande hachée ou de yaourt dans 9ml
d’eau physiologique. Cette suspension constitue la solution mère et
correspond à la dilution 1/10.
Prélever et introduire aseptiquement à l’aide d’une micropipette 1ml
de la solution mère dans un autre tube contenant au préalable 9ml
d’eau physiologique, cette dilution est alors de l’ordre de 1/100.
Répéter cette opération jusqu’à l’obtention de la dilution 1/100 000
soit 10-5.
 Eau de source et lait :
Prendre une quantité d’eau de source ou de lait dans un tube à vis
stérile, cette solution correspond à la solution mère. Suivront ensuite
les dilutions décimales de la même manière que dans le cas des
denrées alimentaires, tout en considérant la solution mère à 1, la
première dilution sera donc 1/10.
Remarque :
Au moment de la réalisation des dilutions décimales, il est
impératif de changer d’embout entre chaque dilution.
Contrairement à cela, lors de l’ensemencement, il est
recommandé de commencer par la plus haute dilution dans le
but justement de ne pas changer d’embouts.
Isolement à partir des denrées alimentaires
 À partir des dilutions décimales de 10 -5 à 10-1, porter aseptiquement 0.1ml de
chaque dilution et les déposer sur les boites de Petri (VRBL pour la recherche
des coliformes, Chapman pour les staphylocoques) préparées à cet usage et
numérotées. La suspension est alors étalée de façon homogène sur la surface au
moyen d’un étaloir. C’est un ensemencement en surface.
 La gélose VRBL sera ensemencée en double pour chaque dilution car :
La première série de boites sera incubée à 30 ou 37°C et sera réservée à la
recherche des coliformes totaux.
La deuxième série de boites sera incubée à 44°C et sera réservée à la recherche
des coliformes fécaux.
 Le milieu PCA sera ensemencé en profondeur. Pour cela, à partir des dilutions
décimales de 10-5 à 10-1, porter aseptiquement 1ml de chaque dilution dans une
boite de Petri vide préparée à cet usage et numérotée.
Compléter ensuite avec environ 15ml de gélose PCA fondue et refroidie à 45°C,
faire ensuite des mouvements circulaires et de va et vient en forme de 8 pour
bien mélanger la gélose à l’inoculum.
Laisser solidifier les boites sur la paillasse puis couler à nouveau environ 5ml de
la même gélose, cette double couche à un rôle protecteur contre les
contaminations.
 Isolement à partir de l’eau :
Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles totaux

À partir des dilutions décimales de 10-5 à 10-1, porter aseptiquement

1ml de chaque dilution dans une boite de Petri vide préparée à cet
usage et numérotée.
Compléter ensuite avec environ 15ml de gélose PCA fondue et
refroidie à 45°C, faire ensuite des mouvements circulaires et de va et
vient en forme de 8 pour bien mélanger la gélose à l’inoculum.
Recherche et dénombrement des coliformes totaux en milieu liquide
(technique du nombre le plus probable NPP)
Les coliformes totaux : entérobactéries (bacilles à Gram négatif,
oxydase (-), aéro-anaérobie, fermentatives du glucose, peu exigeantes,
nitrate réductase (+)) lactose (+) et gaz (+) à 30 °C.
La recherche de ces germes se fait sur le Bouillon Lactosé Bilié au
Vert Brillant BLBVB qui est sélectif des bactéries intestinales et qui
permet de détecter la fermentation du lactose chez les entérobactéries
avec production de gaz emprisonné dans la cloche de durham.
Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif
BLBVB à raison de trois tubes par dilution.
À partir de la solution mère ou des dilutions décimales porter
aseptiquement 1ml dans chacun des trois tubes correspondant à une
dilution donnée. Bien mélanger l’inoculum dans le milieu, incuber 24h
à 30°C.
Le nombre de coliformes totaux est exprimé par le NPP selon la table
de Mac Grady.
 Recherche des Streptocoques fécaux « D »
 Ce test se fait en ensemençant 1ml de chaque dilution dans le
bouillon de Rothe. L’incubation se fait à 37°C pendant 24h. Sont
considérés comme positifs les tubes présentant un trouble microbien.
Isolement à partir des autres échantillons :

Cheveux : à l’aide d’un pince stérile un cheveu est enlevé et déposé

sur la gélose auprès du bec bunsen.
Bouche : un prélèvement est réalisé à l’intérieur de la bouche à l’aide
d’un écouvillon stérile.
Mains : la boite de Petri contenant le milieu de culture est divisée en
trois secteurs, le premier sert à une empreinte du pouce ou de l’index
avant lavage, le deuxième une emprunte du même doigt après lavage à
l’eau, la troisième après lavage avec l’eau de javel.
La surface des toilettes : un prélèvement est réalisé au niveau du
siège de toilette à l’aide d’un écouvillon stérile.
L’air : deux boites de Petri sont utilisées, une est ouverte à l’intérieur
du laboratoire pendant 20 à 30 min et une autre à l’extérieur, à fin de
faire une comparaison.
Remarque :
Une fois ensemencée et refermée, les boites de Petri
doivent être immédiatement retournées (couvercles
en bas) et restent ainsi que ce soit à l’étuve ou sur la
paillasse : l’eau de condensation à la face inférieure
du couvercle, retombe à la surface du milieu,
transformant l’isolement en une nappe inutilisable.
Résultats/Analyses
Les germes aérobies mésophiles totaux : les colonies se présentent
sous forme lenticulaire en masse. Il s’agit de compter toutes les
colonies ayant poussé sur les boites en tenant compte des facteurs
suivants :
Ne dénombrer que les boites contenant entre 30 et 300 colonies.
Multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution.
Faire ensuite la moyenne des colonies entre les différentes dilutions.
Les coliformes totaux : apparaissent en masse sous forme de petite
colonie de couleur rouge foncé et de 0.5mm de diamètre,
fluorescente. La fluorescence de ces colonies est mise en évidence
lors de leur observation sous une petite lampe à UV dans une
chambre noire.
Les coliformes totaux sur BLBVB : le test est considéré positif s’il
y’a formation d’un trouble + gaz dans la cloche de Durham.
Les autres échantillons : dénombrer les boites qui contiennent plus de
30 colonies.
Conclusion
A la fin du TP l’étudiant sera capable d’effectuer une
analyse microbiologique de n’importe quel échantillon
solide ou liquide (échantillonnage, prélèvement, dilutions,
isolement, dénombrement).