Introduction :
Techniques d’isolement
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux
techniques sont alors utilisées :

La méthode des stries

La méthode des dilutions

1- Méthode des stries :

 Cas d'un ensemencement en surface à partir d'un prélèvement liquide ou solide :

-Prendre les précautions habituelles pour un ensemencement
 (N’ouvrir que le temps nécessaire à l'exécution des stries et n'entrebâiller alors
la boite que devant un bec Bunsen)
 -porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone
stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube
(liquide)
-prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite
ou le tube et prendre la boite vierge
 - ensemencer de la façon suivante :

 
 -Partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusque vers 2. Flamber
l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction
précédente 1-2 jusque vers 3.
-les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer
après 24 à 48heures selon le cas (la position renversée permet à l'eau de
condensation de
S’évaporer
 
Résultats obtenus :
Après l’incubation à 30 °C

 
 
 
2- Méthode des dilutions :

 
Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :
 
Cette technique permet, après un étalement sur milieu solide, d'évaluer le
nombre de colonies par ml de suspension. Elle peut permettre également, si l'on
ne dispose pas de lame à numération, la détermination du nombre de cellules par
unité de volume ou du nombre de cellules présentes dans une colonie.
 
-Les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un liquide physiologique
de type Ringer

-Numéroter des tubes à essai de 1 à 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de
dilution
-Dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension
fournie, rincer la pipette trois fois
- homogénéiser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prélever
0.1 ml et verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la
dilutionn°10.

f tlf
Méthode autre :

+photo
Isolement des souches
2. Purification des souches
Après 24h d’incubation, les cultures sont purifiées. Celle-ci qui permet d’obtenir des
cultures pures à partir de souches obtenues. La sélection est basée sur l’aspect macroscopique des
colonies : la couleur, la forme, le diamètre, l’opacité… Un échantillon de chaque type de colonie
est prélevé ensuite purifié par repiquage successif selon la méthode de stries (Austin, 1988).

3. Conservation des souches

Les souches isolées sont conservées dans des tubes à essai contenant un milieu
GN incliné (annexe 2). Les souches sont ensemencées sur la pente des tubes par la
méthode des
stries, puis incubées à 30°C pendant 24 heures. Les tubes dans lesquels il y a eu u
ne croissanceseront conservés à 4°C pour une durée de 4 à 6 semaines. Afin de
pouvoir toujours disposer de souches viables, la réactivation doit se faire tous les mois
(Marchal et Bourdon, 1982)  
4. Identification des souches purifiées
L’identification des isolats est basée sur leurs caractéristiques
morphologiques, physiologiques et biochimiques (Coloration de Gram, détermination de la te
mpératured’incubation, catalase, croissance dans NaCl, croissance en anaérobiose, test de
Voges-Proskauer et de rouge de Méthyle, Croissance à pH 5.7, la fermentation des
carbohydrates,l’hydrolyse de l’amidon, utilisation du citrate, la formation d’indole, formation
du dihydroxyacetone, déamination du phénylalanine, hydrolyse de caséine, dégradation
detyrosine, hydrolyse de gélatine, jaune d'œuf lécithines) et sur les systèmes d’identification
rapides
Etude des caractères morphologique
Cette étude est basée sur des observations macroscopiques et microscopiques
(x100) permettant de différencier le type de Gram, les coques, les bacilles ainsi
que la disposition des cellules.

. 1. 1. Examen macroscopique

L’observation de l’aspect macroscopique des colonies permet d’effectuer une

première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de
l’identification. D’après les auteurs Thoma et al
. (1970), les éléments d’identification macroscopiques sont :
 
-La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.-
 
-La taille des colonies par la mesure du diamètre : pinctiformes ou non pinctiformes.-
 
-La chromogènes : couleur de la colonie.
 
-L’élévation : convexe, concave, plate.
 
-L’opacité : opaque, translucide ou transparente.
 
-La surface : lisse, rugueuse, sèche, dentelée,…etc
. 1. 2. Aspect microscopique
Observation à l’état frais
Ce test permet de déterminer la forme, l’arrangement et la mobilité des
bactéries. Il consiste en l’observation d’une goutte de suspension bactérienne,
préparée avec de
l’eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait sur mic
roscope photonique.
a) 1. Mode opératoire
-Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre.
 
-Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder
les contours de la lamelle).-Luter la lame avec de la paraffine fondue.-Observer
immédiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relevé au
maximum (diaphragme non complètement ouvert).
-Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel.
a) 2. Observation au microscope
Elle se fait en lumière blanche, éclairage direct de la préparation
(grossissement : objectif x40)
. 1. 2. 2. Techniques de coloration simple : bleu de méthylèneb) 1.
Technique
-Faire un frottis des bactéries sur une lame propre et sèche : avec une anse on étale
doucement un peu de suspension bactérienne sur le milieu de la lame.-Sécher.-Fixer à
l’alcool et rincer à l’eau, ou fixer à la flamme en passant la lame trois fois dans
la flamme du bec Bunsen réglé en flamme éclairante (virole fermée).-Recouvrir d’une
solution de bleu de méthylène pendant une minute. Rincer et sécher entre deux
papiers-filtres. Eliminer l’humidité résiduelle au-dessus de la veilleuse du bec
Bunsen

Introduction de tt les TP :

La microbiologie est une sous-discipline de la biologie consacrée à l'étude des

micro-organismes.

Autrement dit c’est la science ayant pour objet l’étude des microbes (micros
 : petit, bios : vie) .Ce terme englobe sans distinction tous les micro-organismes
vivants.Les micro-
organismes constituent un monde, fait d’unités cellulaires vivantes, vastes et
complexes. Cette considération est due au lien entre ces êtres vivants et les
maladies. Le développement de visualisation a permis de connaître les données
structurelles, métaboliques et les diverses actions de ces micro-organismes.
Dans nos séances de travaux pratiques,
On a essayé d’appliquer et déterminer quelques
importantes opérations pour pouvoir mieux comprendre la microbiologie :La
première séance a eu comme grand titre : la mise en évidence de le présence des
micro-organismes dans différentes biotopes, puis dans la deuxième séance on a
vu les différentes
Techniques d’ensemencement et d’isolements, dans la troisième on a établit l
À coloration Gram et dans les quatrièmes et cinquièmes séances,
On a bien fait une analyse d’eau.
 En suite de notre rapport on va essayer de bien développer et expliquer toutes
ses expériences et établir les différents résultats de chacune de ces opérations.