République Algérienne Démocratique et Populaire

MINISTER DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE HADJ LAKHDAR -BATNA1-
INSTITUT DES SCIENCES VETERINAIRES ET DES SCIENCES AGRONOMIQUES
DEPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE

Licence 3 : « Technologie Agroalimentaire et Contrôle de qualité »

Module : Microbiologie Alimentaire

Réalisé par : proposé par :

1- BENZINA Nedjla Mme BOUALI.A

2- BELHADI Ikram
3- BENABID Meriem

Année Académique :

2020_2021
Le contrôle de la qualité microbiologique de nos aliments reste indispensable car il
permet d’éviter la commercialisation et la consommation de produits dangereux ou non
conformes. Ceci ce fait par des analyses règlementées et régit par normes (nationales ou
internationales) qui souvent imposent que l’aliment soit exempte de tous germe
pathogène ou de toxine microbienne et que la flore totale soit peu abondante.
La qualité sanitaire du produit fini se base sur la numération des germes totaux (FTAM et
coliformes totaux) , les germes indicateurs d’une contamination fécale qui sont les
coliformes fécaux (souvent associés aux pathogènes tels que : Salmonella et Shigella),
Streptocoques fécaux ( ou Entérocoques), les germes indologènes, les germes indicateurs
d’une contamination tellurique (sol) comme les anaérobies sulfito-réducteurs ainsi que la
recherche des germes ubiquitaires et d’origine humaine ou animales comme
Staphylococcus aureus (qui aussi toxinogène).
Ces analyses passent par plusieurs étapes dans le laboratoire microbiologiques.

1) Matériel :
2) Préparation de dilutions décimales :

Dillution d'un aliment liquide :

• Homogénéiser la suspension microbienne à prélever.
• Ouvrir le tube.
• Prélever 1 mL de suspension à l’aide de la pipette plastique stérile.
Ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1 cm.
• Refermer le tube.
• Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, y introduire le volume prélevé sur la paroi
sans toucher le liquide.
• Refermer le tube, jeter la pipette souillée dans la poubelle.
Dilution d’un aliment solide :
Si le produit est solide, on ne peut pas pipeter. L’analyse comprend alors
obligatoirement la réalisation d’une suspension de l’aliment broyé dans un
diluant.
On s’arrange pour que cette préparation corresponde à une dilution au 1/10ème
de l’aliment.
Pour cela, on broie, par exemple, 25 g d’aliment (de densité approximée à 1
g/mL : 25 mL
D’aliment a une masse d’environ 25 g) dans 225 mL de diluant (eau peptonée
par exemple).
3) La préparation de milieu de culture :
 Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-
organismes peuvent se multiplier .il doit donc satistisfaire les exigences
nutritives du micro-organisme étudié.
Milieux culture :
 Préparation nutritive destinée à la croissance de microorganisme en
laboratoire
 peuvent être liquide ou solides
 Milieux synthétiques
 Milieux complexes
Milieux solide :
 milieu liquide auquel on ajoute un agent de solidification tel que l’agar –agar
 l’agar –agar est un polysaccharide extrait d’une algue marine
 c’est un gel qui est à l’état solide à une T° de moins de 60 °C et qui se
liquéfie à 100°C
 permet donc l’incubation à des T° élevées
 n’est pas une source nutritive pour les bactéries
 permet d’obtenir des colonies isolées
Milieux liquides :
 ces milieux sont la plupart du temps des bouillons nutritifs ordinaires .ils ont
trois composants principaux : les peptones, les extraits de viandes et les
extraits de levures
 les peptones sont des hydrolyses enzymatiques de protéine animales ou
végétales riches en acides aminés et en peptides.
 les extraits de viandes apportent des sels minéraux, des vitamines, des
protéines ; peu de glucides.
 les extraits de levure eux représent d’acides aminés et des vitamines .
Milieu sélectif :
 inhibe la croissance des bactéries indésirables et stimule celle des microbes
recherchés
 contiennent des agents inhibiteurs (Ab , sel, colorant)
Ex : cristal violet et sels bilaires dans la gélose MacConkey
Milieux sélectif –différentiel :
 posséde les caractéristiques des milieux sélectifs et différentiels
Ex : MacConkey
Mannitol Salt
Milieux d’enrichissement :
1.milieu liquide :
 donne des conditions favorables à la croissance d’un seul microbe donné ce qui
en favorise la multiplication
Ex : milieu sélénite utilisé dans les spécimens de selles pour favoriser la
croissance des salmonelles et des shigelles au détriment des autres bactéries
présentes .
2.Milieux différentiel :
 facilite la distinction entre les colonies de la bactérie recherchée et les autres
colonies présentent sur le même milieu.
Gélose Mannitol Salt composition :
 extrait de bœuf
 peptones
 NaCL 7.5 :élélent sélectif
 Mannitol : élément différentiel
 rouge de phénol : indicateur de pH
 utilité : isolement des bactéries halophiles comme les staphylocoques.
4) Ensemencement :
Un ensemencement en masse est le plus souvent réalisé afin de dénombrer des
micro-organismes. Un volume de 1 mL d’inoculum est dispersé dans le fond
d’une boite de Pétri, et le milieu de culture est ensuite coulé par-dessus.
 Techniques de l’ensemencement :
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés
dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une
anse ou une pipette Pasteur.
1 /Ensemencement avec une anse :

 prendre les précautions nécessaires pour travailler dans de bonnes

conditions d’aseptie (nettoyage paillasse, mains ...)
 veiller à travailler dans la zone stérile autour du bec Bunsen
 tenir le tube contenant la culture mère dans la main gauche, déboucher
près de la flamme et garder le coton dans la main.
 flamber l’ouverture du tube.

 stériliser l’anse en le portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la

laisser refroidir dans la zone stérile.
 prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de
repiquage :
*repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la
boucle
*repiquage sur milieu solide: repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la
surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant
soin de ne pas érafler la gélose .
 repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en le portant au rouge.
L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement.
 flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher .

2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur :

Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :
 la pipette est passée rapidement dans la flamme.
 l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.
 on aspire les bouillons de culture (éviter que le bouillon de culture souille
le coton, danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du
manipulateur, danger d'infection pour la culture)
 on souffle pour ensemencer dans le tube stérile
 La pipette ne sert q’ une fois
5) Isolement :
Pour étudier les microorganismes ; il est indispensable de les isoler et d’en faire une
culture pour deux techniques sont alors utilisées :
_la méthode des strie
_la méthode des dilutions
 méthode des stries :
cas d’un ensemencement en surface à partir d’un prélèvement liquide ou solide :
-prendre les précautions habituelles pour un ensemencement (n’ouvrir que le temps
nécessaire à l’exécution des strie et n’entrebâiller alors la boite que devant un bec
bensen )
-porter l’anse au rouge dans la flamme du bec ; la laisser refroidir dans la zone
stérile et avec l’autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube (liquide )
-prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l’anse ,refermer la boite ou
le tube et prendre la boite vierge
-ensemencer de la façon suivantes :
-partir de 1 en ensemençant selon le sens des flèches jusqu’à vers 2.flamber
l’anse ;la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction précédente 1-
2jusqua vers 3.
 -les boites de pétri sont lises en position renversée à30°C.observer après
24à48heures selon le cas (la position renversée permet à l’eau de condensation
de s’évaporer ).
Coloration de gram : c’est la coloration de base en bactériologie qui permet de
distinguer les bactéries en gram positif et en gram négatif ;cette distinction est
fondamentale pour leur identification .en effet ;le violet de gentiane se fixe sur des
composants cytoplasmiques et après ce temps de coloration ; toutes les bactéries sont
violettes .chez les bactéries à gram négatif ;la paroi ,riche en lipides ,laisse passer
l’alcool qui décolore le cytoplasme alors que ;chez les bactéries à gram positif ;ma
paroi constitue une barrière imperméable à l’alcool et le cytoplasme de leur coloré en
violet .

. Caractères généraux du groupe :

Les membres de la famille des Enterobacteriaceae se trouvent comme parasites, parfois
pathogènes ou commensaux chez l'homme et autres animaux, et comme saprophytes dans
le sol et les eaux. Ils sont très répondus dans la nature en raison de la contamination de
l'environnement par les matières fécales animales et des eaux d'égouts. Ce sont des
contaminants alimentaires très fréquents. Certains sont dangereux et peuvent être à l'origine
d'intoxications. Cette famille comprend des bacilles Gram-, non sporulant, anaérobies
facultatifs, mobiles (le plus souvent flagellés péritriches) ou non, isolés ou par paires.
Chimioorganohétérotrophes, croissent habituellement sur des milieux de base. Les sources
de carbones incluent les sucres. Métabolisme respiratoire et fermentatif. Oxydase-,
catalase+, à l'exception de quelques souches . Bactéries indicatrices, elles peuvent signifier
un défaut d’hygiène lors des processus de fabrication: une contamination fécale,
environnementale, une insuffisance des procédés de traitements, un défaut d’hygiène du
matériel et de l’équipement utilisés, ou une contamination croisée d’une autre origine
(végétale par exemple). Pour les produits prêts à consommer et conservés sous réfrigération,
les entérobactéries peuvent également signifier une conservation à des températures trop
élevées ou pendant une durée trop longue.
Il y a des groupes de bactéries comme :

Les Coliformes :

C'est un groupe de bactéries appartenant à la famille des

Enterobacteriaceae . On appelle coliforme tout bacille Gram-négatif, non
sporulant, anaérobie facultatif, capable de fermenter le lactose dans 48 heures,
avec formation d'acide et de gaz, à 37°C, Escherichia coli est un coliforme
typique. Mais il y a aussi d'autres coliformes: Citrobacter, Enterobacter,
Klebsiella . En microbiologie alimentaire les coliformes sont une flore
indicatrice de contamination fécale et de bons marqueurs de la qualité
hygiénique générale d'un aliment .

o groupes des coliformes fécaux :

Genre Escherichia :

Il existe plusieurs espèces d'Escherichia, la plus importante est E. coli.

Elle est lactose+, gazogène, réalise une fermentation mixte, elle produit de
l'indole. C'est un hôte normale de l'intestin de l'homme et des animaux, et est
très abondant dans les matières fécales. Certains sérotypes peuvent être
pathogènes et provoquent des troubles digestifs spécifiques, possédant une ou
plusieurs toxines (hémolysine, cytotoxine, et entérotoxine). , certains biotypes
sont rencontrés dans les infections urinaires: Des produits d'origine animale
(viandes et certains produits laitiers), parfois l'eau, sont incriminés dans la
contamination par E. coli.

Genre Salmonella :

Les Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae.

Habituellement mobiles (formation d'acide et de gaz à 37 °C et Pathogènes chez
l'homme et les animaux. On retrouve les salmonelles surtout dans les produits
d'origine animale (œufs, lait, viandes, volaille, charcuterie, poisson), l'eau
polluée et les produits consommés crus.

Genre Staphylococcus :

Les membres de ce genre sont des coques Gram+, souvent en amas. Certaines
espèces contiennent des pigments caroténoïdes orange ou jaune. Non mobiles,
anaérobies facultatifs, chimioorganohétérotrophes. catalase+. Le staphylocoques
sont répartis en souches coagulase+ et souches coagulase- . Ils sont commensaux
et pathogènes chez l'homme et chez d'autres animaux S. aureus coagulase+ est
pathogène, il produit des entérotoxines thermostables Les aliments dangereux
sont nombreux: viandes, plats cuisinés, produits à base de lait ou d'œufs,
pâtisserie, crèmes glacées, etc. Les aliments à haute concentration en sels et en
sucres constituent un bon milieu de croissance pour S. aureus.

Genre Clostridium :

Ces bactéries appartiennent à la famille des Bacillaceae. Il s'agit de

bactéries communément rencontrées dans le sol, les eaux d'égout et l'intestin.
Elles peuvent contaminer et dégrader les produits alimentaires dans des
conditions anaérobies (Conserves). Les Clostridium sont des bacilles Gram+,
souvent de grande taille, isolés ou en chaînettes., ils sont généralement
immobiles. Catalase- et anaérobies strict, l'oxygène est létal pour ces espèces Ils
contaminent de nombreux produits : l’eau, le lait, le poisson, les aliments
fermentés ou congelés et surtout les conserves alimentaires. Les Clostridium
sont classés en fonction de leur métabolisme et de leur action sur le substrats .

Genre Streptococcus sp :

Les maladies provoquées par les streptocoque hémolytiques sont fréquemment

transmises par les aliments ; mais leur fréquence est faible. ainsi les normes
visant streptococcus pyogènes sont rares .il est peu courant que les streptocoques
fécaux soient impliqués dans des maladies d’origine alimentaire .les
entérocoques sont des indicateurs de contamination fécale en particulier dans les
aliments congelés ou ils survivent plus longtemps et mieux que les coliformes .

Les levures :

Les levures sont des champignons pour tout ou partie de leur cycle végétatif.
La température optimale se culture des levures se situe en général entre 25 C° et
30C°mais colle les autres microorganismes mes levures peuvent être classées
en levures psychrophiles mésophile et thermophiles.

Les moisissures :

Les moisissures sont des champignons microscopiques ; comme les levures,

elles mènent une vie saprophytique, se développant aux dépens de substrats
inertes ou en voie de décomposition, mais elles se distinguent des levures par
leur appareil végétatif constitué de filaments mycéliens.

Colimétrie : c’est-à-dire la numération des coliformes ;peut être réalisée soit en

milieu liquide ,soit en milieu solide (par ensemencement dans la gélose ou après
filtration ) .

 Le contrôle de la qualité microbiologique de nos aliments reste

indispensable car il permet d’éviter la commercialisation et la consommation
de produits dangereux ou non conformes. Ceci ce fait par des analyses
règlementées et régit par normes (nationales ou internationales) qui souvent
imposent que l’aliment soit exempte de tous germe pathogène ou de toxine
 microbienne et que la flore totale soit peu abondante. La qualité sanitaire du
produit fini se base sur la numération des germes totaux (FTAM et
coliformes totaux) , les germes indicateurs d’une contamination fécale qui
sont les coliformes fécaux (souvent associés aux pathogènes tels que :
Salmonella et Shigella), Streptocoques fécaux ( ou Entérocoques), les germes
indologènes, les germes indicateurs d’une contamination tellurique (sol)
comme les anaérobies sulfito-réducteurs ainsi que la recherche des germes
ubiquitaires et d’origine humaine ou animales comme Staphylococcus aureus
(qui aussi toxinogène). A travers ce travail pratique, nous allons rechercher
ces différentes flores sur deux denrées alimentaires ayant subi une
pasteurisation et comparer les résultats obtenus aux normes afin de juger de
leur conformité.

TP n=°01 : Analyse microbiologique de

lait pasteurisés :

Le lait est un aliment hautement nutritif par sa richesse en glucides, protéines, lipides,
vitamines et sels minéraux, mais peut néanmoins présenter un danger pour le
consommateur lorsqu’il renferme des microorganismes pathogènes ou d’altération
capables d’abaisser significativement sa qualité sanitaire et commerciale,
respectivement. La qualité du lait peut être affectée par de nombreux facteurs tels que
les contaminations au cours et après la traite,
la présence d'infections mammaires ainsi que l'adultération. Le contrôle
microbiologique du lait pasteurisé est indispensable, car la plupart s'imaginent, à tort,
que tout lait pasteurisé peut être consommé sans danger. Les contrôles officiels au
niveau des marchés se limitent à la constatation des falsifications ou simplement les
altérations visibles à l'œil nu. Ces contrôles doivent être Suivis par le contrôle
microbiologique au laboratoire. Les germes concernés sont : les microorganismes
aérobies à 30°C (Flore Totale Aérobie Mésophile, FTAM), les coliformes totaux et
fécaux, Staphylococcus aureus .
 Dénombrement et identification des microorganismes recherchés pour le
contrôle microbiologique du lait pasteurisé.

Le principe consiste en premier lieu à faire isoler la population

bactérienne qui se trouve dans notre échantillon (lait ) , puis faire
étaler les différentes dilutions préparées à partir de la suspension ; sur
différents milieux de cultures ; pour favoriser la croissance de telle ou
telle population qui se trouve dans notre échantillon ; et par la suite ça
va nous donner une idée sur l’état microbiologique de notre produit
alimentaire .

 Recherche et dénombrement des germes aérobies

mésophiles totaux (FTAM) :
A partir ses dilution décimale allant de 10-1 a 10-4 , porter aséptiquement
1 ml dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et numérotée . compléter
en suite avec environ 20ml de gélose PCA fondue puis refroidie à 45 +-1°C.faire
ensuite des mouvements circulaire et de va et vient en forme de « 8 »pour
permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose .Laisser solidifier sur
paillasse ; puis ajoutes une deuxième couche d’environ 5ml de la même gélose
ou de gélose blanche .cette double couche a un rôle protecteur contre les
contaminations diverses

Incubation :

Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72heurs

avec : _première lecture à24 heures

_deuxième lecture à 48 heures

_troisième lecture à 72 heures

Lecture :

Les colonies des GAMT se présentent sous forme lenticulaire en masse

 Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en
tenant compte des facteurs suivants :

-ne dénombrer que les boites contenant entre 15et 300 colonies

- multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution

- faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différents

dilutions

 Recherche et dénombrement des coliformes :

Les coliformes sont dénombrer :

*soi eu milieu solide par la technique en boites sur gélose ai déso-

xycholate à 1 / ou sur gélose VRBL (gélose lactosée biliée au vert brillant et au
rouge de phenol)

*soit eu milieu liquide par la technique de NPP (nombre le plus probable à

l’aide du bouillon VBL (Bouillon lactosé bilié au vert brillant ) réparti à raison
de 10 ml par tubes munis au préalable d’une cloche de Durham .

En milieu solide :

A partir des dilutions décimales 10-4 à10-1 , porter aséptiquement 1 ml de

chaque dilution dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et numérotée
.cette opération doit être effectuée en double pour chaque dilution car :

- La première série de boites sera incubée à37°C et sera reservée à la

recherche des coliformes totaux
- La deuxième série de boites sera incubée à44°C et sera réservée à la
recherche des coliformes fécaux
Compléter ensuite avec environ 15 ml de gélose au désoxycholate
1/fondue puis refroidie à 45 +- 1°C
Faire ensuite des mouvements circulaires et de va –et vient en forme
de « 8 » pour bien mélanger la gélose à l’inoculum
Laisser solidifie les boites sur paillasse puis couler à nouveau environ
5ml de la même gélose , cette double couche a un rôle protecteur
contre les diverses contaminations
Incubation :
Les boites seront donc incubées couvercle en bas pendant 24 à 48 heures à :

-37°Cpour la première série (recherche des coliformes totaux)

-44°C pour la deuxième série ( recherche des coliformes fécaux )

Lecture :

Les coliformes (totaux et fécaux ) apparaissent en masse sous forme de petite

colonies de couleur rouge foncé et de 0.5mm de diamètre ,fluorescentes .la
fluorescence de ces colonies est mise en évidence lors de leur observation sous
une petite lampe à UV dans une chambre noire

En milieu liquide :

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

-le test de présomption : réservé à la recherche des coliformes totaux

-le test de confirmation : appelé encore test de Mac Kenzie et réserve à la

recherche des coliformes fécaux à partir des réactions positives du test de
présomption

*Test de présomption :

Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif (VBL) à
raison de trois tubes par dilution

A partir des dilutions décimales 10-4à10-1, porter aseptiquement 1 ml dans

chacun des trois tubes correspondant à une dilution .chassez le gaz présent
éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et
l’inoculum.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures .

Lecture :

Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :

-un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche )

- un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui

constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu )
Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les
conditions opératoires décrites .

La lecteur finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady

*Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :

Les tubes de VBL trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes totaux
feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une ose bouclée dans à la fois :

- Un autre tube de VBL muni d’une cloche de Durham

- Un tube d’eau peptonée exempte d’Indole .
Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches et bien
mélanger le milieu et l’inoculum .
Incubation :

L’incubation se fait cette fois –ci au bain marie à 44 °C pendant 24heures

Lecture :

Sont considérés comme positifs ,les tubes présentant à la fois :

-un dégagement gazeux dans les tubes de VBL

- un anneau rouge en surface ,témoin de la production d’indole par E.Coli

après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de kovacs dans le tube d’eau
peptonée exemple d’indole

La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table de

Mac Grady en levant compte du fait que E. coli est à la fois producteur de gaz
et d’indole à 44 °C .

 Recherche et dénombrement des levures et des

moisissures :
Milieu : gélose glucosée a la pomme de terre

Mode opératoire :

-préparer et inoculer autant de boites de pétri qu’il Ya de dilutions à étudier

- faire fondre au préalable le milieu de culture et le refroidir en le maintenant

dans un bain d’eau à 45-50°C , puis l’acidifier stérilement pour l’obtenir à ph 3.5
, ou 4.5 , on ajouter la quantité requise de terra lycine
-couler le milieu dans les boites de pétri dans les délais les plus rapide

-incuber les boites de pétri à 20-25°C pd 5 jours

*résultats et interprétation :

Levures : identiques aux colonies bactériennes

Moisissures : colonies toujours pigmentés ;à l’aspect velonté plus ou moins

proéminent .

 Recherche de staphylococcus Aureus :

Selon la disponibilité des milieux des cultures, trois techniques différentes
sont recommandés de recherche de staphylococcus aureus à savoir :

- méthode de Baird Parker

-méthode d’enrichissement sur milieu de Giolitti Cantoni

- méthode d'enrichissement sur milieu de Chapman.

A- Méthode de Baird Parker :

Préparation du milieu :

Au moment de l'emploi faire fendre un flacon contenant 225 ml de gélose Baird

Parker, le refroidir , ensuite dans un bain d'eau à 45C° , puis ajouter 15ml d'une
solution de j'aune d'œuf au Tellurite de potassium

mélanger soigneusement et aséptiquement , puis repartir le milieu en boite de

pétri à raison de 15 à 18 ml par boîte .

Laisser solidifier les boites sur paillasse , puis les sécher en les plaçant
retournées couvercle en bas dans une étuve de séchage réglée entre 45 à 55C° .

Ensemencement :

À partir des dilutions décimales 10-4 dans le cas des toxi-infections alimentaires
et à partir de 10-³ des contrôles de routine porter aséptiquement 1 ml de chaque
dilution reparti en surface à raison de trois fraction sensiblement égale dans trois
boites contenant le milieu de Baird Parker puis étaler à l'aide d'un même étaleur ,
en commençant par les boites de plus haute dilution .

Incubation : l'incubation se fait à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Lecture :

Seront considérées comme positives , les boites contenant des colonies

caractéristiques à savoir des colonies noires brillantes convexes entourés d'une
zone de transparence qui peut être translucide .

Après 24 heures , peut apparaître dans cette zone transparente , un anneau

opalescent immédiatement au constat des colonies.

Pour s'assurer qu'il s'agit bien de colonies staphylococcus aureus effectuer

sur 2 à 3 colonies de chaque boite des tests biochimiques rapides à savoir :

- une épreuve a la catalase ( à l'aide de l'eau oxygénée )

- une épreuve à la coagulase ( à l'aide de plasma de lapin) .

B- méthode d'enrichissement au milieu de Giolitti Cantoni :

préparation du milieu :

Au moment de l'emploi ouvrir aséptiquement le flacon contenant milieu de

Giolitti Cantoni pour y ajouter 15 ml d'une solution de Telurite de Potassium,
mélanger soigneusement le milieu et alors prêt à l'emploi.

Ensemencement :

À partir des dilutions décimales retenues porter aséptiquement 1 ml par dilution

dans un tube avis stérile , ajouter par la suite environ de 15 ml du milieu
d'enrichissement , bien mélanger le milieu et l'inoculum.

Incubation :

L'incubation se fait à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Lecture : Seront considérés comme positifs , les tubes ayant vires au noir pour
s'assurer qu'il s'agit bien d'un développement de staphylococcus aureus ces tubes
feront l'objet d'un isolement sur gélose Chapman préalablement fondue coulée
en boites de pétri et bien séchées .

Les boites de Chapman ainsi ensemencées seront incubées à leur tour à 37C°
pendant 24 à 48 heures .
Après ce délai repérer les colonies suspectes à savoir les colonies de taille
moyenne lisse brillante pigmentées en jaune et pourvus d'une catalase et d'une
coagulase .

Expression des Résultats :

-Si la dilution 10-³ le tube a noirci au bout de 24 heures d'incubation mais à

l'isolement sur Chapman il n'y a pas de colonies caractéristiques ce tube est
considéré comme négatif .

-Si par contre à la dilution 10-¹ le tube a noirci au bout de 24 hrs et a l'isolement
il y'a des colonies caractéristiques , il faut tenir compte de la dilution en question
car le norme réel de staphylococcus aureus correspond à l'inverse de la dilution

Dans ce cas il ya donc 10 staphylococcus aureus par gramme ou millilitre de

produit à analyser

C-Méthode d'enrichissement sur milieu de Chapman liquide :

Ensemencement :

A partir des dilutions décimales retenues porter aséptiquement 1 par dilution

dans un tube contenant 10 ml de solution du Chapman liquide bien mélanger le
milieu et l'inoculum .

Incubation : l'incubation se fait à 37 C° pendant 24 à 48 heures

Lecture : seront considérés comme positifs, les tubes présentant un trouble

microbien mais pour s'assurer qu'il s'agit bien D'un développement de
staphylococcus aureus ces tubes feront l'objet d'un isolement sur gélose
Chapman préalablement fondue puis refroidie et coulé en boîtes et séchés

Ces boites seront a leur tour incubées à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Staphylococcus aureus se présente alors sous forme de colonies de taille
moyenne lisse brillante pigmentées en jaune et pourvus une catalase et d'une
coagulase.

L’appréciation de la qualité bactériologique du lait consiste en la

recherche des germes pathogènes, des germes utiles et des germes nuisible à la
conservation. Ces micro-organismes peuvent proliférer dans le lait qui constitue
un excellent milieu de culture. Selon l’intérêt de l’étude, on oriente donc notre
recherche. Dans ce cas précis, on s’intéresse aux staphylococcus aureus et
levure et moisissure qui peuvent être gênants pour le consommateur.

TP n=°02 : Analyse microbiologique de

viande hachée :

La viande et les produits carnés sont particulièrement sensibles à la prolifération

bactérienne , en raison de leur haute teneur en eau et en substance nutritives . la
viande est stérile au départ , lais dés qu’elle est coupée , les surfaces exposées à
l’air ambiant fournissent des conditions idéales pour le développement des
bactéries . la viande hachée est encore plus exposée .pour cette raison ,des
contrôles d’hygiène et de température pendant le traitement et le pré
conditionnement –consistant à garder les outils et équipements propres –sont
d’une importance vitale pour minimiser la contamination du produit par les
micro-organismes .

Analyser la viande hachée cru en déterminant les microorganismes qu’elle

contient et en identifiant leurs différents types .

Le principe consiste en premier lieu à faire isoler la population bactérienne qui

se trouve dans notre échantillon (viande hachée) , puis faire étaler les
différentes dilutions préparées à partir de la suspension ; sur différents milieux
de cultures ; pour favoriser la croissance de telle ou telle population qui se
trouve dans notre échantillon ; et par la suite ça va nous donner une idée sur
l’état microbiologique de notre produit alimentaire .
Préparations des dilutions :

 Peser 1 g de viande hachée

 Faire un broyage dans un mixeur jusqu’à obtenir un mélange homogène :
broyat .
 Effectuer à partir de ce broyat nos différentes dilutions : à
 Recherche et dénombrement des germes aérobies
mésophiles totaux (FTAM) :
La recherche de la FTAM dans la viande est faite comme celle pour le lait
mais avec l’utilisation de la gélose nutritive ou TGEA au lieu de la gélose
PCA.
A partir ses dilution décimale allant de 10-1 a 10-4 , porter aséptiquement
1 ml dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et numérotée .
compléter en suite avec environ 20ml de gélose PCA fondue puis
refroidie à 45 +-1°C.faire ensuite des mouvements circulaire et de va et
vient en forme de « 8 »pour permettre à l’inoculum de se mélanger à la
gélose .Laisser solidifier sur paillasse ; puis ajoutes une deuxième couche
d’environ 5ml de la même gélose ou de gélose blanche .cette double
couche a un rôle protecteur contre les contaminations diverses
Incubation :
Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72heurs avec
: _première lecture à24 heures
_deuxième lecture à 48 heures
_troisième lecture à 72 heures
Lecture :
Les colonies des GAMT se présentent sous forme lenticulaire en masse
Dénombrement :
Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en
tenant compte des facteurs suivants :
-ne dénombrer que les boites contenant entre 15et 300 colonies
- multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution
- faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différents
dilutions
 Recherche et dénombrement des coliformes :
Les coliformes sont dénombrer :
*soi eu milieu solide par la technique en boites sur gélose ai déso-
xycholate à 1 / ou sur gélose VRBL (gélose lactosée biliée au vert brillant
et au rouge de phenol)
*soit eu milieu liquide par la technique de NPP (nombre le plus probable
à l’aide du bouillon VBL (Bouillon lactosé bilié au vert brillant ) réparti à
raison de 10 ml par tubes munis au préalable d’une cloche de Durham .
En milieu solide :
A partir des dilutions décimales 10-4 à10-1 , porter aséptiquement 1 ml de
chaque dilution dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et
numérotée .cette opération doit être effectuée en double pour chaque
dilution car :
- La première série de boites sera incubée à37°C et sera reservée à la
recherche des coliformes totaux
- La deuxième série de boites sera incubée à44°C et sera réservée à la
recherche des coliformes fécaux
Compléter ensuite avec environ 15 ml de gélose au désoxycholate
1/fondue puis refroidie à 45 +- 1°C
Faire ensuite des mouvements circulaires et de va –et vient en forme de «
8 » pour bien mélanger la gélose à l’inoculum
Laisser solidifie les boites sur paillasse puis couler à nouveau environ 5ml
de la même gélose , cette double couche a un rôle protecteur contre les
diverses contaminations
Incubation :
Les boites seront donc incubées couvercle en bas pendant 24 à 48 heures à
:
-37°Cpour la première série (recherche des coliformes totaux)
-44°C pour la deuxième série ( recherche des coliformes fécaux )
Lecture :
Les coliformes (totaux et fécaux ) apparaissent en masse sous forme de
petite colonies de couleur rouge foncé et de 0.5mm de diamètre
,fluorescentes .la fluorescence de ces colonies est mise en évidence
lors de leur observation sous une petite lampe à UV dans une chambre
noire
En milieu liquide :
La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :
-le test de présomption : réservé à la recherche des coliformes totaux
-le test de confirmation : appelé encore test de Mac Kenzie et réserve à la
recherche des coliformes fécaux à partir des réactions positives du test de
présomption
*Test de présomption :
Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif
(VBL) à raison de trois tubes par dilution
A partir des dilutions décimales 10-4à10-1, porter aseptiquement 1 ml
dans chacun des trois tubes correspondant à une dilution .chassez le gaz
présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le
milieu et l’inoculum.
Incubation :
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures .
Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :
-un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche )
- un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui
constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu )
Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les
conditions opératoires décrites .
La lecteur finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady
*Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :
Les tubes de VBL trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes
totaux feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une ose bouclée dans à la
fois :
- Un autre tube de VBL muni d’une cloche de Durham
- Un tube d’eau peptonée exempte d’Indole.
Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches et bien mélanger
le milieu et l’inoculum.
Incubation :
L’incubation se fait cette fois –ci au bain marie à 44 °C pendant 24heures
Lecture :
Sont considérés comme positifs ,les tubes présentant à la fois :
-un dégagement gazeux dans les tubes de VBL
- un anneau rouge en surface ,témoin de la production d’indole par E.Coli
après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de kovacs dans le tube d’eau
peptonée exemple d’indole
 La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table de
Mac Grady en levant compte du fait que E. coli est à la fois producteur de
gaz et d’indole à 44 °C .
 Recherche et dénombrement des levures et des
moisissures :
Milieu : gélose glucosée a la pomme de terre
Mode opératoire :
-préparer et inoculer autant de boites de pétri qu’il Ya de dilutions à
étudier
- faire fondre au préalable le milieu de culture et le refroidir en le
maintenant dans un bain d’eau à 45-50°C , puis l’acidifier stérilement
pour l’obtenir à ph 3.5 , ou 4.5 , on ajouter la quantité requise de terra
lycine
-couler le milieu dans les boites de pétri dans les délais les plus rapide
-incuber les boites de pétri à 20-25°C pd 5 jours
*résultats et interprétation :
Levures : identiques aux colonies bactériennes
Moisissures : colonies toujours pigmentés ;à l’aspect velonté plus ou
moins proéminent .
 Recherche et dénombrement de Salmonelles
La recherche des selles modèle nécessite une prise d’essai à part.

1. Le 1er jour « Pré-enrichissement » :

Prélevé 25 g de produit à analyser dans un sachet stérile de type stomacher

contient de 225 ml d'eau peptonée tamponnée. Broyer cette suspension dans un
broyeur de type stomacher, la transposer dans un flacon stérile puis l’incuber à
372°c pendant 18h.

2. Le 2éme jour « enrichissement » :

L’enrichissement doit s’effectuer sur deux milieu sélectifs à savoir

⮚ Le milieu de rapport Vassiliadis réparti à raison de 10 ml par tube.

⮚ Le milieu de Sélinite-cysteine reparti a raison de 100ml par flacon.

L’enrichissement proprement dit ce fait donc à partir du milieu de pré-

enrichissement de la façon suivant :
- 0,1ml en double pour les tubes de rapport Vassiliadis.

- 10ml en double pour les flacons de Sélinite-cysteine.

Incubation :

- Le premier tube de rapport sera incubé à 37°c pendant 24h.

- Le deuxième tube de rapport sera incubé à 42°c pendant 24h.

- Le premier flacon de sélénite sera incubé à 37°c pendant 24h.

- Le deuxième flacon de sélénite seras incubé à 42°c pendant 24h.

3. Le 3éme jour « Isolement » :

Chaque tube et chaque flacon fera l'objet d'un d'isolement sur deux milieux
gélose différents à savoir : - le milieu gélose Hektoen.

- Le milieu gélosé bilié lactosé au vert brillant et au rouge de phénol.

Touts les boites ainsi ensemencées seront incubées à 37°c pendant 24h

4. Le 4éme jour « lecture des boites et identification » :

Les Salmonella se présentent de la façon suivant :

- Colonies roses entourées d’une zone rouge sur gélose BLVBRP.

- Colonies le plus souvent gris a centre noir sur gélose Hektoen.

● Identification morphologique et biochimique :

Toutes les colonies caractéristiques feront l’objet d’une identification

morphologique et biochimique qui se déroulent comme suit :

- Etat frais (bacilles, mobilité)

- Coloration de Gram (bacilles Gram négatifs).

- Ensemencement d’un tube de TSI qui sera incubé à 37°c pendant 24h
(lactose, saccharose, glucose, gaz et H2S).

- Ensemencement d’un gélose nutritive inclinée qui sera incubé à 37°c

pendant 24h.

- Ensemencement :
✔ Soit d’une galerie biochimique classique (ONPG, oxydase, LDC, ODC,
ADH, témoin, Urée, Indole, TDA, VP, RM…).

✔ D’une galerie biochimique API 20E.

● Identification antigénique :

Cette dernier repose sur l’agglutination sur lame de verre, à partir des mêmes
colonies isolées la veille sur gélose nutritive inclinée au tubes, à l’aide des
sérums de groupes d’abord OMA, OMB puis les autres après.

Résultats et interprétation :

-notre viande hachée contient des bactérie mésophiles sur PCA le nombre n’est
pas assez grand risque

-il est conseillé de bien cuire la viande pour éliminer toute source de microbe et
empêche tous les types de microorganismes de poursuivre leur multiplication

-les résultats montre la présence des bactéries pathogènes plus précisément sont
de genre salmonella on doit prendre attention ne pas consommer cette viande
qu’après une suffisante durée de cuisant .

 Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux :

La recherche des streptocoques fécaux ou streptocoques « D » se fait en milieu
liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP)

Cette technique fait appel à deux testes consécutivement à savoir :

- Le test de présomption : se fait sur milieu Roth S/C

- Le test de confirmation : se fait sur milieu EVA Lytski.

⮚ Test de présomption :

-Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif Roth
S/C à raison de trois tubes par dilution. À partir des dilutions décimales 10-³ à
10-² porter aseptiquement 1ml dans chacun des 3 tubes correspondant à une
dilution donnée.

-bien mélanger l’inoculum dans le milieu.

Incubation :
Se fait à 37°c pendant 24 à 48h.

Lecture :

Sont considérés comme positifs, les tubes présentant un trouble microbien.

Remarque :aucun dénombrement ne se fait à ce stade, les tubes positifs feront

l’objet d’un repiquage.

⮚ Test de confirmation :

Chaque tube de Roth positif fera donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’une anse
bouclée sur tube contenant le milieu EVA Lytski. Bien mélanger l’inoculum
dans le ½ .

Incubation :

Se fera à 37°c pendant 24h.

Lecture :

Sont considérés comme positifs, les tubes d’EVA présentant à la fois :

- Un trouble microbien.

- Une pastille blanchâtre ou violette au fond du tube.

-Le nombre de Streptocoques fécaux est exprimé par le NPP selon la table de
MAC Grady.

Résultats et interprétation :

Il ya présence de streptocoques fécaux lorsque le milieu de Litsky est trouble

avec ou sans dépôt blanchâtre ou mauve .

 :
La viande doit être bien conservé à froid mais pendant une durée qui ne dépasse
pas au plus un mois non seulement pour minimiser le risque de contamination
lais aussi pour garder ces différents critères et structure physique (gout, fraicheur
; richesse en eau…..) ;et avant la consommation ;elle doit être cuite à une
chaleur douce et de préférence bouillée dans l’eau quelque minutes et colle ca
on affirme qu’on a détruits toute la flore pathogène ,indésirable et même la flore
pathogène , indésirable et même la flore problématique .
 TP n=°03: Analyse microbiologique des

conserves :

Une conserve ne doit pas subir d’altérations d’origine microbienne et si une telle
altération intervient il faudra en déterminer l’agent causal et son origine .une
boite anormale indique généralement un produit anormal.

Au cours des phénomène d’altérations ,la boite peut présenter des anomalies
s’aspect facilement appréciables : « à demi bombée ; bombée déformable
,bombée indéformable .le bombage est soit d’origine microbienne (fermentation
des glucides avec production de gaz surtout du co2ou fermentation des protéines
avec production d’azote ou de NO2soit d’origine chimique avec production
d’hydrogéne par attaque du métal par des acides soit lié à une surchauffe de
stérilisation .le contenu de la boite peut aussi , par suite de la présence de
bactéries ;subir des modifications d’aspect ; texture ou PH

La nature du gaz d’une conserve bombée peut être évalué après récupération du
gaz dans un tubes préalablement rempli d’eau barytée.

Les conserves doivent satisfaire à des épreuves permettant de vérifier leur

stabilité /stérilité. ces épreuves consistent en deux étuvage de 5 échantillons
à37°C pendant 7 jours (ou à30°C pendant 10 jours )et à 55°Cpendant 7 jours .a
l’issu de ces épreuves on observe l’éventuel bombage ou fuitage (il faut aussi
que le ∆pH entre les unités étuvées et les unités témoins ne dépasse pas 0.5)

Dénombrement et identification des microorganismes recherchés pour le

contrôle microbiologique du tomate de conserve .

Le principe consiste en premier lieu à faire isoler la population bactérienne qui

se trouve dans notre échantillon (tomate de conserve ) , puis faire étaler les
différentes dilutions préparées à partir de la suspension ; sur différents milieux
de cultures ; pour favoriser la croissance de telle ou telle population qui se
trouve dans notre échantillon ; et par la suite ça va nous donner une idée sur
l’état microbiologique de notre produit alimentaire .


 Recherche et dénombrement des germes aérobies mésophiles
totaux (FTAM) :
A partir ses dilution décimale allant de 10-1 a 10-4 , porter aséptiquement 1 ml
dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et numérotée . compléter en
suite avec environ 20ml de gélose PCA fondue puis refroidie à 45 +-1°C.faire
ensuite des mouvements circulaire et de va et vient en forme de « 8 »pour
permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose .Laisser solidifier sur
paillasse ; puis ajoutes une deuxième couche d’environ 5ml de la même gélose
ou de gélose blanche .cette double couche a un rôle protecteur contre les
contaminations diverses

Incubation :

Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 72heurs avec :
_première lecture à24 heures

_deuxième lecture à 48 heures

_troisième lecture à 72 heures

Lecture :

Les colonies des GAMT se présentent sous forme lenticulaire en masse

Dénombrement :

Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant
compte des facteurs suivants :

-ne dénombrer que les boites contenant entre 15et 300 colonies

- multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution

- faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différents dilutions

 Recherche et dénombrement des coliformes :

Les coliformes sont dénombrer :

*soi eu milieu solide par la technique en boites sur gélose ai déso-xycholate à 1

/ ou sur gélose VRBL (gélose lactosée biliée au vert brillant et au rouge de
phenol)

*soit eu milieu liquide par la technique de NPP (nombre le plus probable à l’aide
du bouillon VBL (Bouillon lactosé bilié au vert brillant ) réparti à raison de 10
ml par tubes munis au préalable d’une cloche de Durham .

En milieu solide :

A partir des dilutions décimales 10-4 à10-1 , porter aséptiquement 1 ml de

chaque dilution dans une boite de pétri vide préparée à cet usage et numérotée
.cette opération doit être effectuée en double pour chaque dilution car :

- La première série de boites sera incubée à37°C et sera réservée à la

recherche des coliformes totaux

- La deuxième série de boites sera incubée à44°C et sera réservée à la

recherche des coliformes fécaux

Compléter ensuite avec environ 15 ml de gélose au désoxycholate 1/fondue puis

refroidie à 45 +- 1°C

Faire ensuite des mouvements circulaires et de va –et vient en forme de « 8 »

pour bien mélanger la gélose à l’inoculum

Laisser solidifie les boites sur paillasse puis couler à nouveau environ 5ml de la
même gélose , cette double couche a un rôle protecteur contre les diverses
contaminations

Incubation :

Les boites seront donc incubées couvercle en bas pendant 24 à 48 heures à :

-37°Cpour la première série (recherche des coliformes totaux)

-44°C pour la deuxième série ( recherche des coliformes fécaux )

Lecture :

Les coliformes (totaux et fécaux ) apparaissent en masse sous forme de petite

colonies de couleur rouge foncé et de 0.5mm de diamètre ,fluorescentes .la
fluorescence de ces colonies est mise en évidence lors de leur observation sous
une petite lampe à UV dans une chambre noire

En milieu liquide :

La technique en milieu liquide fait appel à deux tests consécutifs à savoir :

-le test de présomption : réservé à la recherche des coliformes totaux

-le test de confirmation : appelé encore test de Mac Kenzie et réserve à la

recherche des coliformes fécaux à partir des réactions positives du test de
présomption

*Test de présomption :

Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif (VBL) à
raison de trois tubes par dilution

A partir des dilutions décimales 10-4à10-1, porter aseptiquement 1 ml dans

chacun des trois tubes correspondant à une dilution .chassez le gaz présent
éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le milieu et
l’inoculum.

Incubation :

L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures .

Lecture :

Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :

-un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche )

- un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui

constitue le témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu )

Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les

conditions opératoires décrites .

La lecteur finale se fait selon les prescriptions de la table de Mac Grady

*Test de confirmation ou test de Mac Kenzie :

Les tubes de VBL trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes totaux
feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une ose bouclée dans à la fois :
- Un autre tube de VBL muni d’une cloche de Durham

- Un tube d’eau peptonée exempte d’Indole .

Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches et bien mélanger le

milieu et l’inoculum .

Incubation :

L’incubation se fait cette fois –ci au bain marie à 44 °C pendant 24heures

Lecture :

Sont considérés comme positifs ,les tubes présentant à la fois :

-un dégagement gazeux dans les tubes de VBL

- un anneau rouge en surface ,témoin de la production d’indole par E.Coli après

adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de kovacs dans le tube d’eau peptonée
exemple d’indole

La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table de Mac

Grady en levant compte du fait que E. coli est à la fois producteur de gaz et
d’indole à 44 °C .

 Recherche de spores de Clostridium sulfito-reducteurs et

particulièrement clostridum perfringens :
Selon la disponibilité des milieux des cultures , deux techniques sont
recommandés pour la recherche de clostridium à savoir :

- méthode générale sur gélose viande-foie à 37C°

- méthode sélective sur gélose TSN ou TSC à 46C° .

A- méthode générale :

- préparation du milieu :

Au moment de l'emploi faire un flacon de gélose viande-foie , le refroidir dans

un bain d'eau à 45C° puis ajouter une ampoule d'alun de fer Et une ampoule de
sulfite de sodium , mélanger soigneusement et aséptiquement . Le milieu est
ainsi prêt à l'emploi, mais il faut le maintenir dans une étuve à 45c° . Jusqu'au
moment de l'utilisation .
Ensemencement :

Les tubes contenant les dilutions 10-² et 10-¹ seront soumis.

- d'abord à un chauffage à 80C° pendant 8 à 10 minutes

- puis à un refroidissement immédiat sous l'eau de robinet , dans le but

d'éliminer les formes végétatives et de garder uniquement les formes sporulées .

- à partir de ces dilutions , porter aséptiquement 1ml de chaque dilution en

double dans deux boîtes avis stériles , de 16 mm de diamètre , puis ajouter
environ 15 ml gélose viande-foie prête à l'emploi , dans chaque tube laisser
solidifier sur paillasse pendant 30 minutes

Incubation :

- ces tubes seront ainsi incubés à 37c° pendant 16.24 ou plus tard 48heures .

lecture :

- la première lecture doit se faire impérativement à 16 hrs , car, d'une part les
colonies de clostridiums sulfito-reducteurs sont envahissante auquel cas sont on
se trouverait en face d'un tube complètement noir rendant alors l'interprétation
difficile voire impossible et l'analyse est à refaire .

- d'autre part , il faut absolument repérer toute colonie noir ayant poussé en
masse et un diamètre supérieur à 0.5 mm

Dans le cas où il n'y a pas de colonie caractéristique reincuber les tubes et

effectuer une deuxième lecture au bout de 24 heures voir 48 heures .

Interprétation des résultats :

- il est donc impératif de repérer toute colonie noir , puis procéder à son
identification biochimique , certains auteurs préconisent de casser le tube à l'aide
d'une lime métallique à 1 cm au-dessus de la colonie suspect et de prendre le
centre de la dite colonie , car très souvent il y'a développement de colonies de
staphylocoques et de bacillus de côté qu'on prendrait à Tard pour des colonies de
clostridiums sulfito-reducteurs .

identification biochimique :

- le centre de colonie noir suspecte (qui est en réalité. Blanche mais entourée
d'un auréole noire ) sera alors déposé soigneusement dans un tube contenant
d'un bouillon TGY ou TY préalablement régénéré à 80C° pendant 15 minutes ,
placer en suite ce tube dans un agitateur (vortex) pour bien mélanger la colonie
dans le milieu puis l'incuber dans anaérobiose pendant 24 à 48 hrs . Après la
période d'incubation constater le trouble du milieu puis réaliser les étapes
suivantes :

- état frais pour constater s'il y'a mobilier ou non

- coloration de gramme pour consulter les types de colonies et leur coloration .

- s'il s'agit de bacilles gram positifs , faire un isolement sur deux boites de
gélose au sang de mouton frais :

- l'une sera incubée dans 37C° en aérobiose

- l'autre sera incubée dans 37C° en anaérobiose

Après 24 à 48 heures d'incubation :

- sélectionné les boites ayant poussé strictement en anaérobiose.

- remarquer le type d’hémolyse.

- faire une coloration de gram, puis une réaction catalase.

- s'assurer qu'il s'agit bien d'une souche pur, sinon purifier.

- puis ensemencer une galerie biochimique API 20 A à incuber toujours en

37C° et toujours en anaérobiose.

B- la méthode sélective :

la méthode sélective de recherche de clostridium est identique à la méthode

générale , mise à part :

- le milieu de culture : il s'agit cette fois ci d'un milieu sélectif TSN ou TSC ces
deux antibiotiques inhiberont toute la flore éventuellement présente hors mis les
spores des clostridium rendant ainsi le milieu sélectif .

- la température d'incubation : à 46C° , la sélection est encore plus stricte ,la

suite des opérations reste sans changement .

Résultats et Interpretaion :
Les clostridiums sulfito-réducteurs apparaissent sous forme de colonies
entourées d’un halo noire .

 Recherche de staphylococcus Aureus :

Selon la disponibilité des milieux des cultures, trois techniques différentes sont
recommandés de recherche de staphylococcus aureus à savoir :

- méthode de Baird Parker

-méthode d’enrichissement sur milieu de Giolitti Cantoni

- méthode d'enrichissement sur milieu de Chapman.

A- Méthode de Baird Parker :

Préparation du milieu :

Au moment de l'emploi faire fendre un flacon contenant 225 ml de gélose Baird

Parker, le refroidir , ensuite dans un bain d'eau à 45C° , puis ajouter 15ml d'une
solution de j'aune d'œuf au Tellurite de potassium

mélanger soigneusement et aséptiquement , puis repartir le milieu en boite de

pétri à raison de 15 à 18 ml par boîte .

Laisser solidifier les boites sur paillasse , puis les sécher en les plaçant
retournées couvercle en bas dans une étuve de séchage réglée entre 45 à 55C° .

Ensemencement :

À partir des dilutions décimales dans le cas des toxi-infections

alimentaires et à partir de 10-³ des contrôles de routine porter aséptiquement 1
ml de chaque dilution reparti en surface à raison de trois fraction sensiblement
égale dans trois boites contenant le milieu de Baird Parker puis étaler à l'aide
d'un même étaleur , en commençant par les boites de plus haute dilution .

Incubation : l'incubation se fait à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Lecture :

Seront considérées comme positives , les boites contenant des colonies

caractéristiques à savoir des colonies noires brillantes convexes entourés d'une
zone de transparence qui peut être translucide .
Après 24 heures , peut apparaître dans cette zone transparente , un anneau
opalescent immédiatement au constat des colonies.

Pour s'assurer qu'il s'agit bien de colonies staphylococcus aureus effectuer sur 2
à 3 colonies de chaque boite des tests biochimiques rapides à savoir :

- une épreuve a la catalase ( à l'aide de l'eau oxygénée )

- une épreuve à la coagulase ( à l'aide de plasma de lapin) .

B- méthode d'enrichissement au milieu de Giolitti Cantoni :

préparation du milieu :

Au moment de l'emploi ouvrir aséptiquement le flacon contenant milieu de

Giolitti Cantoni pour y ajouter 15 ml d'une solution de Telurite de Potassium,
mélanger soigneusement le milieu et alors prêt à l'emploi.

Ensemencement :

À partir des dilutions décimales retenues porter aséptiquement 1 ml par dilution

dans un tube avis stérile , ajouter par la suite environ de 15 ml du milieu
d'enrichissement , bien mélanger le milieu et l'inoculum.

Incubation :

L'incubation se fait à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Lecture : Seront considérés comme positifs , les tubes ayant vires au noir pour
s'assurer qu'il s'agit bien d'un développement de staphylococcus aureus ces tubes
feront l'objet d'un isolement sur gélose Chapman préalablement fondue coulée
en boites de pétri et bien séchées .

Les boites de Chapman ainsi ensemencées seront incubées à leur tour à 37C°
pendant 24 à 48 heures .

Après ce délai repérer les colonies suspectes à savoir les colonies de taille
moyenne lisse brillante pigmentées en jaune et pourvus d'une catalase et d'une
coagulase .

Expression des Résultats :

-Si la dilution 10-³ le tube a noirci au bout de 24 heures d'incubation mais à
l'isolement sur Chapman il n'y a pas de colonies caractéristiques ce tube est
considéré comme négatif .

-Si par contre à la dilution 10-¹ le tube a noirci au bout de 24 hrs et a l'isolement
il y'a des colonies caractéristiques , il faut tenir compte de la dilution en question
car le norme réel de staphylococcus aureus correspond à l'inverse de la dilution

Dans ce cas il y a donc 10 staphylococcus aureus par gramme ou millilitre de

produit à analyser

C-Méthode d'enrichissement sur milieu de Chapman liquide :

Ensemencement :

A partir des dilutions décimales retenues porter aséptiquement 1 par dilution

dans un tube contenant 10 ml de solution du Chapman liquide bien mélanger le
milieu et l'inoculum .

Incubation : l'incubation se fait à 37 C° pendant 24 à 48 heures

Lecture : seront considérés comme positifs, les tubes présentant un trouble

microbien mais pour s'assurer qu'il s'agit bien D'un développement de
staphylococcus aureus ces tubes feront l'objet d'un isolement sur gélose
Chapman préalablement fondue puis refroidie et coulé en boîtes et séchés

Ces boites seront a leur tour incubées à 37C° pendant 24 à 48 heures .

Staphylococcus aureus se présente alors sous forme de colonies de taille
moyenne lisse brillante pigmentées en jaune et pourvus une catalase et d'une
coagulase.

L’appréciation de la qualité bactériologique de la conserve (tomate) consiste en

la recherche des germes pathogènes, des germes utiles et des germes nuisible à
la conservation. Ces micro-organismes peuvent proliférer dans la conserve qui
constitue un excellent milieu de culture. Selon l’intérêt de l’étude, on oriente
donc notre recherche. Dans ce cas précis, on s’intéresse aux staphylococcus
aureus et es clostridiumsulfito-reducteurs qui peuvent être gênants pour le
consommateur.