SEANCE1 

Application 1 : Stérilisation

La stérilisation est une technique destinée à détruire tout germe microbien dans une
préparation . La première technique a consisté à porter cette préparation à haute
température .
Matériels :
Bec Bunsen,gélose nutritive en boite de pétri et un anse de stérilisation
1-stérilisation par flambage :
Une boite de Pétri contenant de la gélose nutritive sera ensemencée sur sa moitié avec anse
non stérile et l’autre moitié sera ensemencée après
Observation :
On observe que la moitié de la boite de Pétri ensemencer par l’anse non
stérile contient des colonies, par contre l’autre moitié qui est ensemencer NS R
par l’anse stérile ne contient pas des colonies

Conclusion :
Donc on peut utiliser le flambage pour stériliser les matériels utilisés dans les laboratoires

2-stérilisation par chaleur humide

De la même manière sur une boite divisée en deux premièrement on
ensemence avec l’ose à partir d’une solution bactérienne non autoclavée la
moitié de la boite de Pétri et après autoclavage à 120 C pendant 30 min on
ensemence la deuxième partie NA A
Observation :
Dans la partie de la boite autoclavée il n’y a pas de présence de colonies
bactériennes mais dans la partie non autoclavée on remarque la présence de
différentes colonies
Résultat :
L’autoclavage est une moyenne efficace pour la stérilisation des suspensions

3-stérilisation par filtration

On parle de stérilisation par filtration  lorsque l'objectif premier de la microfiltration
mise en œuvre est d'éliminer les micro-organismes. La filtration stérilisante possède
un intérêt particulier pour les produits renfermant des molécules thermosensibles qui
ne peuvent subir de stérilisation par la chaleur
Application 2 : Transvasement stérile

Dans un milieu stérile, on transvase la moitié d’un bouillon nutritif (5ml) dans un autre
tube vide
Observation
On remarque aucun trouble dans les deux tubes
Conclusion :
À l’aide du transvasement stérile on peut transvaser les bouillons nutritifs d’un milieu
à un autre sans les contaminer

Application 3 : les méthodes d’ensemencement

Dans une boite de Pétri :
Dans une grande boite de pétri partagée en 4 et numéroté de 1 à 4 (méthode de
quatre quadrants ). Avec une anse stérile on prend une suspension de bactérie et on
fait des stries dans (1,2) et on stérile l’anse un peu puis passant à la partie (3) puis
en tournant à la dernier partie(4) , les stries doivent êtres de différentes direction
dans toutes les parties .
Résultat :
On remarque des stries de colonies qui se situent suivent nos stries sur la boite de
Pétri

Dans une gélose inclinée :

On ensemence d’une façon spiralée commençant de fond vers l’extérieure
Résultat:
on a obtenu des bactéries isolée dans cette gélose inclinée

Application 4: les contaminants des différents biotopes

on prend des plusieurs prélèvement de plusieurs milieux (cheveux ,peau ,main milieu
intérieur et extérieur )
Résultat :
Après quelques jours on remarque l’apparition des colonies bactériennes cela
indique que ce milieux sont très riche en microorganisme

Séance 2 :

Application 1 : détermination de type respiratoire

Pour définir le type respiratoire d’une bactérie on utilise le milieu VF (viande foie) qui
a été régénéré et coulé en tubes profonds.

Protocole expérimental

• Ensemencer a la pipette Pasteur boutonnée, plongée jusqu'au fond puis remontée

en décrivant une spirale serrée.

• Laisser les tubes jusqu'au lors solidification.

• Incuber a 37°C pendant 1 a 7 jours.

Résultats et interprétation :
Pendant notre TP et après la manipulation nous avons trouvé 2 résultats :

- La 1 ère : toute la culture se situe seulement en surface : Bactérie aérobie 4 E. Coli.

- La 2 ème : la culture se situe sur toute la hauteur : Bactérie Aero anaérobie ^

Staphylococcus.

Application 2 : Recherche de la catalase

La catalase est une enzyme présente chez les germes de la famille des
(Staphylococcus et Micrococcus) et absente chez les germes de la famille des
Streptococcaceae.
La recherche de la catalase est particulièrement intéressant pour faire la distinction
entre ces
germes qui sont tous des Gram + .

Protocole Expérimental

Sur une lame de verre contenant une goutte d'eau oxygénée, quelques colonies de
germes sont déposées.

Résultats et interprétations

On remarque le dégagement de bulles de gaz ce qui est indiqué que le test est
positif est que notre germe est catalase +
Application 3 : Recherche de l’uréase

Ce test permet de mettre en évidence une enzyme qui décompose l'urée.

L’hydrolyse de l'urée s'accompagne d'une alcalinisation du milieu de culture par

accumulation d'un des produits de la réaction : l’ammoniaque. L’augmentation de pH
est visualisée par le virage du rose-saumon au rouge de l’indicateur colore contenu
dans le milieu de culture.

Protocole expérimental

-Ensemencer 1 tube a hémolyse contenant 3 a 4 gouttes du milieu urée de Stuart

avec
une suspension très dense de la bactérie étudiée.
- Placer au bain-marie a 37°C pendant une nuit.

Résultats et Interprétations

E. coli * un changement de couleur Staphylococcus

Pas de changement signifie que E. coli est uréase + de couleur signifie que Staph
est Uréases -

Application 4: Recherche de lipase

Les lipides sont des esters acides gras a poids moléculaire élevé. La cellule
bactérienne, comme toutes les cellules vivantes contient des lipides. Les enzymes
microbiennes qui les dégradent (lipase) transforment le substrat en 2 composants,
acide gras et alcool.
Une réaction positive se traduit par un halo opaque autour des colonies, du a la
précipitation des acides gras.

Protocole Expérimental

Ensemencer chaque germe en touche de 0.5 cm de diamètre une boite de Pétri

contenant un milieu gélose, additionne d'une dizaine de gouttes de Tween80 (ester
du sorbitol et d'acide gras).
Résultats et Interprétation

Présence d'un halo autour du zone d’ensemencement signifie que notre germe
est Lipase + .

séance 3 :

Application 1 : Obtenticn d’une culture pure a partir dun melange de

bac terie

Les cultures bactériennes peuvent contenir un mélange de plusieurs bactéries, qu'il

est nécessaire de séparer avant toute identification. L’obtention de colonies isolées
ou isolement, n'est réalisable en pratique qu'en milieux solides.

Les Milieux a ensemencer :

S Gélose ordinaire (TSA) : ce milieu va permettre la croissance simultanée de

Escherichia coli et de Staphylococcus. Par contre, les milieux sélectifs vont
favoriser sélectivement la croissance de l’un ou de l’autre germe.

S Gélose de Mac Conkey : La gélose Mac Conkey est un milieu sélectif pour
l’isolement des entérobactéries. En effet, elle contient des agents sélectifs qui
freinent le développement des bactéries a Gram positif : cristal violet et sels
biliaires. Ce milieu nous permet a recherche de Salmonella, Shigella et ECEP
(Escherichia coli entomopathogènes) dans les selles.

S Gélose Chapman : est un milieu sélectif, surtout utilise en microbiologie médicale,

permettant la croissance des germes halophiles. Parmi ces germes figurent au
premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus,
les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries a Gram négatif.

But :

Mise en évidence l’importance des constituants des milieux nutritifs dans la sélection
de certains bactéries et l’élimination d’autre.

Protocole expérimentale :

Prélever une goutte de la suspension a l’aide d’une anse. Étaler cette goutte par des
stries successives a la surface de la gélose contenue dans une boite de Pétri ; au fur
et à mesure la charge bactérienne diminue sur l'anse. Le nombre de germes dépose
est de plus en plus petit.
Mettre une nuit a 37°C.

Résultats et interprétation :
On remarque croissance bactérienne une niveau du trajet d' ensemencement on
peut pas faire un examen macroscopique parce qu'on pas des colonies isoles. Mais
d'après la nature des constituants de milieu on suppose que le type de bactérie est
E .C une autrefois on remarque un croissance bactérienne au niveau du zone
d' ensemencement, ce sont des colonies ronde, opaque jaunes et parfois blanches ,
donne ses derniers sont des staphylococcus.

Application2: examen sans coloration Examen à l’état frais:

Permet l’observation des microorganisme et des mettre en évidence de la mobilité

des cellules et leur mode de groupement Mode opératoire: 1. à la surface d’une lame
on pose un goute de suspension de culture en milieu liquide 2. Mettre la lamelle sur
la goute disposé de la paraffine au 4 points de lamelle Remarque: - éviter les bulbes
d’aire les suspensions ne doit pas déborder sur les côtés -Pour observer la mobilité ,
on utilise l’objectif 40 -On doit prendre garde à ne pas détruire les flagelles Résultat
on observe les bactéries sous formes de Cocci qui bougent Examen après coloration
: Se fait par 3 étapes: 1. Réalisation des frottis 2. Coloration de gram 3. Observation
au microscope Permet de mettre en évidence la forme ou la présence de certains
organites comme noyau ,spores et flagelles

Réalisation du frottis: C’est un étalement par monocouche des bactéries sur la lame
-on étalent avec l’anse d’un mouvement circulaire de façon a obtenir un étalement
mince -on le laisse sécher a proximité du Bee Bunsen -enfin on effectue la coloration
désirée Coloration au bleu de méthylène Cette coloration donne des informations
concernant la morphologie -on versent le colorant, laisser coller(2min) on le lave par
l’eau, le sécher et on l’examine par microscope (×100) RESULTAT Cette coloration
donne des bactéries colorées en bleu sombre permet seulement l’étude des
bactéries
Remarque :
C’est nécessaire de la compléter par une coloration de gram Coloration de gram
C’est la base de l’identification ou d’une souche bactérienne elle se fait en plusieurs
étapes permet d’apprécier la bactérie Gram+ des bactéries Gram- -on versent

successivement en avant ou en arrière du frottis:- violet de gentiane -lugol-

décoloration(Alcool) -coloration a la fushene

Résultat
Bactéries Gram- (E.C) =Rose ;Bactéries Gram+(S) =Violet
Description on de la morphologie bactérienne après coloration Selon la forme on distingue:
✓les cocci Gram+ ✓Peuvent être isolée ou regroupés ✓Diplocoque ✓En chainettes ✓En
amas ✓Conclusion ✓Les colorations usuel

Application2: Examen macroscopique et identification des

microorganismes

Permet d’examiner les préparations a l’œil nu on cherchant les colonies isolées pour
identifier les microorganismes -on peut avoir deux milieux d’études: liquide ou gélose Dans
un milieu liquide On a 2 aspects I. Milieu trouble (intensité -dépôt ou non au fond de tube) II.
Milieu clair (le fond de tube-comparaison avec milieu non ensemence) Dans un milieu gélose
Il faut observe les colonies isolées ou utilisant soit la lumière soit avec appareil de lecture de
colonies ensuite on fait la description des colonies

Observation
•la taille: -D<D3mm ------ »grande
•la forme :les 4types de colonies qu’on peut rencontrer en général
•La surface : Lisse avec bord régulier: colonie type S Rugueuse bord irrégulier : type
R Muqueux : colonie type M

•Couleur de pigment: Variable en fonction de nature de bactérie et de milieu de

culture