MED104 TP Monde microbien et techniques

d’étude systématique
Domaine : Sciences de la santé / Sciences et technologie /
Sciences agronomiques
Parcours : Licence
Niveau : Semestre 3

Chargé du cours théorique : Dr HOEKOU Yao, Assistant

Chargés des TP : Dr HOEKOU Yao

Dr PISSANG Passimna
Mme GODONOU Amivi

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Objectifs de l’UE :

- Objectif général : Cette UE vise à appliquer les différentes méthodes d’identification

des bactéries.

- Objectifs spécifiques :

A la fin de l’UE, les étudiants seront capables de :

• Connaître la démarche à suivre pour l’identification des bactéries ;

• Déterminer la morphologie des bactéries ;

• Isoler les bactéries sur milieux appropriés ;

• Reconnaître les différents types de colonies bactériennes ;

• Identifier à partir des tests biochimiques spécifiques chaque espèce bactérienne.

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 DEMARCHE A SUIVRE POUR L’IDENTIFICATION DES BACTERIES

La démarche classique pour l’identification d’un germe repose sur 3 jours.

PREMIER JOUR

1- Aspect macroscopique

Il permet d’apprécier l’aspect de l’échantillon à l’œil nu.

Prélèvement liquide : Vérifier la présence ou non de turbidité, dépôt ou voile. Noter la couleur
et parfois l’odeur de l’échantillon.

Prélèvement solide : Noter l’aspect (par exemple les selles peuvent être molles, pâteuses,
diarrhéiques, glaireuses, sanguinolentes, etc).

L’aspect macroscopique peut également porter sur des colonies isolées.

2- Aspect microscopique

2.1- Etat frais

L’examen à l’état frais consiste à observer entre lame et lamelle un matériel biologique ou une
suspension microbienne à l’objectif 40.

Il permet d’apprécier la morphologie des bactéries, leur abondance et leur mobilité.

2.2- Examen microscopique après coloration

Il existe plusieurs types de coloration :

- Les colorations non différentielles, peu utilisées colorent toutes les bactéries de la même
façon sans distinction si ce n’est qu’elles permettent de mieux visualiser les
morphologies bactériennes et de préciser les agencements des bactéries les unes avec
les autres.
Exemple : La coloration au Bleu de méthylène

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 - Les colorations différentielles, distinguent les bactéries en fonction de la structure de
leur paroi. Deux colorations de référence sont employées. La coloration de Gram
distinguant bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif, et la coloration de
Ziehl-Neelson mettant en évidence les bacilles acido-alcoolo-résistants.

La coloration de routine utilisée est celle de Gram.

Confection un frottis, laisser sécher, fixer à l’alcool flambé ou à la flamme du bec Bunsen puis
colorer au Gram. A l’issue de cette coloration, on peut observer :

- Des bactéries (Cocci ou bacilles) colorées en violet foncé : elles sont dites à Gram positif
- Des bactéries (Cocci ou bacilles) colorées en rose : elles sont dites à Gram négatif.

3- Culture

3.1- Ensemencement

L’ensemencement est fait en fonction des résultats de la coloration de Gram. Par exemple en
présence des cocci à Gram positif, ensemencer le milieu Chapman.

3.2- Incubation

Les milieux sont incubés à l’étuve à 37°C et/ou sous CO2 selon les exigences des bactéries qui
y poussent pendant 18 – 24 heures.

DEUXIEME JOUR

4- Lecture des milieux de culture ensemencés

Il s’agit de ressortir les boîtes incubées et de vérifier la présence ou non de culture. Ensuite il
faut décrire les colonies isolées tout en précisant la fermentation ou non du sucre présent dans
le milieu par la bactérie ayant cultivée.

Rappel : Types de colonies

Il existe plusieurs types de colonies dont les trois principaux sont :

• Colonies de type S (smooth en anglais) : colonies à surface lisse et bords réguliers,

bombées, de consistance crémeuse.
• Colonies de type R (rough en anglais) : colonies à surface rugueuse et bords souvent
dentelés, plates, de consistance sèche.

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 • Colonies M (pour muqueuse) : grosses colonies à surface lisse et bords réguliers,
bombées mais filantes au prélèvement à l'anse.

5- Coloration de Gram de contrôle

Il s’agit de vérifier la concordance entre l’observation au Gram du prélèvement et celle de la

culture après coloration au Gram.

Faire un frottis à partir de chaque type de colonies obtenues puis colorer au Gram. Observer à
l’immersion.

6- Identification

6.1- Tests d’orientation

Ces tests permettent d’orienter l’identification vers la famille et ou le genre bactérien.

Exemples : Les tests de catalase et d’oxydase

6.2- Tests d’identification

Ensemencement des milieux ou galeries en vue de révéler les propriétés biochimiques

permettant d’identifier le genre et l’espèce de la bactérie. L’incubation est faite à l’étuve à 37°C
ou selon les conditions exigées par le test, pendant 18 – 24 heures.

TROISIEME JOUR

Suite des tests d’identification et ou lecture des tests d’identification suivis de l’identification
du germe.

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 ETUDE DE LA MORPHOLOGIE BACTERIENNE

L’examen microscopique est une étape clé dans la démarche diagnostique des infections
microbiennes.

Etudier la morphologie microbienne, au microscope photonique, c’est rechercher la forme des

bactéries, leur mobilité et leur mode de groupement.

1- Etat frais

But : C’est l’examen microscopique des micro-organismes vivants. Il permet d’apprécier par
le biais du microscope optique la mobilité des bactéries et leur morphologie.

Matériel nécessaire : Lames porte objet, lamelles couvre objet, microscope photonique
(objectif x 10 et x 40), culture ou suspension bactérienne ou prélèvement, anse de platine, eau
physiologique.

Technique

À partir d’une culture en milieu liquide :

▪ Déposer sur une lame propre soit le contenu d’une anse de platine ou une petite goutte
à l’aide d’une pipette Pasteur prélevé d’une culture jeune en bouillon ;
▪ Recouvrir la goutte d’une lamelle en évitant d’enfermer des bulles d’air ;
▪ Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer) ;
▪ Observer au microscope optique à l’objectif 40X. Ne pas prolonger l’observation au-
delà de 10 minutes.

À partir d’une culture sur milieu solide :

▪ Déposer une gouttelette d’eau physiologique stérile sur la lame ;

▪ Prélever une fraction de colonie sur le milieu de culture gélosé à l’anse de platine ;
▪ Émulsionner très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles) de façon à obtenir
une suspension homogène ;
▪ Recouvrir la goutte d’une lamelle en évitant d’enfermer des bulles d’air ;
▪ Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame et recommencer) ;
▪ Observer au microscope optique à l’objectif 40X. Ne pas prolonger l’observation au-
delà de 10 minutes.

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À partir de produits alimentaires ou biologiques : selon le cas l’examen sera direct ou
nécessitera une dilution (milieu solide) ou une concentration (urines).

L’observation :

Les bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très différents sont observés
(déplacement dans toutes les directions).

Une bactérie immobile est animée de mouvements d’agitation normaux qu’il ne faut pas
confondre avec la mobilité :
- Mouvements browniens : agitation moléculaire.
- Mouvement liquidien : entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même
vitesse. Ce mouvement peut apparaitre lors de la pose de la lamelle.

Figure : Observation des bactéries au microscope à l’état frais

Remarque : Une bactérie mobile peut apparaître immobile si les conditions de l’observation
ne sont pas optimales :
➢ Les flagelles ne doivent pas être cassés par la préparation ou détruit par un instrument trop
chaud ;
➢ La bactérie doit provenir d’une culture jeune ;
➢ La température de l’incubation peut aussi avoir de l’influence : certaines bactéries immobiles
à 37°C sont mobiles à 22°C (Yersinia, Hafnia par exemple).
➢ Il est possible de confirmer la mobilité par l’ensemencement d’une gélose molle.

2- Examen microscopique après coloration

Il existe plusieurs types de coloration :

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 - Les colorations simples ou non différentielles, peu utilisées colorent toutes les bactéries
de la même façon sans distinction si ce n’est qu’elles permettent de mieux visualiser les
morphologies bactériennes et de préciser les agencements des bactéries les unes avec
les autres.
Exemple : La coloration au Bleu de méthylène

- Les colorations différentielles, distinguent les bactéries en fonction de la structure de

leur paroi. Deux colorations de référence sont employées. La coloration de Gram
distinguant bactéries à Gram positif et bactéries à Gram négatif, et la coloration de
Ziehl-Neelson mettant en évidence les bacilles acido-alcoolo-résistants.

2.1- Examen microscopique après coloration simple

L’examen après coloration permet d’observer des bactéries tuées fixées sur une lame et ayant
subi l’action d’un ou plusieurs colorants.

Matériel nécessaire

Culture ou suspension bactérienne, colorant simple (bleu de méthylène), microscope optique,

lame porte-objet, anse de platine, eau physiologique et l’huile à immersion.

Mode opératoire

Réalisation des frottis : les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés
et fixés :

1- Étalement sur lame porte objet : noter la référence de l’échantillon sur une lame propre
2- 2-Prélever stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de culture bactérienne
et étaler en un film mince.

Séchage : le séchage est effectué à l’air libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.

Fixation du frottis : consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans altérer leur
structure. La fixation s’effectue par la chaleur

Coloration simple : Sur le frottis fixé et refroidi :

1- Faire couler la solution de bleu de méthylène jusqu'à ce que toute la lame soit recouverte.
2- Laisser agir 1 minute.

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 3- Rincer abondamment la lame l'eau du robinet jusqu'à élimination du colorant.
4- Sécher à l'air ou délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans
frotter.
5- Examiner au microscope, objectif à immersion.

Résultats : Les bactéries sont colorées en bleu sombre. Cette coloration est intéressante pour
l'observation rapide des frottis mais elle permet seulement l'étude de la morphologie des
bactéries.

2.2- Coloration différentielle : Coloration de Gram

- Préparation du frottis

S’il s’agit d’une culture en milieu solide, une colonie bien isolée sera prélevée et mise en
suspension dans une goutte d’eau physiologique stérile.
S’il s’agit d’une culture en milieu liquide, on prélève une goutte à l’aide d’une anse qu’on
dépose sur une lame et qu’on étale soigneusement de façon centrifuge afin d’obtenir un
étalement homogène et non épais.
Les frottis sont ensuite séchés à l’air libre.

Schéma illustrant la confection d’un frottis

- Fixation du frottis

Le but de la fixation est de faire adhérer le frottis à la lame en fixant la morphologie des bactéries
par coagulation rapide des protéines.

Elle peut être effectuée à l’alcool flambé ou par passage du frottis à la flamme du bec bunsen.

Alcool flambé : Recouvrir le frottis de quelques gouttes d’alcool à 95°C puis flamber à l’aide
d’une buchette d’allumette.

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Passage du frottis à la flamme : Passer le revers de la lame 2 à 3 fois dans la flamme du bec
bunsen.

Laisser refroidir le frottis fixé avant de commencer la coloration.

- Coloration de Gram proprement dite

Principe

La coloration de Gram est basée sur la différence de structure et de composition de la paroi des
bactéries. En effet, la paroi des bactéries à Gram négatif est très riche en lipides. Ces lipides
seront dissouts par l’alcool et le deuxième colorant pénètre dans la paroi. Alors que les bactéries
à Gram positif ne possédant pas cette structure gardent le premier colorant qui est le violet de
Gentiane.

Technique

Recouvrir le frottis de la solution de violet de Gentiane pendant 1 minute ;

Rejeter le violet de Gentiane ;
Recouvrir la préparation de Lugol pendant 1 minute ;
Rejeter le Lugol ;
Décolorer le frottis à l’alcool à 95°C : la lame est tenue inclinée puis on laisse couler l’alcool
sur le frottis jusqu’à ce que l’alcool coule non teintée.
Rincer à l’eau pour stopper la décoloration ;
Recouvrir la lame de solution de Fuchsine diluée pendant 1 minute ;
Laver à l’eau ;
Laisser sécher le frottis ;
Observer à l’immersion (objectif 100x).

Résultats

A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :

- Des bactéries colorées en violet foncé : elles sont dites à Gram positif ;
- Des bactéries colorées en rose : elles sont dites à Gram négatif.

Remarque : Explication

1. Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.

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2. Le Lugol permet de fixer cette coloration interne.
3. L'alcool sert à décolorer le cytoplasme des bactéries à Gram négatif : elles ont une paroi
pauvre en peptidoglycanes (donc plus fine) qui va laisser passer l'alcool (molécule
hydrophile), et qui décolorera le cytoplasme. Pour les bactéries à Gram positif, la paroi
constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée d'une couche
importante de peptidoglycanes (donc plus épaisse). Elles resteront alors de couleur
violette.
4. La recoloration à la Fuchsine ou la contre-coloration ayant pour but de donner aux
bactéries à Gram négatif décolorées une teinte rose permettant leur visualisation au
microscope.

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 MILIEUX DE CULTURE

1- Définition et caractéristiques d’un milieu de culture

Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes peuvent se
multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié.

Un milieu de culture doit répondre :

✓ Aux besoins nutritifs de la bactérie (aliment énergétique, constitutif, facteur de

croissance etc.…).
✓ Obéir aux exigences physico-chimiques de pH et de température propres à chaque
espèce bactérienne.
✓ Aux besoins en oxygène

2- Les différentes catégories de milieux de cultures

2.1- Milieux synthétiques

La composition chimique de ces milieux est parfaitement connue. Ils contiennent

obligatoirement des composés minéraux, une source de carbone, une source d’azote et
éventuellement des facteurs de croissance (vitamines, acides aminés indispensables). Ils sont
souvent utilisés dans l’étude des exigences nutritionnelles des bactéries. Quelques-uns sont
également utilisés pour l’identification de certaines espèces bactériennes.

Exemples : milieu urée indole, milieu de Citrate de Simmons, …

2.2- Milieux empiriques complexes

La composition de ces milieux n’est pas connue avec exactitude. Ce sont des dérivés de bouillon
de viande.

2.2.1- Milieux empiriques naturels

Ces milieux ne sont que très peu utilisés actuellement.

Exemple :

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 • Sérum sanguin
- dilué au ¼ et additionné de sucre et d’un indicateur coloré, il constitue le milieu de HISS pour
l’étude de la fermentation des sucres par les corynébactéries.

- Coagulé, ce milieu permet l’étude de la protéolyse ou l’isolement des corynébactéries.

• Le lait, la bile de bœuf, l’œuf, la pomme de terre sont également utilisés dans
des conditions bien déterminées.
2.2.2- Milieux empiriques de bases ordinaires

Exemple : Bouillon nutritif, eau peptonée, gélose nutritive, gélose Viande Foie

2.2.3- Autres milieux empiriques

✓ Les milieux spéciaux

Exemple : Milieux de Lowenstein Jensen, milieu de Coletsos (mycobactéries), sérum de lapin
dilué (leptospires).

✓ Les milieux sélectifs

Ces milieux permettent d’isoler une espèce bactérienne à partir d’un mélange de germes. Ils
peuvent être solides ou liquides. Ils sont souvent additionnés de substances inhibitrices pour
certaines espèces et par pour d’autres (antibiotiques, antiseptiques, colorants, sels biliaires,
etc.…)

Exemple : Bouillon Streptosel (Streptocoques), Bouillon hypersalé (Entérocoques), Gélose

Drigalski (Entérobactéries), Gélose Columbia avec ou sans sang + Acide Nalidixique (pour les
bactéries à Gram positif).

✓ Milieux différentiels
Ils peuvent être sélectifs (milieu Drigalski, gélose Salmonella Shigella) ou électifs (gélose
Chapman). Ils contiennent des produits leur permettant de distinguer plusieurs catégories de
bactéries.

Ex : Le milieu Drigalski permet de distinguer les colonies lactoses + et les colonies lactose -.

Le milieu Salmonella Shigella révèle 4 catégories de colonies.

- Colonies Lactose +, H2S -

- Colonies Lactose +, H2S +

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 - Colonies Lactose -, H2S -

- Colonies Lactose -, H2S +

Le milieu de Chapman permet de distinguer les colonies mannitol + et les colonies mannitol -.

✓ Milieux électifs
Ils permettent un développement particulièrement rapide et abondant de certaines bactéries. Les
autres ne se développent que lentement ou peu. Ils sont solides.

Exemple : Le sérum coagulé ou milieu de Löffler pour les Corynebacterium, le milieu de

Chapman pour les staphylocoques.

✓ Milieux d’isolement
Ces milieux sont utilisés pour séparer les éléments de la flore d’un échantillon ou pour purifier
une souche.

Exemple : Milieu ENDO, la gélose nutritive (GN), milieu BCP (Bromo Crésol Pourpre)

✓ Milieux d’enrichissement
Ils sont toujours liquides et sont utilisés pour l’obtention de la multiplication rapide d’un germe
défini (un milieu sélectif peut être un milieu d’enrichissement).

Exemple : Bouillon Müller Kauffman, Bouillon Sélénite

Ces milieux permettent le développement des salmonelles alors que les autres germes
saprophytes des selles sont inhibés.

Eau peptonnée alcaline pour Vibrio cholerae.

✓ Milieux enrichis
Toutes les bactéries ne peuvent pas cultiver sur les milieux ordinaires d'où la nécessité de les
enrichir en ajoutant des produits biologiques divers, des oligoéléments, des antibiotiques, etc.

Exemple : Gélose au sang frais (GSF), gélose au sang cuit avec ou sans isovitalex.

Remarque

En ajoutant des substances inhibitrices de croissance microbienne telle que les antibiotiques,
les antifongiques etc, on peut faire de ces milieux à la fois enrichis et sélectifs.

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Exemple : Gélose au sang cuit + VCN (Vancomycine, Colistine, Nystatine).

✓ Milieux d’identification
Ils contiennent des révélateurs de propriétés caractéristiques de certaines espèces. Ils interrogent
les différents métabolismes : glucidiques, protidiques et lipidiques. Ils peuvent être solides ou
liquides.

Exemple : Milieu urée indole (pour les entérobactéries), milieu de Kliger-Hajna pour les
entérobactéries, Milieux King A et King B pour les Pseudomonas, Milieu Litsky pour les
Streptocoques fécaux.

✓ Milieux de conservation ou de transport

Ces milieux permettent de maintenir en survie pendant un temps plus ou moins long les
bactéries en culture ou dans un échantillon donné.

Exemple : Milieu de Stuart (gonocoque), milieu Venkatraman-Ramakrishna (pour les vibrions

cholériques).

3- Les constituants de base des milieux de cultures

3.1- Les besoins élémentaires des bactéries

✓ L’eau

Elle est représentée en quantité abondante.

✓ Les aliments énergétiques

Ils fournissent l’énergie nécessaire à la biosynthèse des métabolites essentiels. Le substrat

habituellement employé est le glucose.

✓ Les aliments constitutifs

A partir de ces éléments grâce à l’énergie fournie, la bactérie va assurer la synthèse des produits
dont elle a besoin.

- Les ions minéraux : chlorures (Cl-), phosphates (PO43-), sulfates (SO42-), potassium et
calcium.
- Les oligoéléments : Mn2+, Cobalt (Co2+), Fer (Fe2+)
- Sources de carbone : glucose, CO2

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 - Sources d’Azote : Sels d’ammonium

✓ Les aliments spécifiques

Ce sont des facteurs de croissance : Les coenzymes, les aminoacides, les bases puriques et les
bases pyrimidiques. On définit ainsi en fonction de ces éléments différentes catégories de
bactéries.

- En fonction de la source d’énergie : Les bactéries phototrophes ou photosynthétisantes

(bactéries utilisant l’énergie lumineuse, les bactéries pigmentées sulfureuses).
Les bactéries chimiotrophes : Ce sont des bactéries pathogènes pour l’homme. Elles
utilisent de l’énergie fournie par l’oxydation.
- En fonction du pouvoir de synthèse
Les bactéries autotrophes : vivent dans la nature et ayant un pouvoir de synthèse très élevé.

Exemple des bactéries de sol qui utilisent le CO2 de l’air comme source de carbone et le NH4
comme source d’azote.

Les bactéries mésotrophes : à pouvoir réducteur moindre ; elles peuvent synthétiser leurs
constituants azotés à partir de NH3 mais sont incapables de réduire le nitrate ou le nitrite.

3.2- Infusions et extraits de viande

✓ Infusions ou décoction de viande

Elles sont obtenues en portant à ébullition pendant une période assez courte une quantité de
viande convenablement préparée.

✓ Extraits de viande

Ils sont obtenus par déshydratation partielle des infusions. Comme les infusions, ils sont
commercialisés et sont incorporés aux milieux de culture à raison de 0,3 à 0,5g /100.

✓ Extraits de levure

Ils sont obtenus par extraction aqueuse d’autolysat de levure de bière. Ils sont incorporés aux
milieux à raison de 0,3g%. Ils apportent des facteurs de croissance tel le facteur V pour la
culture des bactéries du genre Haemophilus.

✓ Peptones

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Ce sont des produits solubles issus de l’hydrolyse enzymatiques des protéines. Elles se
distinguent par la nature de l’enzyme qui a permis leur obtention (pepsine, trypsine, papaïne)
et la nature du produit qui a été à l’hydrolyse (viande, caséine, soja, gélatine).

✓ Agents solidifiants

- Agar Agar appelé Agar ou gélose : l’agar est un mucilage extrait d’une algue rouge qui croit
dans le Pacifique et l’Atlantique. Il est de nature polyosidique. Produit de fusion de 90°C et
dissolution dans l’eau. Solidification sous forme de gel transparent à température plus basse.
Possibilité de liquéfaction s’il est reporté à 90°C. Il est employé à la concentration de 1,5% pour
l’obtention d’un milieu solide et à 0,5g /100 pour une gélose molle.

- La gélatine : obtenue industriellement par hydrolyse de certains tissus d’animaux riches en

collagène (os, vessie de poisson, peau). Elle n’est plus utilisée actuellement à cause de sa
liquéfaction à 25°C et par les gélatinases élaborées par les bactéries gélatinolytiques.

- Les gels de silice : ils sont utilisés pour la culture de certaines bactéries du sol qui liquéfient
l’Agar.

- Autres agents solidifiants : Les œufs coagulés (milieu Lowenstein Jensen), le sérum coagulé
(milieu Löffler).

✓ Indicateurs de pH

Ils existent des substances qui ont la propriété de changer de couleur avec la variation de pH.
Ces substances sont des indicateurs colorés ou indicateurs de pH.

PREPARATION DE MILIEU DE CULTURE

Etape 1

Pour un usage rationnel des milieux, il faut évaluer la quantité hebdomadaire de boîtes ou de
milieu à utiliser.

Exemple : Lorsque j’utilise en moyenne 4 boîtes de Pétri de milieu Chapman par jour et que je
reçois les prélèvements de lundi à jeudi, j’aurai besoin de 4 boîtes x 4 soit 16 boîtes de pétri par
semaine dans mon laboratoire.

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Pour les boîtes de Pétri ronde de 90 mm de diamètre, il faut 25 ml de milieu solubilisé par boîte
pour avoir l’épaisseur de gélose requise. Donc pour préparer 16 boîtes de Pétri, il faut 25 ml x
16 soit 400 ml de milieu à préparer.

Etape 2

Lire les instructions du fabricant sur le flacon ou la boîte de milieu de culture sous forme
anhydre.

Calculer la quantité de milieu en poudre nécessaire à peser pour la préparation du nombre de

boîtes de pétri dont on a besoin.

Etape 3

Peser la quantité de poudre de milieu calculée puis prélever à l’aide d’une éprouvette graduée
le volume d’eau distillée dont on a besoin.

Faire dissoudre la poudre dans l’eau distillée dans un flacon en pyrex puis porter à ébullition
pendant quelques minutes en vue d’une dissolution complète.

Contrôler le pH du milieu puis ajuster si nécessaire.

Etape 4

Stériliser le milieu suivant les instructions du fabricant (Autoclaver généralement à 121°C

pendant 15 mn).

Remarque : Lorsqu’il s’agit d’un bouillon ou d’un milieu gélosé en tubes, répartir le milieu
dissout dans les tubes à essai ou de culture puis visser avant de les stériliser.

Etape 5

Sortir le milieu stérilisé de l’autoclave.

Laisser refroidir jusqu’à 45°C et disposer parallèlement les boîtes de pétri sur une surface plate
(paillasse ou table de manipulation) tout en les marquant par le nom abrégé du milieu de culture.

Créer une zone aseptique autour des boîtes / ou disposer les boîtes de pétri sous hotte lorsque
le laboratoire en dispose.

Distribuer le milieu dans les boîtes de pétri de façon aseptique à raison de 25 ml par boîte.

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Remarque

Lorsqu’il s’agit d’un bouillon, les tubes laissés refroidis sont prêts à emploi et donc garder au
réfrigérateur entre 2 à 8°C jusqu’à utilisation.

Les milieux gélosés en tubes peuvent ensuite être conservés tels quels après refroidissement en
position verticale, ou inclinés en pente ou pente et culot.

Etape 6

Laisser solidifier puis garder les boîtes de milieu prêtes à emploi au réfrigérateur entre 2 à 8°C
jusqu’à utilisation.

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 LES TECHNIQUES D’ENSEMENCEMENT

Les instruments utilisés au cours et lors des ensemencements :

a- Anse de platine ou öse : sert à prélever des produits pathologiques organiques et des
cultures. Elle sert également aux ensemencements et aux repiquages.

b- Fil droit : utilisé pour les ensemencements en profondeur sur milieu gélosé en culot, ou
pour prélever une colonie bien précise ou pour effectuer une agglutination sur lame.

c- Pipette Pasteur simple, ou boutonnée ou graduée : sert à inoculer un volume déterminé du

produit suspect. Elle sert également pour les dilutions en suspension sur germe.

d- Pipette Pasteur en râteau ou en ringard pour étaler les cultures sur une gélose.

e- Ecouvillon : peut être une tige en bois ou en plastique à laquelle on a enroulé du coton au
bout. Il sert à ensemencer, ou à prélever des produits pathologiques, ou à étaler lors de
l’antibiogramme.

I- Ensemencement en milieu gélosé

A- Technique d’isolement

Pour identifier les bactéries contenues dans un produit il faut disposer de culture pure d’où
l’importance capitale de l’isolement. L’isolement permet la séparation des bactéries en
colonies distinctes.

-La purification ou la vérification de leur pureté.

-L’étude de l’aspect des colonies : critère important pour l’identification.

1- Ensemencement par quadrant

Sur une boîte de Pétri contenant de la gélose :

- pratiquer des stries très serrées dans la première partie de la surface de la gélose,

- Tourner la boîte d’un quart de tour,

- Ne pas recharger l’anse,

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- Flamber l’anse,

- Pratiquer de nouveau des stries serrées dans une deuxième moitié de la surface en mordant 2
à 3 fois sur les premières stries,

- Tourner de nouveau la boîte d’un quart de tour

- Ne pas flamber, ne pas recharger mais recommencer la même opération sur la partie restante
en mordant toujours sur les stries précédentes jusqu’à un certain niveau puis épuiser l’anse sur
le reste de la boîte.

2- Technique par épuisement

On peut aussi le faire en tube.

B-Ensemencement en stries parallèles ou en stries radiaires

Cette technique est utilisée pour l’étude du pouvoir bactéricide des associations des
antibiotiques. Elle est aussi utilisée pour la mise en évidence de la Dnase. Dans ce cas
plusieurs souches peuvent être ensemencées sur une même boîte.

Stries parallèles Stries radiaires

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C- Ensemencement en étoiles

L’inoculum est déposé au centre de la boîte contenant la gélose. A partir de ce point central
avec l’anse étirer la goutte en stries parcourant la boîte d’un coin à un autre. Quand un
diamètre a été décrit, tourner la boîte de quelques degrés et pratiquer de la même manière.
Cette technique est utilisée pour le dénombrement des bactéries.

D- Ensemencement en touches

Etaler sur quelques cm à la surface de la gélose, la souche à étudier à l’aide d’une öse ou
d’une pipette pasteur boutonnée de manière à ce que la culture réalise une touche. Plusieurs
souches peuvent être ainsi étudiées sur une boîte. Ce procédé est utilisé pour des tests
d’identification.

E- Ensemencement en doubles couches

Déposer dans la boîte de Pétri vide stérile un ml de l’inoculum à étudier. Couler par-dessus
environ 15 cm3 de milieu de culture stérile fondu et ramené à 45°C. Mélanger très
délicatement par mouvement de rotation d’avant en arrière.

Attention !

Ne pas mouiller les rebords de la boîte ce qui conduirait à des pertes de bactéries.

Laisser solidifier tout en maintenant le reste de la gélose à 45°C,

Couler une deuxième couche de gélose sur la première. Laisser solidifier et incuber couvercle
en bas. Technique utilisée pour le dénombrement des bactéries.

F- Ensemencement à partir d’un écouvillon

Tremper l’écouvillon dans un milieu liquide avant de le sortir, imprimer à l’écouvillon un

mouvement d’essorage sur la paroi du tube. On sort l’écouvillon et on étale les bactéries par
des stries serrées.

Ce procédé est utilisé pour la réalisation d’un antibiogramme.

G- Ensemencement dans une gélose en culot

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La gélose peut être solide ou molle. On ensemence par stries centrales en plongeant jusqu’au
fond du tube le fil droit ou la pipette boutonnée chargée d’inoculum, remonter doucement
sans trembler.

Ce procédé est utilisé pour l’étude de la mobilité en milieu mannitol mobilité. Il est utilisé en
milieu Kligler où l’on utilise deux procédés :

On fait d’abord des stries sur la pente et on pique dans le culot. Il est aussi utilisé pour l’étude
du type respiratoire sur milieu VF ou VL.

H- Ensemencement par inondation

Inonder la surface de la gélose à l’aide de quelques gouttes de l’inoculum ou de la suspension

microbienne. Aspirer le surplus. Technique utilisée pour l’antibiogramme.

I- Ensemencement par étalement

A l’aide d’un étaleur, étaler sur toute la surface d’une gélose à ensemencer une quantité de
votre inoculum. Ce procédé est utilisé pour l’antibiogramme, le dénombrement des germes, et
certains tests tels que le test de sensibilité à l’optochine, ou à la bacitracine.

II- Ensemencement en milieu liquide

L’échantillon peut être une colonie, un bouillon de culture, un produit pathologique.

On prélève l’échantillon à l’anse et on ensemence dans le milieu liquide dans le tiers (1/3)
supérieur du tube légèrement incliné.

22
 ETUDE SYSTEMATIQUE DES COCCI A GRAM POSITIF : CAS DES
STAPHYLOCOQUES

1. Prélèvement

Pus, les prélèvements vaginaux, sang (hémoculture), le liquide céphalo-rachidien (LCR), les
selles, les urines, l’eau, les aliments (toxines), etc.

2. Etude macroscopique

Elle consiste à observer le prélèvement à l’œil nu et à noter son aspect (turbidité, dépôt, etc).

3. Etude microscopique

3.1. Etat frais

Préparer la lame et observer à l’objectif 40x.

Le staphylocoque se présente à l’état frais sous forme de petites coques immobiles groupées en
amas, en diplocoques ou en très courtes chaînettes (3 à 5 éléments).

3.2. Coloration au Gram

Confectionner le frottis mince, fixer à l’alcool flambé ou par passage dans la flamme du bec
bunsen. Colorer au Gram puis observer à l’objectif à immersion 100X.

Ce sont des cocci à Gram positif donc colorés en violet de taille variable (0,5 µ à 1,5µ). Ils se
présentent en coques isolés, en diplocoques, en grappes de raisin, en coques intracellulaires ou
en courtes chainettes.

NB : Il n’est pas bon d’accélérer le séchage du frottis en approchant la lame de la flamme du

bec bunsen car ceci peut déformer les bactéries.

3- Milieux de culture

C’est un germe aéro-anaérobie facultatif. Le staphylocoque est une bactérie de culture très facile
donc poussant sur tous les milieux ordinaires (gélose nutritive, bouillon nutritif, etc.…) et les
milieux enrichis (GSF, Gélose ou bouillon +ascite ou + sérum) en 24 h à 37°C. Néanmoins il
existe des milieux sélectifs pour son isolement à partir des prélèvements polymicrobiens.

23
3.1- Milieu de Chapman (CH)

Remarque : Il s’agit d’un milieu sélectif pour la culture des staphylocoques mais d’autres
bactéries peuvent y végéter et même cultiver en fermentant le mannitol (entérocoques, E. coli,
etc). Un Gram de contrôle s’avère indispensable dans ce cas.

Composition du milieu de Chapman

Ce milieu contient de peptone bactériologique (10 g/L), extrait de viande de bœuf (1 g/L), du
NaCl (75 g/L), du mannitol (10 g/L) comme sucre, du rouge de phénol (0,025 g/L) comme
indicateur coloré, de l’agar (15 g/L).

La couleur initiale du milieu est le rouge.

Après 24 h d’incubation deux catégories de souches sont à distinguer :

- Mannitol (+) : coloration jaune du milieu.

- Mannitol (-) : absence de coloration jaune.

Les souches de Staphylococcus aureus élaborent leur propre pigment. Les colonies s’entourent
en 24 à 48 heures d’une auréole jaune due à la fermentation du mannitol.

Les souches de Staphylococcus epidermidis et autres Micrococcaceae donnent de petites

colonies blanchâtres, qui, dans la majorité des cas, se développent sans modifier la couleur du
milieu. Cependant, une minorité non négligeable de souches de S. epidermidis est capable de
fermenter le mannitol.

Remarque : La fermentation du mannitol permet seulement d’orienter le diagnostic et doit

donc être toujours compléter par la recherche de la production de la coagulase, de la Dnase, etc.

3.2- Milieu de Baird Parker

C’est un milieu d’usage courant en bactériologie alimentaire. Ce milieu contient de peptone,

d’extrait de viande de bœuf, d’extrait de levure, du pyruvate de sodium, du glycocolle, du
chlorure de lithium, du tellurite de potassium, du jaune d’œuf et de l’agar.

Initialement, ce milieu est de couleur beurre ou jaune pâle.

Après 24 à 48 h d’incubation, les souches de Staphylococcus aureus forment des colonies noires
types S et produisent :

24
 - Un halo clair autour de la colonie, qui correspond à une zone de protéolyse
(éclaircissement du jaune d’œuf).
- Des zones opaques qui peuvent apparaître plus tardivement dans le halo clair ; elles sont
dues à l’action des lipases.

Les autres microorganismes que l’on peut exceptionnellement observer sur ce milieu sont des
souches de Staphylococcus epidermidis, des Microcoques, des Bacillus et, éventuellement des
levures. Les colonies ne présentent pas, alors, les mêmes caractéristiques décrites plus haut.

3.3- Milieux d’enrichissement

Ils sont souvent utilisés en bactériologie alimentaire.

- Milieu liquide de Giolitti et Cantoni

C’est un milieu dont la composition se rapproche de celle de Baird Parker

- Milieu liquide de Chapman

Dans ce milieu le lactose remplace le mannitol et il est deux fois plus concentré en NaCl.

4- Caractères d’identification

4.1- Tests d’orientation

4.1.1- Recherche de la catalase

Principe : La catalase est une enzyme respiratoire qui décompose le peroxyde d’hydrogène ou
l’eau oxygénée (H2O2) en eau (H2O) et en dioxygène (O2). Au cours de ce processus respiratoire
il y a accumulation d’eau oxygénée dans la bactérie. Cette eau étant toxique pour les bactéries,
elles se mettent alors, à fabriquer la catalase qui va scinder l’H2O2 en H2O et en O2.
Catalase
H2O2 H2O + O2

Matériel

Eau oxygénée 10 volumes, lame porte objet, culture de 24 h sur gélose ordinaire ou Chapman
de la souche à étudier, pipette Pasteur boutonnée.

Technique

25
Sur une lame propre et sèche déposer une goutte d’eau oxygénée à 10 volumes.
A l’aide d’une pipette Pasteur boutonnée, ajouter une colonie à la goutte d’eau oxygénée, puis
observer immédiatement.

Lecture
➢ Apparition de bulles d’air = dégagement gazeux de dioxygène : catalase positive (+)
➢ Pas de bulles d’air : catalase négative (–).

NB : Les staphylocoques sont catalases positives.

Cause d’erreurs :

- Réalisation du test à partir d’une gélose au sang qui possède une activité catalasique,
- Suspension bactérienne insuffisante,
- Eau oxygénée périmée.

4.1.2- Recherche de l’oxydase

Principe

Les cytochromes sont des protéines qui appartiennent à la chaîne respiratoire, composée d'une
succession de transporteurs d’électrons, en particulier les cytochromes porteurs de coenzymes
héminiques. La recherche de l'oxydase est un des critères les plus discriminatifs et les plus
employés pour l'identification des bactéries, surtout celle des bacilles à Gram négatif.

Le test consiste à mettre en évidence la capacité de la bactérie testée à oxyder la forme réduite
incolore (la NN-diméthyl-paraphénylène diamine) (la NN-diméthyl-paraphénylène diamine) de
dérivés méthylés du paraphénylène diamine, en leur forme oxydée semi-quinonique rose
violacé.

Matériel

Kit d’oxydase, pince, lame porte objet, eau distillée stérile, pipette Pasteur

Technique

- Déposer à l’aide d’une pince flambée, un disque d’oxydase imprégné / ou non imprégné
sur une lame porte-objet,

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 - Humidifier en y ajoutant une goutte d’eau distillée stérile / ou de réactif d’oxydase,
- Prélever avec une pipette Pasteur une colonie sur une gélose ordinaire et la déposer
doucement sur le disque.

Lecture

Lire le résultat autour de 30 secondes.

- La présence d’une coloration violette ou brun-noire = oxydase positive (+)

- Absence de coloration violette (disque incolore) = oxydase négative (-)

Causes d’erreurs :

- Réalisation du test à partir d’un milieu glucidique, un glucide ayant été attaqué : une
fermentation peut cacher une respiration…,
- Quantité insuffisante de bactéries,
- Humidification trop importante du disque entraînant l’élimination du réactif,
- Réactif périmé,
- Utilisation d’une öse métallique « oxydase+ » ou portant des traces de colorant violet,
- Lecture trop tardive : au-delà de 30-40 secondes, le réactif s’oxyde spontanément à l’air.

Conclusion partielle

Cocci Gram + groupés en amas ou en diplocoques ou en grappes de raisin, catalase +, oxydase

-, font partie de la famille des Micrococcaceae et du genre Staphylococcus.

4.2- Mise en évidence d’autres caractères biochimiques et diagnostic d’espèces

4.2.1- Recherche de la coagulase

Le principe du test de coagulase repose sur l’aptitude de Staphylococcus aureus à coaguler le

plasma oxalaté de lapin dans un délai de 24 heures contrairement aux souches de
Staphylococcus epidermidis et de Micrococcus.

Le principe est basé sur la mise en évidence de la présence de la coagulase libre dans le milieu
de culture.

Matériel

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Plasma de lapin, bouillon spécial ou bouillon nutritif, culture de 24 h en milieu gélosé de la
souche à étudier, tube à hémolyse stérile, pipette pasteur stérile, vortex.

Mode opératoire

Ensemencement et incubation : Ensemencer à partir d’une culture pure de la souche à étudier

le bouillon spécial (ou à défaut le bouillon nutritif) pour épreuve de la coagulase. Incuber à
37°C pendant 18 à 24 h.

Mélanger dans un tube à hémolyse stérile 0,5 ml de plasma réhydraté et 0,5 ml de la culture en
bouillon depuis 24 h. Bien mélanger ou vortexer puis incuber le mélange à 37°C pendant 2 à
24 heures.

Lecture et interprétation

Coagulase positive : Les souches de S. aureus provoquent la coagulation du plasma le plus

souvent au cours des 3 premières heures (> 1/2 h et < 24 h). La prise en masse du plasma est
généralement totale à tel point qu’il est possible de retourner le tube.
Dans certains cas, la coagulation est plus légère et plus tardive, mais la réaction doit être
considérée comme positive si le phénomène intervient avant la 24ème heure.

Coagulase négative : Mélange encore liquide après 24 h.

4.2.2- Recherche de la Dnase

Principe

La réaction consiste à mettre en évidence sur un milieu approprié la dégradation de l’ADN par
l’enzyme Dnase de la bactérie lorsque celle-ci en est pourvue.

Matériel

Gélose à l’ADN, culture de 24 h en milieu gélosé de la souche à étudier, bleu de toluidine à

0,1% ou acide chlorhydrique normal, anse ou fil droit.

Mode opératoire

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Ensemencer en stries ou en touches sur un milieu gélosé contenant de l’ADN, la bactérie à
examiner. Plusieurs échantillons peuvent être ensemencés en même temps. Il suffit de bien les
délimiter et de bien les numéroter. Incuber la boîte à 37°C pendant 18 à 24 h. Inonder la surface
de la gélose soit avec une solution de bleue de Toluidine à 0,1% dans de l’eau distillée, soit
avec une solution d’HCI normal. Lire entre 15 à 20 minutes.

Résultats

Cas du bleu de Toluidine

- Apparition d’un halo rose autour de la strie d’ensemencement : Dnase positive (+)
- Absence d’halo rose autour de la strie d’ensemencement : Dnase négative (-)

Cas de l’HCl normal

- Apparition d’un halo clair autour de la strie d’ensemencent : Dnase positive (+)
- Absence d’halo clair autour de la strie d’ensemencement : Dnase négative (-)

Schéma illustrant la réaction

4.2.3- Autres tests d’identification

Recherche de la coagulase liée (Clumping factor)

Principe
C’est la mise en évidence de la coagulase liée au corps bactérien.
La présence de la coagulase liée peut être mise en évidence de différentes manières. Le coffret
Staphylase Test OXOID permet de détecter cette dernière par une réaction d’agglutination avec
des hématies de mouton sensibilisées par du fibrinogène. Un contrôle (hématies de mouton non
sensibilisées) avec lequel aucune agglutination ne doit être observée, assure simultanément la
spécificité de la réaction.

Mode opératoire

Sur une lame porte objet déposer une goutte de plasma de lapin reconstitué. Emulsionner dans
cette goutte à l’aide d’un fil droit une colonie suspecte en milieu gélosé.

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Résultat
-Agglutination instantanée= résultat positif (présence de Clumping factor).
- Pas d’agglutination suspension reste homogène = résultat négatif (absence de Clumping
factor).

Mise en évidence de la protéine A

Principe

S. aureus possède un récepteur protéique pour un fragment de fibrinogène. Ce récepteur est

présent sur 96% des souches d’origine humaine et sur la plupart des souches des autres biotypes.
Des hématies de moutons sensibilisées (Staphyslide-test de Bio Merieux) ou des particules de
Latex (Pastorex staph de diagnostic Pasteur) sensibilisées par des fibrinogènes sont agglutinées
lorsqu’elles sont mises en présence d’une souche de S. aureus portant ce récepteur.
Mode opératoire
Confère la fiche technique du fabricant. Par exemple pour Staphyslide-test, c’est une
agglutination sur lame en moins de 15 s pour S aureus.
Résultat
Présence d’agglutination = test positif
Suspension homogène= test négatif

Recherche de la sensibilité à la novobiocine

Elle s’effectue par la méthode de diffusion en gélose sur milieu Muller Hinton avec des disques
chargés à 5 µg.

Mode opératoire
Confère la méthode de réalisation de l’antibiogramme.
Résultat
Apparition d’une zone d’inhibition autour du disque de novobiocine avec un diamètre supérieur
à 15 mm : on conclut que le germe est sensible à la novobiocine.
Absence de zone d’inhibition ou zone d’inhibition avec un diamètre inférieur à 15 mm : on
conclut que le germe est résistant à la novobiocine.

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 Galerie Api Staph
Elle est composée de 20 tests d’identification des staphylocoques.
Principe
La galerie API Staph comporte 20 microtubes contenant des substrats déshydratés. Les
microtubes sont inoculés avec une suspension bactérienne réalisée dans API Staph Medium qui
reconstitue les tests. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par
des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs. La lecture de ces réactions
se fait à l'aide du Tableau de Lecture et l'identification est obtenue à l'aide du Catalogue
Analytique ou d'un logiciel d'identification.

CONCLUSION
Des cocci à Gram positif groupés en amas (catalase +, oxydase -), aéro-anaérobie facultatifs
sont des Staphylocoques. S’ils sont coagulase +, Dnase +, thermonucléase +, il s’agit de S
aureus.

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