Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
SCIENTIFIQUE
ECOLE NATIONALE SUPERIEURE DES SCIENCES DE LA MER
ET L’AMENAGEMENT DE LITTORAL
ENSSMAL
2
* un certain nombre de difficultés rendent l’analyse microbiologique délicate :
- la recherche d’un groupe particulier de bactéries parmi d’autres peut être très
difficile ;
- le coût des analyses microbiologiques est fort élevé pour une rentabilité
faible.
La culture des micro-organismes se fait soit sur milieu solide (gélose) ou sur
milieu liquide (bouillon). Les milieux sont à l’origine sous forme de poudre, qu’il
faut ensuite préparer.
Les milieux de culture sont pour la plupart sélectifs, c'est-à-dire qu’ils apportent
les nutriments essentiels au développement de certains germes, mais
contiennent des composés qui inhibent la croissance des autres micro-
organismes (voir annexe).
3
Matériel utilisé :
Les milieux de culture que nous avons préparé en TP sont (certains sont à titre
indicatif seulement):
1.1.2- Vibrions :
4
Milieu gélosé viande-foie
Milieu Chapman
1.2- Milieux pour la recherche des germes indicateurs (de pollution
fécale) :
Milieu Sabouraud
Matériel utilisé :
5
Mode opératoire :
3- Mettre 225ml d’eau physiologique dans le mixeur avec les 25g de chair
puis mixer jusqu’à l’obtention d’une solution homogène (bouillon).
a- dilution 10-2 :
Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de lasolution mère puis on complète
à 10 ml avec de l’eau physiologique.
b- Dilution 10-3 :
Mettre dans une éprouvette de 25ml, 1ml de dilution 10-2 puis on complète à
10 ml avec de l’eau physiologique.
Leur culture se fait en profondeur : A l’aide d’une pipette pasteur, on met dans
une boite de pétri, 20 gouttes (correspond à ~ 1ml) d’une dilution, on coule la
gélose désoxycholate à 0.1%, puis on procède à un étalement en faisant des
mouvements de huit.
Incubation :
6
Que se soit à 37 ou à 44°C, les premières lectures se feront au bout de 24 h et
consistent à repérer les petites colonies rouges ayant poussé.
Il se fait en surface sur une boite de pétri contenant le milieu Slanetz. On verse
à l’aide d’une pipette pasteur, 100µl de dilution. L’incubation de fait à 37°c.
2-7- Dénombrement :
Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussé sur les boites en tenant
compte des facteurs de dilutions, de plus :
7
III. ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES BACTERIES PATHOGENES
(COLORATION DE GRAM, TESTS D’OXYDASE ET DE CATALASE, TEST SUR
GALERIE API) :
Mode opératoire :
On ensemence une boite de pétri en faisant des stries ce qui permet d'obtenir
des colonies pures et isolées les unes des autres. A l’aide d’une pipette pasteur
stérile on prend une seule colonie après avoir flambé la pipette et on fait des
stries dans la boite (moitié) puis flamber la pipette et la refroidir, puis tourner
la boite 90° puis faire d’autres stries, arrivé au dernier carré, on fait une sorte
de S, comme indiqué sur la figure ci-dessus.
8
3-2- Coloration de gram :
Mode opératoire :
9
3.3- Test d’oxydase :
Principe :
- avec une pipette pasteur, on prend une colonie bactérienne et on la met sur
le disque -> le test est positif si la colonie devient violette et est négatif si rien
ne se passe.
Résultat :
Vibrio oxydase - (en TP les disques oxydase étaient périmés. Le résultat aurait
dû être positif pour les vibrio)
Bactérie
isolée
sur
lame +
gouttes
de H2O2
(eau
oxygénée)
10
Absence de bulles d’air (réaction) catalase – (pas de réaction)
H2O2 H2O + ½ O2
Résultat :
3-5-2- Manipulation :
- On choisit 1 colonie de la
souche bactérienne à identifier ;
11
- On la met dans ~5 ml d’eau distillée (stérilisée) ;
- Remplir d’eau, les puis du couvercle qui accompagne la galerie, pour éviter
l’assèchement de l’eau des galeries, une fois mise en incubation ;
12
- quantifier spécifiquement la toxicité d’un produit chimique pour un
organisme ;
- Ces tests sont hautement spécifiques et les résultats ne sont pas forcément
extrapolables à d’autres espèces.
- Soulever la souris par la queue et la poser sur le toit de la cage, sans lâcher la
queue ;
13
- coincer la queue entre les 2 derniers doigts de la main, tout en maintenant la
souris par les oreilles et retournée ;
4-3- Résultats :
*Une seule souris a reçu une dose de toxine botulique très diluée. Elle a
manifesté quelques signes de « début » de paralysie, mais sont état de santé
ne semblait pas s’aggraver dans le temps, même après l’ajout d’autres
injections (surement à cause de la forte dilution de la toxine).
*Les autres souris ont été injectées avec de l’eau distillée, seulement pour un
but pédagogique ; elles n’ont donc manifesté aucun signe d’aggravation de leur
état de santé.
5-1- Principe :
14
changement d'absorbance est proportionnel à la quantité de colorant lié,
indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.
- Orthophosphate 80% : 50 ml
* Le produit final aura une couleur ~ gris-brun, ensuite c’est le virage vers le
bleu qui indique la présence de protéines
Le réactif utilisé pour la préparation de la gamme étalon est les BSA (Serum
Albumine Bovine)
- On pèse 20mg de BSA (poudre) et on le dilue dans 1ml, puis il est mit dans un
microtubule.
- nous avons besoin de seulement 1mg/ml de BSA => on prélève 50µl de la
première solution et on ajoute 950µl d’eau distillé pour atteindre les 1000µl
(1ml)
* La gamme étalon choisie, ainsi que les absorbances sont reportées dans le
tableau suivant :
N° tube 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ech
15
H2O (µl) 100 95 90 80 70 60 50 40 30 20 0 50
Réactif Bradford
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
(ml)
Absorbances 0 0.052 0.127 0.137 0.138 0.162 0.231 0.307 0.312 0.34 0.427 0.38
*Nous obtenons un très bon coefficient de corrélation (0.927 très proche de 1),
ce qui démontre que la gamme étalon a été faite correctement, et cela va
nous permettre de calculer la concentration de l’échantillon avec une bonne
précision.
16
*Grâce à la droite de régression nous pouvons calculer la concentration de
l’échantillon en connaissant son absorbance, ainsi :
ANNEXE :
1/ milieu SS :
Gélose Salmonella-Shigella.
Il est très utilisé pour la recherche de Salmonella dans les selles et les denrées alimentaires peu pour
les Shigella car trop sélectif.
Composition :
Lecture :
17
Colonies rouges : lactose +
2/ milieu TCBS :
Composition :
Composition :
18
Bio-Trypcase 10
Extrait de viande de bœuf 5
Extrait de levure 2
Chlorure de lithium 5
Pyruvate de sodium 10
Glycocolle 12
Tellurite de potassium 1 mL
Emulsion de jaune d'œuf à 10 % 1 mL
Agar 15
pH = 7,2
Lecture :
- noires
- brillantes, convexes
- de 1 à 2 mm de diamètre
- entourées d'un halo clair.
La plupart des autres espèces de staphylocoques sont inhibées ou ne produisent pas de colonies
caractéristiques en 24 heures.
4/ milieu SABOURAUD :
Composition :
19
Milieu de dénombrement des coliformes en microbiologie alimentaire
(analyse des eaux et des aliments).
Il sera incubé à 37°C pour la recherche des coliformes totaux et à 44°C pour
la recherche des coliformes thermotolérants.
Composition :
20