Université Mohammed V – Rabat

Ecole Supérieure de Technologie – Salé

Département Génie Urbain et Environnement
Deuxième année Environnement et Technique de L’eau

Compte rendu : D’analyses Bactériologiques

Encadré par : Mme Essediya Cherkaoui Réalisé par : chaimae Moultain

Maria

Année Universitaire :
2022 _2023
 Introduction
L’eau est un l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie .on l’utilise quotidiennement pour
différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels...Et pour ces
buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques satisfaisantes.

Matériel :
Les verreries :

Tube à essais, Boite de pétri, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des lames (tout le matériel
doit être stérile).

Les appareils :

Microscopes, bec bunsen, compteur colonie, incubateur.

II. Analyse d’une eau contaminée (Eau usée)

1. Préparation des dilutions
Avant d'ensemencer les milieux, on effectue des dilutions en cascades de la solution 10-1 à la solution 10-7:

1- On met dans chaque tube à essai 9 ml EDS à l'aide d'une pipette stérile.
2- On prélève du tube contenant la l'eau à analyser 1mL que l'on place dans un des tubes contenant les9mL
de l'eau distillée stérile, on homogénéise la solution à l'aide du vortex, puis on prélève 1mL de ce tube pour
le mettre dans un troisième tube et ainsi de suite jusqu'au cinquième tube.
 2. Technique du nombre le plus probable : NPP
 Principe :

La technique du NPP fait appel à la méthode de fermentation en tubes multiples, au cours de laquelle au
moins trois dilutions décimales de l'échantillon sont ensemencées dans des éprouvettes de bouillon et
incubées à une température précise, pendant une période donnée.
La méthode du NPP, dérivée des études de Mac Grady, consiste à interpréter les résultats en comparant les
trois essais et leur résultats. Il s'agit d'une interprétation probabiliste.

 Bactérie concernée.
- Streptocoques fécaux

Les Streptocoques fécaux (Enterococcus ou Streptocoques D) sont des commensaux de l'intestin. Le nombre
de Streptocoques étant en général peu élevé, on utilise dans un premier temps un milieu d'enrichissement
relativement sélectif, le milieu de Rothe.

3. Tests présomptifs
 Milieu utilisée (Rothe) :

Le milieu de Rothe est utilisé pour la recherche et le dénombrement des streptocoques fécaux.
 Ensemencement :

Avant d'ensemencer les tubes, il faut vérifier qu'il n'y a pas de bulles d'air sous la cloche, pour éviter de
fausser les résultats. On prélève 1mL de chacune des dilutions que l'on introduit dans chaque tube. Il faut
agiter pour que l'inoculum soit réparti, y compris sous la cloche. On met les tubes à incuber pendant 24
heures à 37°C.
  Résultat :

Les tubes présentant un trouble bactérien après incubation seront considérés comme pouvant contenir des
streptocoque fécaux.

10 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Nombre 1/1 1 2 0 2 0 0
correspondant

On choisi le chiffre 120. D’après le table de mac Gray n=1.1

Donc la solution initiale contient 11 UFT/1ml

4. Testes confirmatifs :
 Milieu utilisée (Bouillon de litsky) :
Le milieu de litsky n’est qu’un milieu de Rothe additionné d’éthyle-violet.
Ensemencer à partir des tubes positifs dans un tube contenant le milieu de litsky. On met les tubes à incuber
pendant 24 heures à 37°C.

 Résultat :
La présence de streptocoques s’y traduit par un trouble plus au moins important et la formation d’une
pastille violette au fond du tube. (dépôt violet).

10-1 10-2 10-4

Groupement des + +- ++
résultats
 5. Recherche de spores de clostridium sulfito-réducteur :
Pour les spores au niveau des eaux chargée, on réalisé une série une dilution de 10-1 à 10-4. Après on fait
chauffer préalablement ces dilutions 10 minutes à 80°C. Cette étape de chauffage permet de préparer les
spores à la germination. Après, on refroidit les dilutions sous l'eau. Ensuite, et on fait ensemencer 5 ml de
chaque dilution dans un tube contenant le milieu viande foie, (au sulfate de sodium). On met les tubes à
incuber pendant 24 heures à 37°C.

 Résultat :
La présence des colonies de petites tailles par rapport au halo, cela donne l’impression que les colonies sont
noires .Donc l’eau à analyser contient des spores de clostridium sulfito-réducteur.
 3 analyse d’une eau de puie
1. Méthode de filtration sur membranes :
 Matériels
L'appareil est un simple système de filtration sous pression
réduite (trompe à eau).Il contient un support filtre qui reçoit,
Sur une partie en inox fritte à larges pores, la membrane de
filtration. Le godet permet de recevoir l'eau à analyser. Les
deux parties doivent s'assembler de manière solide par aimants,
par caoutchoucs. Enfin, l'ensemble doit être stérilisable
(Parties métalliques : four ; caoutchouc : autoclave).
Les membranes utilisées (en ester de cellulose)
sont généralement quadrillées, et les pores ont
un diamètre de 0,45μm.
 Mode opératoire
L'ensemble de l'appareillage doit être placé
A côté d’un bec benzen, de manière à ménager
une zone de travail stérile et à pouvoir stériliser
le matériel à la flamme.
Préparation de l'appareil
– Flamber la base et le support filtre
Une fois le support filtre refroidi, poser stérilement la membrane stérile
– Flamber le godet
Une fois refroidi, le poser sur la base sans léser la membrane. Filtration
– Verser doucement le l’eau de puie jusqu'à la graduation adéquate (100ml).
– Débrancher le tuyau à vide.

 Mise en culture
–Retirer la membrane.
–La poser sur les boites de pétri contient la nourriture adaptée à chaque bactérie (coliformes totaux,
coliformes fécaux, streptocoques). Sans faire de bulles et sans la retourner (la nutrition des bactéries se fait
au travers).
Le milieu doit avoir une épaisseur minimale de 5 mm et doit être sec.
–Incuber les boites de pétri de coliformes totaux et streptocoques dans un four de 37°C et la boite de
coliformes fécaux dans un four de 44°C.

 Résultats
Photo : streptocoques Photo :Coliformes totaux Photo : Coliformes fécaux

On constate qu’il y a les colonies juste en boite de coliformes totaux

Donc l’eau de puie contient des coliformes totaux.

2. Coloration de gram
a) Faire un frottis:

 Nettoyer une lame à l'alcool.

 Déposer une goutte d’eau distillé sur la lame.
 Toucher une colonie à l'aide d'une pointe jaune ou d'un cure-dent stérile pour
prélever des bactéries. Il n'est pas nécessaire de prendre beaucoup de bactéries
 Frotter la pointe dans la goutte d'ED. Laisser sécher à l'air.
 Passer 3 fois la lame dans la petite flamme (veilleuse) du bec Bunsen pour fixer
l'échantillon à la chaleur.

b) Coloration et explications:

 Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane (cristal violet) sur le

frottis fixé.

 Laisser agir 1 minute. Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.

 Jeter l'excès de colorant dans un bécher.
  Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis. Le Lugol (composé iodé) est un mordant qui permet
de fixer le violet dans les bactéries.
 Laisser agir 1 minute.
 Jeter la solution de Lugol dans un bécher.
 Déposer quelques gouttes de l’Alcool pour 30 secondes
 Rincer la lame avec l’eau distillé.
 Déposer quelques gouttes de fuschine pour 30 min
 Lavage de la lame avec l’eau distillé.
 Séchage avec du papier joseph.
 Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au
grossissement 1000x).

c) Résultats :

Photo : coliforme totale à microscope (Gram -)

Les bactéries observées dans la souche sont des bactéries de type bacilles de couleur rose. Ce sont donc des
bactéries Gram (-). Elles ont donc sur leur paroi un peptidoglycane mince et peu ponté.
 3. Micro Galerie
◉ Galerie d'identification API 20

L'API 20E comprend une bande en plastique contenant 20 mini-puits de test. Chaque puits contient des
milieux déshydratés avec des compositions chimiquement définies pour détecter généralement l'activité
enzymatique, principalement liée à la fermentation des glucides ou au catabolisme des protéines et des
acides aminés par les organismes inoculés.

Les differents tests dans l'API 20E :

1- ONPG : test de l'enzyme β-galactosidase par hydrolyse du substrat o-nitrophényl-bD-

galactopyranoside
2- ADH: décarboxylation de l'acide aminé arginine par l'arginine dihydrolase
3- LDC: décarboxylations de l'acide aminé lysine par la lysine décarboxylase
4- ODC: décarboxylations de l'acide aminé ornithine par l'ornithine décarboxylase
5- CIT: utilisation du citrate comme seule source de carbone
6- H2S: production de sulfure d'hydrogène
7- URE: test de l'enzyme uréase
8- TDA (Tryptophane désaminase): détection de l'enzyme tryptophane désaminase: réactif à
mettre - Chlorure ferrique.
9- IND: Test Indole - production d'indole à partir de tryptophane par l'enzyme tryptophanase.
Réactif - L'indole est détecté par l'ajout du réactif de Kovac.
 10- VP : le test de Voges-Proskauer pour la détection de l'acétoïne (acétylméthylcarbinol)
produite par fermentation du glucose par des bactéries utilisant la voie du butylène glycol
11- GEL: test de production de l'enzyme gélatinase qui liquéfie la gélatine
12- GLU: fermentation du glucose (sucre hexose)
13- MAN: fermentation du mannose (sucre hexose)
14- INO: fermentation de l'inositol (polyalcool cyclique)
15- SOR: fermentation du sorbitol (sucre d'alcool)
16- RHA: fermentation du rhamnose (sucre de méthyl pentose)
17- SAC: fermentation du saccharose (disaccharide)
18- MEL: fermentation du mélibiose (disaccharide)
19- AMY: fermentation de l'amygdaline (glycoside)
20- ARA: fermentation de l'arabinose (sucre pentose)
◉ Préparation de la galerie

 Prenez une seule colonie isolée (à partir d'une culture pure) et faites une suspension bactérienne dans
de l'eau distillée stérile (0,5 McFarland).
 Réunir fond et couvercle d 'une boîte d 'incubation et répartir de l 'eau dans les alvéoles pour créer
une atmosphère humide.Puis déposer stérilement la galerie dans la boîte d 'incubation
Prenez une pipette pasteur et remplissez ces compartiments avec la suspension bactérienne

Incuber la galerie à 37°C pendant 18 à 24 heures

Puits Réactif
TDA Une goutte de réactif TDA
IND Une goutte de réactif de James ou kovacs
VP Une goutte de réactif de VP1 puis VP2

◉ Lecture de la galerie