1.

Introduction :
L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie. On l’utilise quotidiennement pour différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels… Et pour ces buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques satisfaisantes. Dans cette TP nous sommes plus intéressants par le recherche dans l’échelle microbiologique, l’orientation de TP été vers : la réalisation des analyses sur l’eau, le rechercher des différents types des germes, la comparaison entre les germes présent dans deux types d’eau (eau potable (de robinet) et l’eau pollué) en plus l’identification des germes. Notre groupe a été choisi pour les recherches dans l’eau pollué. Les germes visés pour la recherche sont : -les germes aérobies mésophiles et psychrophiles dans le milieu PCA gélosé : cette recherche indique plusieurs critères ; l’origine de cette eau, les traitements qu’il a subi. C’est à dire une évaluation de cette eau, un indicateur de la qualité générale et de la stabilité. La recherche des germes à 20°C indique la recherche des germes pathogènes ou résistants. -les coliformes totaux à 30°c dans le milieu BCPL : permet de signalé une contamination fécale d’origine animale, c'est-à-dire une évaluation de risque de présence des germes pathogènes. -les streptococcus type D dans le milieu Rothe : c’est une recherche d’un germe pathogène. Pour l’évaluation des risques sanitaires de cette eau.

2. Matériel et méthodes :
a.matériel : Les verreries : Tube à essais, boite de pétri, des portoirs à tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matériel doit être stérile). Les appareils : Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen. Les milieux de cultures utilisés :  Représenté dans l’annexe I

Les indicateurs chimiques : Rouge de méthyle, réactif de Vogs-Proskauer, le réactif de Kovacs. 1

avec une pipette stérile de 1 ml on ajout 1 ml à partir de flacon qui contient la solution mère et met dans le premier tube «c’est le tube de dilution (10-1) ». après une homogénéisation été réalisée. Trois tubes contiennent 9 ml d’eau physiologique stérile préparées par l’enseignant. Après On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3) dans chaque boites pétri. (Selon le schéma 1). 37°C 10-2 20°C 10-3 EP2 EP2 2 . méthodes d’analyse : 1. le premier jour : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a réalisé des dilutions à partir de la solution mère. Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-2) et met dans le troisième tube « c’est le tube de dilution (10-3) ». Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-1) et met dans le deuxième tube « c’est le tube de dilution (10-2) ». Eau à analysé 10-1 10-2 10-3 1 ml 1 ml PCA PCA Incubation à 37°C et à 20°C. Après on a collé les boites par 10 à 15 ml de milieu PCA préparé et liquidifié par l’enseignant et on a effectué des mouvements en forme de ∞ pour bien mélanger l’inoculum. après la solidification de milieu on a incubé les boites à 30°C et 20°C pendant 72 heures.d.

on a utilisé neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham préparé par l’enseignant. par différents concentrations. Pour les trois tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée. Il faut bien mélanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. dans la quelle. trois tubes doubles concentrés (D/C) et six simple concentrés (S/C). (Selon le schéma 2).1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans les trois tubes simples concentrés qui restes. 3 .Pour la recherche des coliformes totaux : La méthode utilisée c’est « 333 ».1 ml Double concentré simple concentré simple concentré L’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. par différents concentrations. Eau à analysé 10 ml 1 ml 0. Pour la recherche des streptococcus type D : La méthode utilisée c’est « 511 ». dans la quelle. on a utilisé septe tubes remplies (9 ml) par le milieu Rothe préparé par l’enseignant. Après on a l’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h. On a ajouté 1 ml de la même solution dans trois tubes simples concentrés et 0. cinq tubes doubles concentrés (D/C) et deux tubes sont simple concentrés (S/C).

A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de préférence les tubes doubles concentrés positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL gélosé pour but de séparer les colonies produites pour être facile à identifie. On a essai d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique. 4 . l’inoculum été ensemencé à 30°C pendant 24. on a met la pipette pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la gélose collé déjà sur les boites et refroidie.1 ml Double concentré simple concentré Incubation à 30°C pendant 24 à 48 h 2. Eau à analysé 10 ml 1 ml 0.Pour cinq tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée.1 ml (=trois gouttes par pipettes pasteur) de la solution mère dans un tube simple concentré qui reste. (Selon le schéma 3). le deuxième jour :    On a fait la lecture des résultats et le dénombrement sur touts les milieux à l’aide des tableaux de l’indice NPP. Après on a l’incubation à 30°C pendant 24 à 48 h. ce repiquage faite par culture en surface. On a ajouté 1 ml de la même solution dans un tube simple concentré et 0. (Selon le schéma 4).

Tube + BCPL 37°C EP2 Incubation à 37°C pendant 24h. A partir de milieu BCPL gélosé on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois différents tubes par différent mode d’ensemencement. le deuxième est collé par le milieu Kigler-Hajana (solidifié en position semi-inclinée) l’ ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) après des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur. le troisième tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu liquide) l’ ensemencement fait par l’entrée de la pipettes pasteur dans le milieu. 3. les trois tubes sont pour but d’identification biochimique de la colonie sélectionnée. (Selon le schéma 5). le premier tube est collé par le milieu citrate de Simmons (solidifié en position inclinée) l’ ensemencement fait par des stries sur la surface de la pente par pipettes pasteur. les trois tubes sont ensuite incubées à 30°C pendant 24h. 5 . le troisième jour :   On a essai une autre fois d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.

le quatrième jour :    On fait la lecture des résultats sur le milieu PCA (lecture après 72h). il est de 145 colonies à peut prés. le principe de ces réactifs dans l’annexe II. on a estimée le nombre des colonies présentent d’un quart. Alors le nombre des bactéries dans 1ml de solution égale : 6 . trop chargé. 4. La lecture directe de résultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana. dans le deuxième tube on a ajouté des goutte de αnaphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude à 16% (VP2). Résultat et discutions : Pour la recherche des FAMT/FAPT : On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA après 72h seulement la boite incubée à 30°C contient des colonies. On a divisé la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes.Milieu Citrate de Simmons Milieu KiglerHajana Milieu Clark et Lubs L’eau peptonée Incubation à 37°C pendant 24h. dans le premier tube on a ajouté des gouttes de solution rouge de méthyle. pour facilite la lecture on a divisé la boite en quatre. 4.

Donc le nombre des bactéries aérobies mésophiles totale présentent dans cette eau égale 60000 bactéries par un millilitre. présentent un dégagement de gaz (les cloches rempliées par le gaz). 150 colonies PCA 37°C 10-2 EP2 Pour le dénombrement des coliformes totaux : Le dénombrement se fait à partir des tubes s tubes dits positives sont :   Les tubes à virage de couleur (couleur jaune). la méthode de calcule est la suivante : 3×10 D/C 3×1 S/C 3×0.N = (150 ×4) ×102 = 60000 UFC/ml. Par la méthode NPP on a estimée le nombre des coliformes totaux présentent dans l’eau. (Schéma 6).1 S/C + + 3 + + + 3 7 + + + 3 + .

donne les résultats suivantes : dans le culot. dans la pente le virage au jaune due à la persistante de l’acidification( la souche utilise le glucose qui est en faible quantité. donc on peut dire que la souche choisis est Escherichia coli. glucose. après elle utilise le lactose). notre milieu reste vert donc la souche sélectionnée n’utilise pas le citrate. Donc elle est citrate négatif. le virage au jaune traduit par une acidification due à l’utilisation du glucose (glucose+). montre que le pH de milieu est inférieur à 4. Indole : l’apparition d’un anneau rouge en surface par l’ajout de réactif de Kovacs. donc lactose (+). À partir de ces résultats les caractères de cette souche sont similaires avec sels d’Escherichia coli. Donc indole négatif.Le nombre 333 correspond à > 1100 dans le tableau NPP. gaz : la lecture directe sur le milieu après 24h d’incubation. L’identification biochimique des coliformes: Les souches pressentant dans le La boite appartient à la famille d’entérobactérie les tests suivants utilisés pour l’identification des genres de cette famille. H2S. Donc le nombre des bactéries calculés égale : (1100 × 10) = >11000 bactéries dans 100ml. Donc RM positive. un noircissement du à la formation de sulfure de fer (H2S+). indiqué l’absence d’acétoïne. Avec la colonie choisis l’anneau rouge n’apparaisse pas. Citrate : l’utilisation (dégradation) de citrate traduit par l’alcalinisation de milieu et changement de couleur vers le bleu. Donc VP négative. notre colonie choisis présente les caractères suivants : Indole Escherichia coli Enterobacter Klebsiella citrobacter + RM + + VP + + Citrate +     la réaction d’ RM : cette réaction rendre la teinture de milieu en rouge. 8 .5. l’apparition de bulles dans le culot traduit par la production de gaz (gaz+). La réaction VP : dans notre cas cette réaction ne produise pas une coloration rouge à la surface de tube (la coloré été jaune foncé). indique la présence d’indole.  Lactose.

donc il faut prend des précautions lors de la manipulation de cette eau. l’ensemencement. le collage des boites. Aussi l’évaluation des risques sur le manipulateur. on peut évaluer la qualité de cette eau. Donc le nombre des bactéries égale : 15 bactéries dans 100ml. l’identification de genre E. La conclusion des analyses induisent que l’eau analysé est impropre à la consommation par ce que il est contaminé. Le nombre énorme de FAMT indique que cette eau ne subi aucun traitement. 5. Conclusion : A partir des analyses qu’on les fait. 9 . le repiquage. la réalisation des tests biochimiques et quelques techniques de lavage et de stérilisation des matériels. Encore les résultats d’analyses de coliformes confirment la pollution et la contamination (d’origine animale) de cette eau. l’incubation.1 S/C + + + 4 + _ _ 0 _ 0 Le nombre « 400 » correspond à 15 dans le tableau NPP.coli et la présence des streptococcus affirme la présence des germes pathogènes dans l’eau.Recherche des streptococcus groupe D: Les tubes dits positifs sont les tubes présentant un trouble microbien La lecture sur le milieu Rothe après 24h à 30°C est la suivante : 5×10 D/C 1×1 S/C 1×0. Autre information sont acquises dans cette TP par exemple : L’application des certains techniques tel que le prélèvement.

2 Remarque 7 7 Milieu Simmons (gélose au citrate de Simmons) 6.2 Annexe II : le principe des milieux d’identification.8 Solidifier en position inclinée Milieu KliglerHajana (milieu lactose-glucoseSH2 de KliglerHajana) 7.2 g 0.7 g 2.Annexe I : Tableau représente les milieux de cultures utilisées et leurs compositions.5 g 1g 15g 5g 3g 10 g 25 mg 20 g 5g 5g 2. 10 .5mg 15g 10g 2g 5g 15g 5g 7. Le milieu La composition Milieu PCA gélosé Peptone (plate count Extrait de levure agar) Glucose Gélose Milieu BCPL (bouillon lactosé au pourpre de bromocrésol) Milieu Rothe (bouillon) Peptone Extrait de viande Lactose Pourpre de bromocrésol Peptone Glucose Chlorure de sodium Phosphate bipotassique Phosphate monopotassique Azide de sodium Sulfate de magnésium Phosphate monoammonique Phosphate dipotassique Citrate de sodium Chlorure de sodium Bleu de bromothymol gélose Peptone Extrait de viande Extrait de levure Lactose Glucose Sulfate ferreux Chlorure de sodium Hyposulfite de sodium Rouge de phénl gélose Peptone Phosphate dipotassique Glucose Peptone exempte d’indole Chlorure de sodium pH 5g 2.2g 1g 1g 2g 5g 80mg 12g 20g 3g 3g 10g 1g 0.4 Solidifié en position semiinclinée Milieu Clark et Lubs L’eau peptonée 7 7.3g 5g 0.3g 2.7 g 0.

Après culture de 24h sur l’eau peptonée. Milieu Kligler-Hajana : C’est un milieu gélosé semi-incliné. production de H2S. Rouge de méthyle et de Vogs-Proskauer. Soit la fermentation d’acides mixtes ou la fermentation butane-indole. la croissance cellulaire est accompagner fréquemment d’une alcalisation qui se traduit par le virage de milieu au bleu. Recherche d’indole : L’indole est issu de l’hydrolyse du tryptophane. La lecture des résultats : La réaction RM teinte Rouge jaune VP Rouge aucune L’indication pH<4.5 Ph >6 Présence d’acétoïne Absence d’acétoïne Résultat RM+ RM+ VP+ VP- 11 . combiné. Quelques gouttes de réactif sont ajoutées au milieu : après agitation. Le citrate est la seule source de carbone. Les principaux résultats : Zone du tube Culot (anaérobiose) Pente (aérobiose) lactose Caractère recherché glucose aspect Inchangé Jaune Jaune rose Culot ou jonction culotpente H2S Gaz en glucose bulle Inchangé Noir Inchangé Milieu Clark et Lubs : Conclusion Glucose Glucose + Lactose Lactose + Gaz + Gaz H2S + H2S - Permet d’établir la voie de fermentation subie par le germe cultivé. utilisation du lactose. avec ou sans gaz. donc citrate(+). la présence d’indole se manifeste par apparition d’un anneau rouge en surface. Les réactions sont suivis par les deux réactifs . l’indole est caractérisé par le réactif de Kovacs.Milieu Simmons : C’est un milieu gélosé incliné contenant un indicateur coloré (Bleu de bromothymol). il permet la lecture des plusieurs caractères : utilisation du glucose.

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