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1.

Introduction :

L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie. On l’utilise quotidiennement pour
différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels… Et pour
ces buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques
satisfaisantes.

Dans cette TP nous sommes plus intéressants par le recherche dans l’échelle microbiologique,
l’orientation de TP été vers : la réalisation des analyses sur l’eau, le rechercher des différents types des
germes, la comparaison entre les germes présent dans deux types d’eau (eau potable (de robinet) et
l’eau pollué) en plus l’identification des germes.

Notre groupe a été choisi pour les recherches dans l’eau pollué.

Les germes visés pour la recherche sont :

-les germes aérobies mésophiles et psychrophiles dans le milieu PCA gélosé : cette recherche
indique plusieurs critères ; l’origine de cette eau, les traitements qu’il a subi. C’est à dire une
évaluation de cette eau, un indicateur de la qualité générale et de la stabilité. La recherche des germes à
20°C indique la recherche des germes pathogènes ou résistants.

-les coliformes totaux à 30°c dans le milieu BCPL : permet de signalé une contamination fécale
d’origine animale, c'est-à-dire une évaluation de risque de présence des germes pathogènes.

-les streptococcus type D dans le milieu Rothe : c’est une recherche d’un germe pathogène. Pour
l’évaluation des risques sanitaires de cette eau.

2. Matériel et méthodes :

a.matériel :

Les verreries :

Tube à essais, boite de pétri, des portoirs à tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des
lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matériel doit être stérile).

Les appareils :

Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen.

Les milieux de cultures utilisés :

 Représenté dans l’annexe I

Les indicateurs chimiques :

Rouge de méthyle, réactif de Vogs-Proskauer, le réactif de Kovacs.

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d. méthodes d’analyse :

1. le premier jour :

Pour la recherche des FAMT/FAPT :

On a réalisé des dilutions à partir de la solution mère. Trois tubes contiennent 9 ml d’eau
physiologique stérile préparées par l’enseignant, avec une pipette stérile de 1 ml on ajout 1 ml à partir
de flacon qui contient la solution mère et met dans le premier tube «c’est le tube de dilution (10-1) »,
après une homogénéisation été réalisée. Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de
dilution (10-1) et met dans le deuxième tube « c’est le tube de dilution (10-2) ». Avec la mémé pipette
on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-2) et met dans le troisième tube « c’est le tube de
dilution (10-3) ». Après On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3) dans chaque boites
pétri. Après on a collé les boites par 10 à 15 ml de milieu PCA préparé et liquidifié par l’enseignant
et on a effectué des mouvements en forme de ∞ pour bien mélanger l’inoculum, après la solidification
de milieu on a incubé les boites à 30°C et 20°C pendant 72 heures. (Selon le schéma 1).

Eau à
analysé
10-1 10-2 10-3

1 ml
1 ml

PCA

PCA

Incubation à 37°C et à 20°C. 20°C 10-3


37°C 10-2

EP2
EP2

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Pour la recherche des coliformes totaux :

La méthode utilisée c’est « 333 », dans la quelle, on a utilisé neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu
BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham préparé par l’enseignant, par différents
concentrations, trois tubes doubles concentrés (D/C) et six simple concentrés (S/C).

Pour les trois tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a
ajouté 1 ml de la même solution dans trois tubes simples concentrés et 0.1 ml (=trois gouttes par
pipettes pasteur) de la solution mère dans les trois tubes simples concentrés qui restes. Il faut bien
mélanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. Après on a l’incubation à 37°C pendant 24 à 48
h. (Selon le schéma 2).

Eau à
analysé

10 ml 1 ml 0.1 ml

Double concentré simple concentré simple concentré

L’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h.

Pour la recherche des streptococcus type D :

La méthode utilisée c’est « 511 », dans la quelle, on a utilisé septe tubes remplies (9 ml) par le milieu
Rothe préparé par l’enseignant, par différents concentrations, cinq tubes doubles concentrés (D/C) et
deux tubes sont simple concentrés (S/C).

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Pour cinq tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a
ajouté 1 ml de la même solution dans un tube simple concentré et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes
pasteur) de la solution mère dans un tube simple concentré qui reste. Après on a l’incubation à 30°C
pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 3).

Eau à
analysé

10 ml 1 ml 0.1 ml

Double concentré simple concentré

Incubation à 30°C pendant 24 à 48 h

2. le deuxième jour :

 On a fait la lecture des résultats et le dénombrement sur touts les milieux à l’aide des tableaux de
l’indice NPP.
 On a essai d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.
 A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de préférence les tubes doubles concentrés
positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL gélosé pour but de séparer les colonies
produites pour être facile à identifie, ce repiquage faite par culture en surface, on a met la pipette
pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la gélose collé déjà sur les boites et refroidie,
l’inoculum été ensemencé à 30°C pendant 24. (Selon le schéma 4).

4
Tube
+

BCPL

37°C

EP2

Incubation à 37°C pendant 24h.

3. le troisième jour :

 On a essai une autre fois d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope
photonique.
 A partir de milieu BCPL gélosé on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois
différents tubes par différent mode d’ensemencement, le premier tube est collé par le milieu citrate
de Simmons (solidifié en position inclinée) l’ ensemencement fait par des stries sur la surface de la
pente par pipettes pasteur, le deuxième est collé par le milieu Kigler-Hajana (solidifié en position
semi-inclinée) l’ ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) après des stries sur la surface
de la pente par pipettes pasteur, le troisième tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu
liquide) l’ ensemencement fait par l’entrée de la pipettes pasteur dans le milieu, les trois tubes sont
pour but d’identification biochimique de la colonie sélectionnée, les trois tubes sont ensuite
incubées à 30°C pendant 24h. (Selon le schéma 5).

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Milieu Citrate Milieu Kigler- Milieu Clark L’eau
de Simmons Hajana et Lubs peptonée

Incubation à 37°C pendant 24h.


4. le quatrième jour :

 On fait la lecture des résultats sur le milieu PCA (lecture après 72h).
 La lecture directe de résultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana.
 On a divisé la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes, dans le premier tube on a ajouté
des gouttes de solution rouge de méthyle, dans le deuxième tube on a ajouté des goutte de α-
naphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude à 16% (VP2). le principe de ces réactifs dans
l’annexe II.

4. Résultat et discutions :

Pour la recherche des FAMT/FAPT :

On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA après 72h seulement la boite incubée
à 30°C contient des colonies, trop chargé, pour facilite la lecture on a divisé la boite en quatre, on a
estimée le nombre des colonies présentent d’un quart, il est de 145 colonies à peut prés.

Alors le nombre des bactéries dans 1ml de solution égale :

6
N = (150 ×4) ×102 = 60000 UFC/ml.

Donc le nombre des bactéries aérobies mésophiles totale présentent dans cette eau égale 60000
bactéries par un millilitre. (Schéma 6).

150
colonies PCA

37°C 10-2

EP2

Pour le dénombrement des coliformes totaux :

Le dénombrement se fait à partir des tubes s tubes dits positives sont :

 Les tubes à virage de couleur (couleur jaune).


 présentent un dégagement de gaz (les cloches rempliées par le gaz).

Par la méthode NPP on a estimée le nombre des coliformes totaux présentent dans l’eau, la méthode
de calcule est la suivante :

3×10 3×1 3×0.1


D/C S/C S/C

+ + + + + + + + +

3 3 3

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Le nombre 333 correspond à > 1100 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries calculés
égale :

(1100 × 10) = >11000 bactéries dans 100ml.

L’identification biochimique des coliformes:

Les souches pressentant dans le La boite appartient à la famille d’entérobactérie les tests suivants
utilisés pour l’identification des genres de cette famille, notre colonie choisis présente les caractères
suivants :

Indole RM VP Citrate
Escherichia coli + + - -
Enterobacter - - + -
Klebsiella - - + -
citrobacter - + - +

 la réaction d’ RM : cette réaction rendre la teinture de milieu en rouge, montre que le pH de


milieu est inférieur à 4.5, Donc RM positive.
 La réaction VP : dans notre cas cette réaction ne produise pas une coloration rouge à la surface de
tube (la coloré été jaune foncé), indiqué l’absence d’acétoïne. Donc VP négative.
 Indole : l’apparition d’un anneau rouge en surface par l’ajout de réactif de Kovacs, indique la
présence d’indole. Avec la colonie choisis l’anneau rouge n’apparaisse pas. Donc indole négatif.
 Citrate : l’utilisation (dégradation) de citrate traduit par l’alcalinisation de milieu et changement de
couleur vers le bleu, notre milieu reste vert donc la souche sélectionnée n’utilise pas le citrate.
Donc elle est citrate négatif.
 Lactose, glucose, H2S, gaz : la lecture directe sur le milieu après 24h d’incubation, donne les
résultats suivantes : dans le culot, le virage au jaune traduit par une acidification due à l’utilisation
du glucose (glucose+), l’apparition de bulles dans le culot traduit par la production de gaz (gaz+),
un noircissement du à la formation de sulfure de fer (H2S+), dans la pente le virage au jaune due à
la persistante de l’acidification( la souche utilise le glucose qui est en faible quantité, après elle
utilise le lactose), donc lactose (+).

À partir de ces résultats les caractères de cette souche sont similaires avec sels d’Escherichia coli,
donc on peut dire que la souche choisis est Escherichia coli.

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Recherche des streptococcus groupe D:

Les tubes dits positifs sont les tubes présentant un trouble microbien

La lecture sur le milieu Rothe après 24h à 30°C est la suivante :

5×10 1×1 1×0.1


D/C S/C S/C

+ + + + _ _ _

0 0
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Le nombre « 400 » correspond à 15 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries égale :

15 bactéries dans 100ml.

5. Conclusion :

A partir des analyses qu’on les fait, on peut évaluer la qualité de cette eau. Le nombre énorme de
FAMT indique que cette eau ne subi aucun traitement. Encore les résultats d’analyses de coliformes
confirment la pollution et la contamination (d’origine animale) de cette eau, l’identification de genre
E.coli et la présence des streptococcus affirme la présence des germes pathogènes dans l’eau.

La conclusion des analyses induisent que l’eau analysé est impropre à la consommation par ce que il
est contaminé, donc il faut prend des précautions lors de la manipulation de cette eau.

Autre information sont acquises dans cette TP par exemple :

L’application des certains techniques tel que le prélèvement, l’ensemencement, le collage des boites,
l’incubation, le repiquage, la réalisation des tests biochimiques et quelques techniques de lavage et de
stérilisation des matériels. Aussi l’évaluation des risques sur le manipulateur.

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Annexe I : Tableau représente les milieux de cultures utilisées et leurs compositions.

Le milieu La composition pH Remarque


Milieu PCA gélosé Peptone 5g 7.2
(plate count Extrait de levure 2.5 g
agar) Glucose 1g
Gélose 15g

Milieu Peptone 5g 7
BCPL (bouillon Extrait de viande 3g
lactosé au Lactose 10 g
pourpre de Pourpre de bromocrésol 25 mg
bromocrésol)
Milieu Peptone 20 g 7
Rothe (bouillon) Glucose 5g
Chlorure de sodium 5g
Phosphate bipotassique 2.7 g
Phosphate monopotassique 2.7 g
Azide de sodium 0.2 g

Milieu Simmons Sulfate de magnésium 0.2g 6.8 Solidifier en


(gélose au citrate Phosphate monoammonique 1g position inclinée
de Simmons) Phosphate dipotassique 1g
Citrate de sodium 2g
Chlorure de sodium 5g
Bleu de bromothymol 80mg
gélose 12g
Milieu Kligler- Peptone 20g 7.4 Solidifié en
Hajana (milieu Extrait de viande 3g position semi-
lactose-glucose- Extrait de levure 3g inclinée
SH2 de Kligler- Lactose 10g
Hajana) Glucose 1g
Sulfate ferreux 0.3g
Chlorure de sodium 5g
Hyposulfite de sodium 0.3g
Rouge de phénl 2.5mg
gélose 15g
Milieu Clark et Peptone 10g 7
Lubs Phosphate dipotassique 2g
Glucose 5g
L’eau peptonée Peptone exempte d’indole 15g 7.2
Chlorure de sodium 5g

Annexe II : le principe des milieux d’identification.

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Milieu Simmons :

C’est un milieu gélosé incliné contenant un indicateur coloré (Bleu de bromothymol). Le citrate est la
seule source de carbone, la croissance cellulaire est accompagner fréquemment d’une alcalisation qui
se traduit par le virage de milieu au bleu, donc citrate(+).

Recherche d’indole :

L’indole est issu de l’hydrolyse du tryptophane. Après culture de 24h sur l’eau peptonée, l’indole est
caractérisé par le réactif de Kovacs. Quelques gouttes de réactif sont ajoutées au milieu : après
agitation, la présence d’indole se manifeste par apparition d’un anneau rouge en surface.

Milieu Kligler-Hajana :

C’est un milieu gélosé semi-incliné, combiné, il permet la lecture des plusieurs caractères : utilisation
du glucose, avec ou sans gaz, utilisation du lactose, production de H2S.

Les principaux résultats :

Zone du tube Caractère recherché aspect Conclusion


Culot glucose Inchangé Glucose -
(anaérobiose) Jaune Glucose +
Pente (aérobiose) lactose Jaune Lactose -
rose Lactose +
Culot Gaz en glucose bulle Gaz +
ou jonction culot- Inchangé Gaz -
pente H2S Noir H2S +
Inchangé H2S -

Milieu Clark et Lubs :

Permet d’établir la voie de fermentation subie par le germe cultivé. Soit la fermentation d’acides
mixtes ou la fermentation butane-indole. Les réactions sont suivis par les deux réactifs ; Rouge de
méthyle et de Vogs-Proskauer. La lecture des résultats :

La réaction teinte L’indication Résultat


RM Rouge pH<4.5 RM+
jaune Ph >6 RM+
VP Rouge Présence d’acétoïne VP+
aucune Absence d’acétoïne VP-

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