COMPTE RENDU DE TP n°2 :

-Techniques d’ensemencement et
d’isolement des microorganismes
1. Principe :
-Afin de pouvoir identifier une espèce bactérienne de façon
convenable, il faut obtenir des colonies bien isolées. Le principe est
d’épuiser un dépôt initial en faisant des étalements successifs dans
différentes directions (d’où le nom de la technique : épuisement par
la méthode des quadrants).

Plusieurs techniques sont couramment appliquées : 3, 4 ou 5

étalements successifs

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 Définition de ENSEMENCEMENT :

- c’est un Procédé consistant à introduire, dans un

milieu de culture préparé, des germes microbiens,
des bactéries ou un produit organique suspecté de
contenir des bactéries pathogènes afin de les mettre
en évidence.

-Ensemencer : consiste à déposer un

microorganisme dans un milieu de
culture neuve et stérile.

 Nous vous rappelons

quelques règles
élémentaires
concernant l’ensemencement
:
- Travailler en zone stérile La
désinfection de vos paillasses
- Le pipetage à la bouche est strictement
interdit (risques de contamination bactériologique)
- La pipette Pasteur ne sert qu'une fois seulement
- Tester la stérilité de boites coulées : incuber les boites dans une
étuve à 35°C pendant 18 à 24h, même haut de là, l’absence de
culture bactérienne valide le test.
L’ensemencement doit être effectué dans des conditions
d’asepsie rigoureuses à partir d’un prélèvement d’une colonie ou
d’un bouillon bactérien avec une anse de platine ou une pipette de
pasteur, peut être réalisé sur un milieu liquide ou solide.

2.Outils d’ensemencement :
Anse de platine, Pipettes Pasteur ….ect

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-les milieux de
cultures : sont indispensables à la
multiplication bactérienne, ce qui
permet par la suite l’identification ainsi que l’étude de la sensibilité
aux antibiotiques lorsque la bactérie est isolée en culture pure.

-Un milieu de culture :  est une préparation au sein de

laquelle des micro-organismes peuvent se multiplier. Il doit donc
satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme étudié et
posséder les propriétés physico-chimiques convenant à cette culture:
Couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance,
apporter la source de carbone, d’énergie et d’azote .
Présenter un pH voisin au pH optimal , une pression osmotique et
une viscosité adéquate.

◉. Classification des milieux de culture selon leur

nature physique :
1. Milieu de culture liquide

L'agar n'est pas ajouté lors de la préparation du milieu, la croissance

se traduit par un trouble, un dépôt ou une voile superficielle. La
présence de plus d'un type de bactéries ne peut pas être détectée et
les cultures mixtes ne peuvent pas être séparés.
Exemple : bouillon nutritif, bouillon trypticase soja.

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2. Milieu de culture semi-solide

Contenant 0.5-0.75 % d’agar de consistance molle, il est utilisé pour

démontrer la motilité bactérienne.
Exemple: Milie u mannitol mobilité.

3. Milieu de culture solide

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On obtient un milieu solide en ajoutant un agent gélifiant, "l’agar-
agar" ou gélose, à un milieu liquide. Il permet l'identification des
bactéries en étudiant les
caractères des colonies
(morphologie, pigmentation,
l'hémolyse...) et Les cultures
mixtes peuvent être séparées.
Exemple: Gélose
nutritive, Gélose trypticase,
soja Gélose Cled.

Composants sélectifs /
différentiels
La sélectivité : Les milieux de
culture peuvent contenir des composants sélectifs qui inhibent la
croissance de micro-organismes non ciblés. Ces milieux sont
particulièrement utilisés pour l'isolement de micro-organismes
spécifiques à partir de populations mixtes.

Plusieurs techniques sont utilisées pour rendre le milieux sélective :

 En ajoutant un composant toxique : sels biliaires, le sélénite,

des concentrations élevées de chlorure.
 En ajoutant d'antibiotiques : le cycloheximide, la gentamicine,
l'acide nalidixique, la vancomycine.
 En utilisant une seule source d’énergie.

La différenciation : Les milieux différentiels permettent de distinguer

un type de micro-organisme d'un autre se développant sur le même
milieu. ils contiennent des composés qui permettent de distinguer
visuellement des groupes de micro-organismes par l'apparence de la
colonie ou du milieu environnant,

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  Certains milieux comprennent des indicateurs qui permettent la
détection visuelle des changements suite à la production
d'acide à partir de divers glucides et d'autres sources de
carbone ou sur la décarboxylation d'acides aminés.
 D'autre milieux comprennent des colorants chromogéniques
qui changent de couleur lorsque des réactions enzymatiques
spécifiques se produisent

3. Techniques d’ensemencement :
Avant toute manipulation, il faut rassembler tout le matériel dont on
a besoin.
On l’organise de façon à les avoir dans la zone stérile (à proximité du
bec).
Selon l’objectif visé, on utilisera différentes techniques :
3.1. Ensemencement dans le tube
a) Ensemencement dans le tube de bouillon
-Devant le bec, prendre le tube contenant les
microorganismes dans la main gauche,
déboucher le et garder le bouchon dans la main
droite, ensuite flamber l’ouverture du tube.
-Stériliser l’anse dans la flamme du bec et la
laisser refroidir.
-Plonger l’anse dans la suspension bactérienne
réalisée à partir d’une colonie que l’on veut
identifier ou confirmer.
-Prendre une goutte de la suspension.
-On la retire sans toucher les parois du tube, l’anneau de l’anse
contient une bulle de suspension avec des germes, c’est l’inoculum.
-Ensuite reflamber l’ouverture du tube et remettre le bouchon.

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-On plonge ensuite l’anse dans le tube de bouillon neuf et stérile
(après flambage de son col).
-On l’agite sur toute la hauteur afin de répartir la suspension dans
tout le milieu.
-Reflamber l’ouverture du tube ensemencé et refermer le.
-Repasser le fil de platine à la flamme en le portant au rouge.
-Incuber le tube ensemencé dans l’étuve.

Remarque:
-On prendra en garde à conserver tout les objets dans la zone stérile

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du bec bunsen et de ne jamais les faire entrer en contact avec la
paillasse.
-Les bouchons des tubes seront passés à la flamme du bec avant et
après toute manipulation, tout comme les instruments.
- Dans le cas d’utiliser une Pipette Pasteur :
 La pipette est passée rapidement dans la flamme.
 A l’aide d’une pince stérile, sectionner la pipette à la pointe scellée.
 Aspirer le bouillon de culture.
 Ensemencer dans les tubes sans souffler.
 La pipette Pasteur ne sert qu’une seule fois

b) Ensemencement dans le tube étroit de gélose en

culot
Il est ensemencé grâce à une pipette Pasteur en réalisant un
mouvement hélicoïdal du fond vers la surface, la suspension
bactérienne est libérée progressivement. (test type respiratoire)
c) Ensemencement dans le tube de gélose inclinée
(pente) :

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-On utilise l’anse chargée de suspension selon le procédé décrit pour
le milieu liquide.

- On réalise des stries espacées sur toute la longueur de la pente en

commençant par le fond du tube et en remontant. (conservation du
microorganisme)

e) Ensemencement dans le tube de gélose semi-

inclinée (culot + pente)
Le culot est classiquement ensemencé par piqure centrale par
pipette Pasteur boutonnée et la pente par stries selon le principe de
la gélose inclinée. (test type respiratoire) 3.2. Ensemencement

3.2. Ensemencement dans la boite de Pétri

(contient le milieu de culture solide)

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1 Isolement ou épuisement :
La méthode des quadrants consiste à diviser une boîte de Petri en
deux (50 % et 50 %), puis de diviser de nouveau par deux une moitié
afin d'obtenir 3 quadrants de 50 %, 25 % et 25 %. Sur le plus
grand quadrant une petite quantité d'inoculum est posée puis étalée.
Ainsi permet de retrouver tous les microorganismes d’un mélange, mais aussi
de vérifier la pureté d’une souche bactérienne.

Technique :

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-Sur boite de pétri préalablement
séchée sur laquelle on a dessiné des
quadrants, déposer le produit à
analyser sur le 1er quadrant
- réaliser des stries très serrées
ensuite passer au 2e sans toucher le
1er,
- ou stériliser la pipette ou l’anse et
reprendre du 1er quadrant,
- les stries doivent être toujours
serrées ensuite passer au 3e et au 4e
quadrant en desserrant légèrement
les stries,
-la culture se traduit par des colonies
sur les stries.
-Sur ce milieu, on pourra définir l’aspect des colonies, mais aussi la
présence ou non de l’hémolyse complète ou incomplète lorsqu’il
s’agit d’une GSF.

4. Incubation

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-On place les boites et les tubes dans une étuve qui va réguler et
maintenir la température à la valeur favorable à leur croissance
durant toute la période nécessaire.
-La température optimale pour :
* Les moisissures et levures est de 30°C
* Pour Escherichia coli et plusieurs autres bactéries
est de 37°C.

-Le temps d’incubation est variable d’un

germe à l’autre :
* variant de 24h à 72h pour la majorité des bactéries
et levures,
* une semaine pour les moisissures
* et de 10 à 15 jours pour les actinomycètes.

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