4.techniques D'encemencement, D'isolement Et de Numération Des Microorganism 103348

Techniques d’ensemencement, d’isolement et de numération des
microorganismes
Dr Harzallah B.
Techniques d’ensemencement
L'ensemencement consiste à beurrer un milieu nutritif solide ou à inoculer un milieu

liquide en vue d'obtenir une culture microbienne abondante.

Un ensemencement consiste à introduire des microorganismes (bactéries, levures et

moisissures) dans un milieu de culture (typiquement dans une boîte de Pétri en
microbiologie).


microbiologie).
La technique d’ensemencement complet vise à favoriser la multiplication des

microorganismes sur un milieu nutritif lorsqu‘ils proviennent d'un milieu à faible
concentration.


microbiologie).
La technique d’ensemencement complet vise à favoriser la multiplication des

microorganismes sur un milieu nutritif lorsqu‘ils proviennent d'un milieu à faible
concentration.
Il suffit ensuite de prélever les microorganismes sur la gélose ensemencée afin de

poursuivre leur étude.
Les microorganismes sont ensemencés à l’aide d’une anse ou une pipette Pasteur
Ensemencement avec une anse
Ensemencement avec une anse
Ensemencement avec la pipette Pasteur
Ensemencement avec la pipette Pasteur
Selon le conditionnement, on utilisera différentes méthodes d’ensemencement

Techniques d’isolement et de purification
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d’en faire une
culture pure.
culture pure.
L'isolement est une technique qui permet de séparer les microorganismes d'un
échantillon.
culture pure.
L'isolement est une technique qui permet de séparer les bactéries d'un échantillon.
L'isolement permet l’obtention des colonies isolées, espacées les unes des autres.
culture pure.
L'isolement est une technique qui permet de séparer les bactéries d'un échantillon.
L'isolement permet l’obtention des colonies isolées, espacées les unes des autres.
L'isolement permet l’obtention des cultures pures d’une espèce microbienne.

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement simple par stries multiples

Autre méthode d'isolement

La méthode des cadrans est la plus classique. Elle consiste à diviser une boîte de Pétri
en deux (50 % et 50 %).
La méthode des cadrans est la plus classique. Elle consiste à diviser une boîte de Pétri en deux
(50% et 50%).
Puis de diviser de nouveau par deux une moitié afin d'obtenir 3 cadrans de 50%, 25% et
25%.
(50% et 50%).
Puis de diviser de nouveau par deux une moitié afin d'obtenir 3 cadrans de 50%, 25% et 25%.
Sur le plus grand cadran une petite quantité d'inoculum est posée puis étalée. Ensuite on
retourne la boîte afin d'étaler les bactéries sur un cadran plus petit.
(50% et 50%).
Puis de diviser de nouveau par deux une moitié afin d'obtenir 3 cadrans de 50%, 25% et 25%.
Sur le plus grand cadran une petite quantité d'inoculum est posée puis étalée. Ensuite on
retourne la boîte afin d'étaler les bactéries sur un cadran plus petit.
Puis on retourne afin d'ensemencer le dernier petit cadran.

Les stries doivent être serrées et la pipette ou l'anse de platine doit être flambée entre
chaque cadran pour de meilleurs résultats.
Les stries doivent être serrées et la pipette ou l'anse de platine doit être flambée entre
chaque cadran pour de meilleurs résultats.
Il est aussi recommandé de ne pas passer deux fois au même endroit et de ne pas trop
revenir "en arrière" lorsque l'on fait pivoter la boîte, sinon l'anse risque de se
surcharger et l'isolement sera moins réussi.

• Dépôt initial de la souche près d’un bord d’une boîte de gélose adaptée à l’espèce désirée.
• Etalement de ce dépôt en réalisant des stries serrées sur environ 1/3 de la boîte.
• Stérilisation de l’instrument d’étalement.
• Etalement d’une partie des stries précédentes, après avoir fait tourner la boîte d’environ
50°.
• Répétition des deux étapes précédentes 2 fois.
• Faire un Z final vers le centre de la gélose.

Une méthode toute simple qui consiste à déposer l'inoculum à la périphérie de la boîte et
à l'étaler vers le bas en stries serrées.

Autre méthode d'isolement
On étale les microorganismes à la périphérie de la boîte de Pétri, puis on les étale vers
le centre de la boîte. Il est important de ne pas aller trop loin dans la périphérie lors du
balayage du centre. Cette méthode demande plus de technique que la première.
Ensemencement en tapis (pour antibiogramme ou lysogramme)
• On réalise dans un premier temps une dilution appropriée

de la souche à tester ;
• On inonde ensuite la boîte de gélose avec cette dilution.

On laisse reposer quelques minutes ;
• On aspire ensuite tout le liquide présent à l’aide d’une

pipette Pasteur ;
• On laisse sécher 15 minutes à l’étuve ou près du bec de

gaz, boîte légèrement ouverte ;
• Ensuite, on dispose soit les disques d’antibiotique

(antibiogramme), soit les solutions de bactériophages.
Dénombrement des microorganismes
Dénombrer les microorganismes = donner le nombre de microorganismes par unité

de volume, très souvent par ml de culture analysée.

Deux types de méthodes : directes et indirectes (après culture).


Deux types de méthodes : directes et indirectes (après culture).
Microorganisme + éléments nutritifs (C , N, O2, etc.) = Biomasse cellulaire +

Produits.
Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

*Mesure du nombre des microorganismes :
- Estimation du nombre le plus probable (NPP).

- Dilution et dénombrement en milieu de culture solide.

*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :
La biomasse peut être évaluée par pesée du poids sec après filtration et séchage ou
par mesure de la Densité du trouble (DO au spectrophotomètre).

*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :
La biomasse peut être évaluée par pesée du poids sec après filtration et séchage ou
par mesure de la Densité du trouble (DO au spectrophotomètre).
*Mesure de l’activité des microorganismes :
En suivant la cinétique de disparition d’un substrat ou celle de l’apparition d’un

produit final.
Dénombrement après filtration sur membrane

• Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou

injectables...), les microorganismes sont à une concentration très faible (voire
nulle si le produit est stérile).

• Leur dénombrement (rendu en UFC par unité de volume) impose donc de

«concentrer les microorganismes » pour pouvoir compter des colonies.

• Leur dénombrement (rendu en UFC par unité de volume) impose donc de

«concentrer les microorganismes » pour pouvoir compter des colonies.
• Cette « concentration » se fait grâce à la filtration d’un grand volume de

produit sur une membrane retenant les microorganismes.
• La membrane filtrante a des pores d’un diamètre de 0,45 µm dont la disposition

selon un réseau en trois dimensions permet de retenir à sa surface les bactéries.
• En effet le diamètre des pores du filtre est inférieur à celui des bactéries
classiquement rencontrées.
• Il existe aussi des membranes de porosité de 0,22 µm pour retenir les bactéries
les plus petites, des bacilles très fins qui pourraient se faufiler dans le maillage
de la membrane de 0,45 µm (cas de Pseudomonas aeruginosa) ou encore des
spores.
Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide

(Méthode dite du nombre le plus probable)
Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans
un milieu de culture liquide conçu pour permettre la croissance d’un microorganisme
ou de groupe de microorganismes.
La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement,

une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré, dégagement de gaz,
etc.).
Méthode de dénombrement des microorganismes en milieu liquide

(Méthode dite du nombre le plus probable)
cette méthode est une estimation statistique du nombre de microorganismes

supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire.
L’estimation de la densité microbienne est obtenue par application du principe de

vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs
dilutions successives de la suspension bactérienne originelle dans des milieux de
cultures liquides.
Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif.

En déduire la concentration en microorganismes par ml de produit N.
NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture de la table de Mac Grady ;
k= facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre

caractéristique 10-2 ;
V inoculum= 1 ml.
N =15. 102 microorganismes / ml

Dénombrement en milieu solide (masse et surface)

Le comptage des UFC ne doit pas être réalisé au hasard.
Il est conseillé de délimiter des ensembles au marqueur sur le fond de la boîte de Pétri toutes les 20 UFC
comptées ou de séparer par quartier en marquant une croix au dos de la boîte.
Il faut que le nombre d’UFC soit significatif entre 30 et 300 (ou 150 en cas d’agent de différenciation des
colonies).
Cet intervalle est défini pour éviter des erreurs de contaminations extérieures pour un nombre d’UFC
assez faible.
Et on définit un seuil afin de faciliter le dénombrement des boites et d’éviter les erreurs de comptage.
La lecture des résultats doit être cohérente en prenant en compte

• Les inter et extra-dilutions.
• On prend la dilution pour laquelle il y a le moins d’incertitudes en prenant la moyenne de la totalité des
boîtes de la dilution.
Les avantages du dénombrement en milieu solide sont qu'ils sont simples à réaliser en prenant les
précautions relatives aux dilutions plus particulièrement.
L'analyse des bactéries de contamination se repère facilement, ainsi on peut les déduire du comptage, bien
sûr lors des contaminations mineurs.
Les inconvénients sont la multitude de boîtes à gérer, ainsi lors d'analyses de nombreuses boites, il faut
travailler méthodiquement.
Le calcul d'UFC se fait ainsi (avec : V = volume de dilution ; N = nombres de colonies ; F = facteur de
dilution).
•UFC=N/(V*F).
Dénombrement en milieu solide (masse et surface)

Détermination de la concentration cellulaire avec le spectrophotomètre
Le spectrophotomètre mesure la proportion de lumière absorbée par la solution.
Plus il y a de cellules, plus il y aura de lumière absorbée par elles donc moins il y aura
de lumière qui traverse la solution.
Il faudra d'abord construire une courbe étalon pour établir une relation entre
cette absorbance et la concentration de cellules, puis il suffira de reporter la
valeur mesurée dans la suspension inconnue pour déterminer sa concentration.


Détermination de la concentration en cellules dans une culture
- Prélever un échantillon de la culture.
- En fonction de son aspect, faire éventuellement une dilution (comparer avec

les cuvettes ayant servi à construire la droite d'étalonnage).
- Mesurer l'absorbance de l'échantillon.
- Reporter l'absorbance mesurée sur la droite et lire la concentration sur l'axe

des abscisses.
- Corriger la dilution éventuelle du prélèvement.


Faire un comptage sur lame de numération
Le comptage direct des cellules se fait au microscope à l’aide d’un hématimètre

appelé lame (c’est une lame munie au centre d’un quadrillage de dimensions bien
déterminées).
Les lames de numération sont des lames quadrillée où chaque case correspond à
un certain volume.
On compte le nombre de cellules par case.
Le volume étant connu, on peut calculer la concentration.
Pour un résultat plus sûr, on comptera le nombre de cellules dans plusieurs cases
afin de calculer une moyenne.
Les cellules qui se trouvent à cheval sur deux cases sont comptées dans une case
quand elles se trouvent sur le côté supérieur ou le côté droit de cette case.
En cas de comptage trop difficile, il pourra être nécessaire de faire une dilution.
En général pour liquides à forte densité cellulaire (sang) : cellules (ou hématimètres)
de Malassez ou de Thoma.
Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une
chambre de comptage de volume connu.
C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage :
Pour obtenir une numération proche de la réalité, il est important de :

• ne pas rayer le quadrillage lors du nettoyage de la cellule,
• bien monter la lamelle sur la cellule,
• déposer la goutte de l’échantillon à énumérer correctement,
• bien laisser sédimenter les particules à énumérer avant le comptage.
La cellule de Malassez
Un hématimètre qui permet de compter le nombre de cellules en suspension dans une solution.
Il s'agit d'une lame de verre sur laquelle un quadrillage a été gravé de 25 rectangles
contenant eux-mêmes 20 petits carrés. Elle a été inventée par Louis-Charles Malassez.
Pour dénombrer les cellules, on place une lamelle de verre sur la lame de Malassez, et sur
laquelle on dépose entre 10 et 15 µl de cellules en suspension.
Après avoir attendu quelques minutes pour que les cellules sédimentent, on peut compter le
nombre de cellules dans 10 rectangles (quadrillés).
Le volume d'un rectangle quadrillé étant de 0,01 µl, en comptant 10 rectangles, il suffit alors
de multiplier le résultat par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par ml.
Par exemple, si 30 cellules sont observables sur 10 rectangles, on obtient un total de 300 000
cellules par ml.
La cellule de Malassez
→ le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 10-6 dm3.
→ chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 =
10-8 dm3.
Remplissage de la cellule de numération
• Humecter les deux plateaux latéraux. Faire

adhérer parfaitement la lamelle aux plateaux
latéraux : pour cela placer la lamelle sur ces
plateaux, puis à l’aide des pouces posés sur la
lamelle, exercer une pression sur la lamelle tout
en pratiquant un mouvement de va et vient
jusqu’à perception d’une résistance.
• Placer la cellule de comptage sur une surface

plane. Homogénéiser la suspension cellulaire, et
prélever celle ci à l’aide d’une pipette Pasteur.
Remplir la chambre de comptage par capillarité,
en plaçant la pointe de la pipette légèrement
inclinée près de la lamelle sur la plate-forme
centrale quadrillée.
• Le remplissage doit être fait en une seule fois,

sans bulles d’air, et sans faire déborder le liquide
dans les rigoles. Laisser sédimenter les cellules
sur le quadrillage quelques minutes, et passer à la
numération.
Numération
• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la

répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer).
• Observer ensuite à l’objectif x40 pour réaliser le comptage (1 rectangle par champ).
• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du
quadrillage.
• Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui
chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les
cellules chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).
Calcul de la concentration cellulaire
Après avoir effectué la manipulation, on calcule la concentration cellulaire de la suspension de

cellules étudiée.
Soient : -n : nombre de cellules comptées.

-V : volume de comptage.
-f : facteur de dilution.
-N : nombre de cellules par litres.
Si on a n cellules dans V litres, alors on a N cellules dans un litre :

Nettoyage après usage : cellule et lamelle plane
• immersion pendant 10 à 15 minutes dans un bain d’eau de javel dilué,
• rinçage à l’eau du robinet puis à l’eau distillée,
• essuyage : linge fin ou papier absorbant non pelucheux (genre « Sopalin ») sans
frotter,
• laisser sécher à l’air libre durant quelques minutes,
• ranger à l’abri des poussières.

La cellule de Thoma
La cellule de Thoma
• La cellule de Thoma est un hématimètre qui permet de compter le nombre de cellules en

suspension dans une solution.
• Adaptée depuis la cellule de Neubauer, la cellule de Thoma conserve le grand carré

centrale de cette dernière.
• La surface de chaque carré est de 0,0025 mm2 chacun. La cellule de Thoma est
principalement utilisée pour le dénombrement des érythrocytes.
• Elle est formée de 16 grands carrés composés chacun de 16 petits carrés

La cellule de Thoma
Le nombre de cellules N compté dans un grand carré correspond au nombre de cellules dans 4x
10-6 ml.
Donc N x ( 1/4x 10-6) = 2,5x 10-5 = nombre de cellules/ml.
Le quadrillage total
- volume : 0,1 µl ;
- côté : 1 mm ;
- hauteur : 0,1 mm ;
16 grands carrés contenant chacun 16 petits carrés + 4 groupes de lignes horizontales + 4
groupes de lignes verticales.
La cellule de Thoma
La totalité du quadrillage (0,1 µl)
Calculer le nombre d’éléments cellulaires par microlitre
• Soit n le nombre d’éléments comptés,

N le nombre d’éléments par microlitre (µl),
V le volume de comptage.
Thoma : V = 0,1 µl (totalité du quadrillage)
• N=n/V
• Cellule de Thoma : N = n / 0,1
• Si le comptage est effectué sur du liquide dilué : ne pas oublier de multiplier le nombre
d’éléments comptés par le taux de dilution.
Lame de Kovas
• Cellule de numération jetable constituée

de dix cupules individuelles avec grilles à
quadrillage pour le comptage (Environ 10
ml sont déposés par capillarité dans une
cupule).
• 9 grands carrés contiennent 1 µl de

liquide.
• 1 grand carré (formé de 9 petits carrés)

contient 0,1 µl.
• 1 petit carré contient 0,01 µl.

Dénombrement des levures vivantes par cytométrie directe
Pour vérifier la viabilité des levures de la préculture, procéder ainsi :

• Homogénéiser soigneusement la préculture.
• Dans un tube Eppendorf, introduire à la pipette à piston 100 µl de préculture et 100 µl de
bleu de méthylène de Funk.
• Homogénéiser doucement et soigneusement.
Remplir la cellule de Malassez avec la suspension réalisée.
• Placer la cellule de Malassez sur la platine du microscope et laisser sédimenter 5 minutes.
• Vérifier l’homogénéité de la répartition à l’objectif x 10.
• Effectuer la numération (compter au moins 200 cellules) en comptant d’une part les cellules
vivantes et d’autre part les cellules mortes, en dénombrant sur des rectangles situés aux
quatre coins opposés du quadrillage, puis éventuellement sur d’autres rectangles éloignés des
précédents.
Dénombrement des levures vivantes par cytométrie directe
Autres méthodes directes de dénombrement des
microorganismes
* Epifluorescence :
Les bactéries sont colorées par un fluorochrome (Orange d’acridine ou Erythrosine),
puis observées au microscope en lumière UV.
Cette méthode permet de compter sélectivement les bactéries vivantes
fluorescentes à une couleur différente des cellules mortes.
Cette technique a des inconvénients du fait que la couleur des cellules peut
changer avec le pH du milieu par exemple.
*Compteur de particules :
Cet appareil réalise automatiquement le dénombrement des particules ou cellules en
suspension dans une solution, grâce aux modifications de résistances électriques
qu’elles provoquent à leur passage à travers un orifice calibré.

4.techniques D'encemencement, D'isolement Et de Numération Des Microorganism 103348

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

4.techniques D'encemencement, D'isolement Et de Numération Des Microorganism 103348

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Techniques d’ensemencement, d’isolement et de numération des

L'ensemencement consiste à beurrer un milieu nutritif solide ou à inoculer un milieu

L'ensemencement consiste à beurrer un milieu nutritif solide ou à inoculer un milieu

Un ensemencement consiste à introduire des microorganismes (bactéries, levures et

L'ensemencement consiste à beurrer un milieu nutritif solide ou à inoculer un milieu

Un ensemencement consiste à introduire des microorganismes (bactéries, levures et

La technique d’ensemencement complet vise à favoriser la multiplication des

L'ensemencement consiste à beurrer un milieu nutritif solide ou à inoculer un milieu

Un ensemencement consiste à introduire des microorganismes (bactéries, levures et

La technique d’ensemencement complet vise à favoriser la multiplication des

Il suffit ensuite de prélever les microorganismes sur la gélose ensemencée afin de

Selon le conditionnement, on utilisera différentes méthodes d’ensemencement

L'isolement permet l’obtention des cultures pures d’une espèce microbienne.

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement simple par stries multiples

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement simple par stries multiples

Autre méthode d'isolement

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

Puis on retourne afin d'ensemencer le dernier petit cadran.

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

Isolement par la méthode des cadrans

• Stérilisation de l’instrument d’étalement.

• Répétition des deux étapes précédentes 2 fois.

• Faire un Z final vers le centre de la gélose.

Isolement simple par stries multiples

Isolement simple par stries multiples

Autre méthode d'isolement

• On réalise dans un premier temps une dilution appropriée

• On inonde ensuite la boîte de gélose avec cette dilution.

• On aspire ensuite tout le liquide présent à l’aide d’une

• On laisse sécher 15 minutes à l’étuve ou près du bec de

• Ensuite, on dispose soit les disques d’antibiotique

Dénombrer les microorganismes = donner le nombre de microorganismes par unité

Dénombrer les microorganismes = donner le nombre de microorganismes par unité

Deux types de méthodes : directes et indirectes (après culture).

Dénombrer les microorganismes = donner le nombre de microorganismes par unité

Deux types de méthodes : directes et indirectes (après culture).

Microorganisme + éléments nutritifs (C , N, O2, etc.) = Biomasse cellulaire +

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

*Mesure du nombre des microorganismes :

- Estimation du nombre le plus probable (NPP).

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

*Mesure du nombre des microorganismes :

- Estimation du nombre le plus probable (NPP).

*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse soit par :

*Mesure du nombre des microorganismes :

- Estimation du nombre le plus probable (NPP).

*Mesure de la masse après culture sur milieu de culture liquide :

*Mesure de l’activité des microorganismes :

En suivant la cinétique de disparition d’un substrat ou celle de l’apparition d’un

Dénombrement après filtration sur membrane

Dénombrement après filtration sur membrane

• Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou

Dénombrement après filtration sur membrane

• Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou