Université Saad Dahleb-Blida

Faculté de Médecine
Département de Pharmacie

TECHNIQUES D’IDENTIFICATION
DES
CHAMPIGNONS LEVURIFORMES

Dr L.Rezkallah
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie
Année universitaire: 2019-2020
 Introduction

Mycoses

Champignons Champignons Champignons

levuriformes filamenteux dimorphiques
 Champignons responsables
Champignons
• Candida filamenteux
Levures

Vrais
• Cryptococcus Opportunistes
Intérêt Pathogènes

• Malassezia Aspergillus,
Médical Penicillium,
Fusarium,
Acremonium, Mucorales Dermatophytes
Trichosporon Secedosporium
Saccharomyces Geotrichum,
Rhodotorula
Alternaria..
Démarche diagnostique d’une mycose
Diagnostic direct Diagnostic
Mycologique Séro-immunologique
• Plvts (superficiel, liquide • Recherche d’Ac sériques
biologique ou profond) (Dg indirect)
et/ou
• Examen Direct et/ou anapath • Recherche d’’Ag circulants
• Culture : Isoler, dénombrer,
puis identifier (genre, espèce) Mycoses profondes et
systémiques

Biologie moléculaire:
Surveillance épidémiologique (génotypage, taxonomie)
Buts Dg
Milieux de culture en mycologie

Milieux
Milieux d’isolement
d’identification

Sabouraud-
Sabouraud-
Chloramophénicol- Choisis
Chloramophénicol
Actidione fonction du Dg
(SC)
(SAC)

Levuriformes Filamenteux
 Poussée sur ½
d’isolement
(SC, SAC)

Champignons Levuriformes Champignons Filamenteux

(Levures) (Dermatophytes, opportunistes)

Identification  ½ d’identification:
Fonction du Dg
 Milieux d’identification
Pour la plupart des champignons filamenteux:
les milieux d’isolement sont des milieux
d’identification
Pour les levures  il faut des milieux
d’identification
 Milieux d’identification
Souche stréile sur ½ Sabouraud

Sporulation
(conidiogenèse, fructification)

Production de pigment

Identification d’une levure (culture levuriforme)

ou d’un champigon filamenteux
 Identification du champignon en
cause (genre et espèce) utile pour:
Sélectionner et adapter au mieux la thérapeutique
Déterminer source de contamination
Mieux comprendre l’épidémiologie de l’agent en
cause
Prévoir l’évolution de la maladie
Agir sur les facteurs favorisants
 Identification des champignons après isolement
sur ½ de culture (SC, SAC)

Critères macroscopiques et microscopiques des cultures

Caractères culturaux et critères
macroscopiques: Caractères (critères)
microscopiques:
Vitesse et T° de croissance; texture
(duveteuse, poudreuse, plâtreuse, Thalle « hyphes » (septés ou non,
laineuse, cotonneuse, crémeuse,…); taille, régulier ou irrégulier, hyalins ou
allure (glabre, humide, verruqueuse noirs); blastospores (+/-)
cérébriforme); relief (plane, bourgeonnantes; pseudomycéliums,
surélevée); taille; odeur; couleur des vrais mycéliums, arthrospores; forme
colonies au recto et verso (revers); des spores (endogène ou exogène);
présence ou non de pigment diffusant têtes aspergillaires; pinceau;…
dans la gélose
Critères physiologiques, biochimiques, tests immunologiques
Critères moléculaires (Biologie moléculaire)
Spectrométrie de masse (MALDI-TOF)
TECHNIQUES D’IDENTIFICATION
DES
CHAMPIGNONS LEVURIFORMES
 Identification des levures au laboratoire:
Nécessite de disposer de colonies bien individualisées
Un ré-isolement s’avère parfois nécessaire.
Même si un Dg de présomption a déjà été posé par isolement sur
½ chromogénique

Il est nécessaire de confirmer l’identité de la levure

En pratique, l’identification repose sur:
Aspect macroscopique et microscopique des cultures
Caractères morphologiques (Tube germinatif, chlamydospores
terminales)
Surtout tests physiologiques (étude d’assimilation de sucres à l’aide de
galeries: Auxacolor), immunologiques ou même biochimiques
Parfois l’identification moléculaire (Labo spécialisés) ou spectrométrie
de masse
 Identification de Candida albicans
Identification de la levure isolée comprend:

 Dans un 1e temps la recherche de l’appartenance à l’espèce

C.albicans = Espèce la (+) fréquemment impliquée dans
levuroses.

Plusieurs techniques peuvent être utilisées: Les (+)

anciennes:
Test de blastèse
Et la recherche de la chlamydosporulation
 Test de blastèse (Test de germination)
(Test de filamentation dans le sérum )
Un bon procédé d’identification rapide de C.albicans (adapté au Labo pauvre et
éloigné) basée sur :
Rapide germination des levures et formation d’un filament (tube germinatif) dans
sérum animal ou humain à 37°C et en 3h ( en 4h maximum):

0,5 ml de sérum + qq gttes d’1 suspension de levure diluée dans H₂O distillée stérile
Test est réalisé avec témoin négatif (0,5 ml d’H₂O distillée stérile + qq gttes d’1
suspension de levure diluée)
Après 3h d’incubation à 37°C →Tube germinatif partant de la levure (blastospore):
Fin et flexueux, ne présente pas de constriction à sa base

C.albicans (mais aussi C.dubliniensis):

Produit en 3 heures, un tube germinatif à partir des blastospores
↓
Il est impératif de ne pas dépasser 3h (4h):
Autres espèces de levures pourraient alors produire des tubes germinatifs
Tubes germinatifs
 Recherche de la chlamydosporulation
 Sur ½ PCB (Pommes de terre-Carotte-Bile) ou RAT (Crème de Riz-Agar-
Tween) ou Rice Cream (Milieu à base de crème de riz): (½ pauvres en
sucre ):

C.albicans produit en 24 à 48h (72h) à 20-28°C des chlamydospores

terminales (spores de résistance) à l’extrémité de pseudofilaments.
C.dubliniensis produit lui aussi des chlamydospores terminales sur ces
milieux. Elles sont plus abondantes et disposées par paires ou par
triplets

PCB:

Culture obtenue sur ½ Sabouraud est repiquée sur ½ PCB:

Quelques stries dans le fond du tube, puis une strie longitudinale
légèrement en profondeur
20 à 28°C
Recherche de la chlamydosporulation
PCB (Suite):
 Après 24 à 48h (72h), Prélever un fragment de gélose dans les zones
filamenteuses développée légèrement en profondeur dans le ½ PCB
 Écraser entre lame et lamelle et observer au M.O

Au microscope (MO): Chlamydospores terminales de C.albicans = Grosses

spores terminales de résistance, rondes ou ovales, ≈ 6 à 12 µ de Ø
à paroi épaisse, à double contour
Chlamydospore terminale

Proto-Chlamydospore
 Recherche de la chlamydosporulation
 Rice cream: (Technique française)
 Ce ½ est coulé dans 1 boite de Pétri→ Se solidifier
 On réalise 1 suspension en eau stérile de levures
isolées sur ½ d’isolement
 On verse qlq gouttes à la surface et à l’aide d’1 râteau
on badigeonne la surface
 Placer 2 à 3 lamelles
 On ferme la boite et on incube 24 à 48 h (72h) à 20-28°C
 On observe directement la boite sous microscope
au niveau des lamelles

*S’il y a seulement levures (blastospores)→ Inidentifiables

*S’il y a formation de:
Mycélium ou pseudomycélium Candida
+
albicans/
Chlamydospores terminales C.dubliniensis
Recherche de la chlamydosporulation
Rice cream: Technique de Dalmau (Anglo-Saxons):
Prendre les colonies à partir du ½ d’isolement
Ensemencer directement sur Rice cream coulé en boite de Pétri
(Ss dilution de colonies):
En pratiquant 3-4 lignes horizontale entrecoupées de 3-4 lignes
verticales
Déposer une lamelle
Incuber 24-48h (72h) à 20-28°C
 Lecture: directement sous microscope au niveau de lamelle
 Recherche des Chlamydospores terminales
Avantages:
Lancer +ieurs malades dans 1 même boite de Pétri ≠ technique de
Rice Cream française (1seul malade)
Pas besoin de dilution de colonies
Recherche de la chlamydosporulation

Candida albicans/Candida dubliniensis

Chlamydospores terminales Chlamydospores terminales
(Candida albicans) (Candida dubliniensis)

Candida albicans/Candida dubliniensis

 Tests d’identification rapides :
Tests d’aggtutinations sur particules de latex (Tests immunologiques)
 Bichro-latex® albicans (Fumouze Diagnostics) (5mn):
Principe :
Agglutination sur lame, en présence
de blastospores de C.albicans, de particules de latex
sensibilisées par un Ac monoclonal spécifique d’un Ag de la paroi.
Ces particules de latex colorées en rouge sont en suspension dans un
contre-colorant vert
Si C.albicans → formation d’agglutinats rouges sur un fond vert.
Excellente sensibilité et une grande
spécificité: Cpxe C.albicans/C.dubliniensis.
Egalement (+) pour C.dubliniensis
 Pas de ≠ ciation entre les 2 espèces

Candida albicans/Candida dubliniensis

Tests rapides d’identification biochimique

 Trois Permettant d’identifier C.albicans :

Murex C.albicans (Murex Diagnostics)
Albicans-Sure® (Clinical Standards Laboratoires)
BactiCard Candida® (Remel CO): 30 minutes

Ces tests reposent sur :

Recherche de 2 activités enzymatiques:
β-galactosaminidase et L-proline aminopeptidase

 MEE de ces 2 activités enzymatiques associées

Signant Dg de C.albicans/C.dubliniensis
BactiCard Candida® (Remel CO). Incubation à 35-37 ° C pendant 30 minutes

Candida albicans/Candida Rose ou rouge Couleur jaune

Présence de Présence de B-
dubliniensis
L-proline galactosaminidase
aminopeptidase
Gde majorité de ces tests biochimiques, repose sur:

Etude de l’assimilation (utilisation) des sucre (source

de Carbone) en aérobiose (auxanogramme)
Pour certains de la fermentation de sucres
(zymogramme)
↓
De Nbreux dispositifs miniaturisés et standardisés
sont commercialisés tels que les galeries Api® 20C Aux
ou ID® 32C commercialisés par bio Mérieux
Actuellement des galeries colorimétriques sont
commercialisées
Auxacolor : Auxanogramme colorimétrique:
 Repose sur l’assimilation des sucres
 Plus utilisé
 Identification des principales levures d’intérêt médical
 Levure placée en aérobiose en présence d’un panel (+/-)
large de sucres
 Sucres déjà distribués S/F lyophilisée au fond des cupules
de la galerie.
 Lorsque la levure assimile le sucre
↓
Croissance de levures est visualisée par virage d’1 indicateur
pH (bromocrésol pourpre)
Actuellement des galeries colorimétriques sont
commercialisées
Selon les dispositifs commerciaux, des levures peuvent être identifiées:
Espèces genre Candida
Mais aussi Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Saccharomyces

Auxacolor®2 (Bio-Rad) :
15 tests colorimétriques dont 13 reposent sur l’assimilation de sucres
2 dernières cupules permettent la recherche des activités enzymatiques:
 Hexosaminidase (HEX)
Phénoloxydase (POX)/Proline arylamidase (PRO)

La galerie « Auxacolor »
 16 cupules:
C Neg, assimilation
de 13 sucres, 2
enzymes ( HEX et
POX/PRO)

Interprétation:
Après traduction du profil d’assimilation en un code numérique:
Identification de l’espèce est assurée par comparaison à des bases de données
 Zymogramme:
Etude de l’assimilation des sucres en anaérobiose
(réalisée en recouvrant les cupules d’huile de paraffine)
Assimilation par la voie fermentative
↓
Virage de l’indicateur de pH en raison de production de
métabolites acides.
 Discrimination entre C.albicans et C.dubliniensis, 2
espèces très voisines :
Sur les galeries d’identification→ Pas toujours aisée
Caractères physiologiques peuvent être identiques (pr 2 espèces
voisines dans certaines galeries)

Important: caractères macroscopiques et microscopiques →

Identification des levures
Nbreuses chlamydospores (C.dubliniensis)
Caractéristiques morphologiques
Milieux fluorogéniques pour isolement et
identification des levures :
½ Fluoroplate® Candida (Merck): Après 24 à 48 h
d’incubation
↓
Détection et l’identification directe de C.albicans:
Examen des boîtes S/ lumière ultra-violette à
366 nm

Fluorescence bleutée des colonies

 Identification des espèces non albicans
Réduction des sels de tétrazolium :
Repose sur:
Réduction du Chlorure de 2,3,5-triphényl tétrazolium incorporé
dans ½ de culture (Sabouraud-tétrazolium: ½ de Pagano-Levin et
Trejo: ½ de CTT ) → Recherche de la réductase
Produit coloré : Coloration Colonies allant du rose au rouge f(espèce)
Cependant : la différenciation reste assez subjective.

 Intérêt très limité, pour l’identification: Pas commercialisé En France

 Intérêt majeur réside dans la visualisation des associations

Supplanté par les milieux chromogéniques: beaucoup plus discriminants
C.albicans  Blanc crème ( Rx négative)
C.tropicalis Rouge foncé à violet (Rouge violet) (Rx positive)
 Identification des espèces non albicans
Tests d’identification rapides : Tests immunologiques :
Tests d’aggtutinations sur particules de latex

Basés sur: Agglutination Par les blastospores de :

Particules de latex
C.dubliniensis (BichroDubli®, Fumouze Diagnostics)
sensibilisées par un Ac
ou
monoclonal
C.krusei (Krusei Color®, Fumouze Diagnostics)
spécifique d’espèces
 Candida check® (latron Laboratoires) =
Kit basé sur des tests d’agglutination sur lame
Utilise un panel d’immunsérums polyclonaux de lapin
Identifier les 9 principales espèces du genre Candida
en f (profil d’agglutination).
 Bichro-Dubli Fumouze®
5 minutes+++

Krusei color Fumouze®

5 minutes +++
 Identification des espèces non albicans
Tests biochimiques :
Le test Glabrata RTT® (Fumouze Diagnostics): Détection rapide de la
tréhalase
Réalisation simple, rapide 20 minutes ++++
Test basé sur des activités enzymatiques particulières pour C. glabrata
↓
Identification rapide des colonies de Candida glabrata:
Hydrolyse le tréhalose et pas d’hydrolyse du maltose
Autres espèces peuvent hydrolyser ces deux hydrates de carbone exp:
C.tropicalis
 Identification des espèces non albicans
Gde majorité de ces tests biochimiques, repose :

Etude de l’assimilation des sucre en aérobiose (auxanogramme)

Pour certain de la fermentation de sucres (zymogramme)

De Nbreux dispositifs miniaturisés et standardisés sont commercialisés

tels que les galeries Api® 20C Aux ou ID® 32C commercialisés par
bioMérieux

Auxanogramme (utilisation des sucres en aérobiose):

Levure placée en aérobiose en présence d’un panel (+/- ) large de sucres
Sucres déjà distribués S/F lyophilisée au fond des cupules de la galerie.
Lorsque la levure assimile le sucre, sa X°

Trouble dans les cupules ou virage d’un indicateur pH

 Identification des espèces non albicans
Zymogramme:
Etude de l’assimilation des sucres en anaérobiose
(réalisée en recouvrant les cupules d’huile de paraffine)
Assimilation par la voie fermentative
Virage de l’indicateur de pH en raison de production de métabolites acides.
 Interprétation:
Après traduction du profil d’assimilation en un code numérique
Identification de l’espèce est assurée par comparaison à des bases de
données.
Selon les dispositifs commerciaux:
Espèces genre Candida (10-63 espèces peuvent être identifiées)
Mais aussi Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Saccharomyces,
Geotrichum
Auxacolor®2 (Bio-Rad) :
15 tests colirimétriques dont 13 reposent sur l’assimilation de sucres
2 dernières cupules permettent la recherche des
activités enzymatiques:
Hexosaminidase (HEX)
Phénoloxydase (POX)/Proline arylamidase (PRO)
 Auxacolor®2 (Bio-Rad):→ 16 cupules:
C Neg, assimilation de 13 sucres, 2 enzymes ( HEX et POX/PRO)
Espèces genre
Candida
Cryptococcus,
Trichosporon,
Rhodotorula et
Saccharomyces
Geotrichum
Milieux chromogènes (Milieux chromogéniques,
Géloses chromogéniques):
Contenant des substrats chromogènes qui révèlent des activités
enzymatiques propres à certaines espèces  Coloration particulière
f(espèce).
Coloration particulière f (espèce).
Hydrolyse
Substrat chromogénique Coloration spécifique
Enzyme spécifique

Exemple :
N-acétyl-β-D-
galactosaminidase
↓
C.albicans
 Milieux chromogènes (Milieux chromogéniques,
Géloses chromogéniques)
Particulièrement indiqués: Dg des candidoses
Plus onéreux que les milieux standards
Gain du temps (24 à 48 heures)
Facilite la détection des associations de levures
Identifier directement C.albicans (Identification du cplexe C. albicans/
C.dubliniensis): :
Colonies en bleu (Candida ID®2, bioMérieux)
Colonies en vert (CHROMagar® Candida, Becton-Dickinson)
Pas ≠ ciation entre colonies de C. dubliniensis et C.albicans (très
voisines) → Identification du cplexe C. albicans/ C.dubliniensis
Identification présomptive des espèces non albicans  Tests
complémentaires pour identification précise
Exp : isolement sur milieu chromogène CandiSelectTM4
C.albicans→ colonies rose violet
C.tropicalis→ colonies bleu (turquoise)

½ chromogénique (Candichrom II) :

C.albicans et C.dubliniensis  Colonies

bleues
Autres espèces  Colonies restent
incolores
ChromagarCandida

Avantage des milieux

spéciaux/aux milieux
conventionnels (5-6j)
Identification est rendu très
rapide pour Candida albicans→
24h-48h
Suspicion de C.tropicalis,
C.krusei et C.glabrata (résistantes
au fluconazole)  identification
(galeries )→ 48 h à 72 h
Détection facile de cultures
mixtes
Discrimination entre C.albicans et C.dubliniensis, 2 espèces très
voisines :

Sur les galeries d’identification: Pas toujours aisée,

Caractères physiologiques peuvent être identiques
(pr 2 espèces voisines dans certaines galeries)

Important: caractères macroscopiques et microscopiques→

Identification de levures: Nbreuses chlamydospores

 NB: Sensibilité à l’actidione: Permet de caractériser certaines

espèces de candida . exp: le C. tropicalis, qui ne pousse pas sur ce
milieu
Hémocultures : (Levuroses invasives)
Recommandé :
Bactec®IC/F Mycosis, Becton-Dickinson: lecture automatisée
Mesure du Co2 produit au cours de la croissance de la levure
Bact /ALERT® (bioMérieux): automatisé, même ½ de culture pour :
•Détection des bactéries et des champignons.
•Détection de la croissance fongique repose sur une méthode
colorimétrique (Bact/ALERT®) ou fluorimétrique (Bactec®).
Flacons devront être maintenus dans l’appareil au minimum 2 semaines
A défaut de méthodes automatisées:
Hémocultures pour bactériologie peuvent êtres utilisées (pour levures)
En particulier les flacons destinés aux bactéries aérobies
(C.glabrata : incapable de se multiplier en anaérobiose)
Ces ½ pour hémocultures :
Pas identification directe des levures.
En cas de positivité Réaliser un repiquage sur:
½ standard ou mieux ½ chromogénique
 Détermination de la sensibilité aux antifongiques (ATF)
«antifongiramme»:
Parallèlement à l’identification, la détermination de la sensibilité
aux ATF doit être réalisée en cas :
Levure isolée d’une hémoculture ou d’un site profond
Levure isolée d’un site superficiel, en cas de récidive ou d’échec TRT
Patients ID ou soumis à des fortes pressions de sélection par des
ATF utilisés en prophylaxie (risque de résistance secondaire) ou un
TRT ATF en cours

Actuellement tests colorimétriques sont commercialisés:

FUNGITEST® (BIO-RAD):
Appréciation de la croissance repose sur la réduction de l'indicateur
coloré qui entraîne un virage du milieu du bleu au rose.
Lorsque la croissance est inhibée par l'antifongique, le milieu reste
bleu.
 FUNGITEST® (BIO-RAD)

Lecture et interprétation des résultats

N'effectuer la lecture que si les cupules Témoins de croissance (T+) sont roses.
Observer l'éventuel virage de couleur dans les cupules contenant les ATF par
rapport aux cupules témoin négatif (bleu).
Interpréter en fonction de la couleur des 2 cupules pour chaque
ATF :
Bleu-Bleu = absence de croissance : souche inhibée par l‘ATF
in vitro
Rose-Bleu = faible croissance : souche intermédiaire
Rose-Rose = croissance : souche non inhibée par l'antifongique in vitro.
Démarche d’identification d’1 levure du genre Candida au laboratoire
Démarche d’identification d’1 levure du genre Candida au laboratoire
 Levuroses
superficielles:
1 puis 2 puis 3
Levuroses
profondes:
1 et 2 et 3
(en même 1

temps) 2

3
 Autres techniques: Biologie moléculaire
Applications de PCR à l’identification des levures à partir :
(Flacons d’hémocultures ou cultures sur gélose) limitées:

Performance et simplicité des techniques conventionnelles

(galerie d’identification, tests d’agglutination et ½ chromogéniques).
Cependant, 48 à 96 heures avant d’aboutir à l’identification de l’espèce,
↓
PCR : Réduire considérablement ce temps d’analyse (identifier en (-) de 24 h)
Rapide
Permet à la fois la détection et identification de levures, le suivi de l’infection par PCR
en temps réel.

 Coût ↗> techniques mycologiques classiques, pas une technique de routine→ Labo
spécialisés
Recours à la biolmol : Levuroses profondes:
Choix d’ATF nécessite l’identification rapide de l’espèce en cause
Une des approches moléculaires : ≠ciation entre C.albicans et C.dubliniensis
 Autres techniques: Biologie moléculaire
Méthodes de typage moléculaire :
Basées sur l’analyse de la variabilité du génome

Enquêtes épidémiologiques: en ½ hospitalier +++

Dans un contexte d’infection nosocomiale (une origine exogène) notamment

au sein des services accueillant des patients ID

Typage des isolats rencontrés dans un contexte supposé d’épidémie

Démontrer la transmission interhumaine (Personnel soignant).

Candidose chronique ou récidivante, permet de différencier :

Portage chronique d’une même souche possédant un profil particulier
de virulence ou de résistance aux ATF
De réinfections successives par des souches différentes
Autres techniques: La spectrométrie de masse MALDI-TOF
(matrix assisted laser desorption/ionisation-time-of-flight) :

Alternative intéressante à l’identification moléculaire.

Approche protéomique: Identification rapide directement à partir des

cultures.

Consiste à séparer et identifier des molécules selon leur masse et leur

charge

 Système AXIMA@SARA-MIS, de Shimadzu :

Identifier en qq minutes seulement les bactéries (Gram positives ou
Gram négatives), mais aussi les levures et les champignons
filamenteux sur la base de leur empreintes : MALDI-TOF MS.

Temps de préparation et le coût des consommables sont

considérablement < Techniques moléculaires
 A coté à l’identification de levure,
Diagnostic séro-immunologique est indiqué:

Levuroses profondes :
Procédures invasives difficiles ou impossibles pour isoler levures

Dvpt de méthodes séro-immunologiques complémentaires

MEE d’Ac sériques et/ou d’Ag circulants

(Marqueurs d’infection fongique invasive)

Candidoses profondes →Recherche d’Ac couplée à la

recherche d’Ag +++
Identification de Cryptococcus
Levures, dans la majorité des cas:
Présentent capsule polysaccharidique
Produisent pigment caroténoïde
Colonies beiges à ocres
 Genre Cryptococcus:

Pas filaments mycéliens, ni pseudomycélium

Pas fermentation des sucres
Assimile l’inositol
Sensible à l’Actidione®

Cryptococcus neoformans:
Pousse à 37°C
Atteinte Neuroméningée,
disséminées et superficielles
Identification de Cr.neoformans
Culture sur Sabouraud sans Actidione® (cycloheximide)

Cr.neoformans pousse bien à 37°C, ≠ espèces de cryptocoques.

Levure pousse en 3 à 5 jours. Des souches (jusqu’à 3 semaines)

Macroscopie :
Colonies sont d'aspect muqueux, prenant très rapidement un aspect brillant, coulant,
de couleur beige à ocres
Microscopie:
Levures globuleuses, de 2 à 12µm de diamètre. Présence de rares bourgeons,
multilatéraux.
En culture, les capsules deviennent très petites, et sont plus difficiles à MEE.

A l’examen à l’encre de Chine diluée au 1/3e (1/5e):

↓
MEE Capsule (Aspect en négatif)
Identification de Cr.neoformans:
Sur PCB ou RAT:
Pas de filamentation.
 ½ PCB, à l’extrait de malt : Production des capsules polysaccharidique
Gélose à l’inositol→ Prélèvements polymicrobiens (Assimile l’inositol)
Uréase sur milieu urée-indole :
Positive en 3 heures est déterminant à 37°C (en moins de 4h)

Assimilation des sucres (auxanogramme: Auxacolor):

Galactose, saccharose, maltose, raffinose, inositol positifs
Lactose négative
Recherche de la phénoloxydase :
½ de Guizzotia abyssinica (à base graines de niger) ou sur milieu à l’acide caféique :
en 2 à 3 jours, à 27°C, Levure se colore en brun foncé à noir  Pigmentation des
colonies (colonies pigmentées brun foncé à noir): Cette couleur brune est due à la
phénoloxydase
Ce caractère fait partie des galeries d’assimilation des sucres Auxacolor® et
Fungichrom® et se recherche en même temps que l’assimilation des sucres.
Identification de Cr.neoformans:
Recherche de la pathogénicité chez la souris :
Après inoculation intracérébrale à des souris jeunes:
•Soit d’une suspension de levures en eau physiologique
•Soit de LCR ou de broyat d’organe,
Si Cr.neoformans, la souris meurt en 8 à 15 j:
•Prélever le cerveau et faire un examen direct à l’encre de Chine diluée
(Capsule).
•Très nombreuses levures avec une capsule importante.

A coté à l’identification de levure, Diagnostic

séro-immunologique peut être utilisé:
Recherche de l'antigène circulant+++++:
glucuronoxylomannane GXM
Recherche d’anticorps (pas contributive car ID)
Biologie moléculaire :
Peu d’intérêt dans Dg: taxonomie (génotypage et sérotypage)
Identification de Malassezia
Culture :
Rarement réalisée en pratique courante: Pas indispensable au Dg. Examen
direct est déterminant dans Dg de pityriasis versicolor
Identification des espèces en cause

 M.pachydermatis (non lipodépendante): pousse sur½ Sabouraud usuel

 Autres espèces lipodépendantes de Malassezia : ½ spécifiques :

 ½ de Sabouraud recouvert avant l’ensemencement d’une fine couche
d’huile d’olive (additionné d'huile d'olive)
½ de Dixon ou milieu de Leeming (pour isoler et st tester sensibilité de
M.furfur aux antifongiques)

Infections systémiques :
Hémocultures sur milieu spécifique enrichis en lipides, rarement (+).
Cathéter (Mis en culture)

Température optimum de croissance: 30 à 37°C

Malassezia poussent en 8 jours:
Macro: Colonies lisses, blanchâtres à chamois

Micro : blastospores ovoïdes à allongées de 2 à 8µ à bourgeonnement

unipolaire sur une base large

Malassezia furfur
Identification en culture est fondée sur :
Lidépendance ou non
Morphologie microscopique des blastospores
Activité catalasique
Profil d’assimilation du tween 20, 40, 60, 80.
Toutes les espèces de Malassezia → Pas fermentation de sucres
Toutes les espèces de Malassezia → uréase positive
Identification des autres levures
(Trichosporon, Saccharomyces
et Rhodotorula)
↓
Caractères culturaux, morphologiques et
physiologiques (Galeries: Auxacolor)
Identification de Trichosporon.sp:
 Présence de Nbreux filaments mycéliens se dissociant en
arthrospores
 Blastospores polymorphes associées à des pseudofilaments
 Pas fermentation de sucres
Présence d’uréase
 6 espèces → Pathologie humaine
T.asahii,T.mucoides et T.inkin (mycoses profondes): ID
T.inkin, T.ovoides ,T.asteroides, T.cutaneum (mycoses superficielles)
Identification :
Caractères culturaux, morphologiques (macroscopiques
et microscopiques) et physiologiques

Galeries: Auxacolor
Identification de Trichosporon.sp:
Macro : Colonies cérébriformes à gros plis au centre, planes ou en dôme,
sèches ou humides en périphérie, aspect farineux, bords fissurés, de couleur
blanche à crème
Micro : Filaments mycéliens septés,
Se dissociant (se désarticulent) en arthrospores rectangulaire,
blastospores parfois bourgeonnantes
Sur PCB ou RAT : filaments arthrosporés, arthrospores et blastospores

Diagnostic d’espèce :
Etude d’assimilation des sucres : Auxacolor
T° de Croissance (30, 37°C)
Sensibilité ou résistance à l’actidione
Réduction des sels de tétrazolium : Positive ou faiblement positive)
 Identification de Saccharomyces:
Levures ellipsoïdales ou cylindriques
Habituellement pas filaments mycéliens ni
pseudofilaments
Culture:
 Principalement de blastospores
Asques (½ particuliers):1 à 4 ascospores/asque
Fermentation vigoureuse
Pas d’assimilation du nitrate
Saccharomyces cerevisiae : levure de bière classique
(industrie agroalimentaire) souvent isolée ♂
Saccharomyces boulardii: var de S.cerevisiae (Ultralevure®)
Identification de Saccharomyces cerevisiae :
Macroscopie : Colonies blanc à crème, crémeuses, lisses et bombées
Microscopie: Levures globuleuses, de grande taille mesurant de (5-8) x (6-
12)µm

Sur RAT ou PCB:

Pas de pseudofilamentation. (Certaines souches: une filamentation
rudimentaire)
Parfois, sur ces milieux, des asques contenant 1 à 4 ascospores rondes
NB: En l’absence
d’asques:
Repiquage sur ½ à
l’Acétate de Sodium
(MAS)→ Après 48 h à
27°C→ Pratiquement
toutes les souches
forment des asques.
Identification de Saccharomyces cerevisiae :
Espèce cerevisiae est retenue sur:
Assimilation des sucres : (Auxacolor)
Réduction des sels de tétrazolium positive : Colonie: rouge
Sensible à l’actidione
Fermentation des sucres :
Glucose très positif
Galactose, saccharose, maltose variables
Lactose négative
Identification de Saccharomyces boulardii:
Macro: Colonie blanche, crémeuse, lisse
Micro : Levures de (+) petite taille, ovoïdes à allongées, de (3-4)/ (4-8)µ
Sur RAT ou PCB, absence de pseudo et de vrais filamentation
Absence d’asques et d’ascospores
Caractères physiologiques = de S.cerevisiae →Dg ≠tiel se pose donc
uniquement sur la morphologie :
Levures (+) petites, (+) ovoïdes
Absence d’asques et d’ascospores après repiquage sur MAS
 Identification de Rhodotorula:
Commensale de peau, ou muqueuses: Pouvoir pathogène très limité
(A discuter cas/cas)
Examen direct positif, culture (+) pure abondante et répétée
½ extérieur, notamment dans l’eau.
Produit en culture pigment caroténoïde:
Colonies orangées à rouge sur ½ Sabouraud (primo et repiquage)

Reconnaissance facile
Blastospores ovoïdes et allongées
Absence de filaments mycéliens
Qq souches : Pseudomycélium rudimentaire
Pas fermentation des sucres
 Identification de Rhodotorula:
En culture sur Sabouraud:

Macro: Colonies crémeuses, lisses ou plissées,

Rose à rouge saumon (rouge corail)

Micro: Levures ovoïdes ou allongées de 2 à 10µm de long.

bourgeonnement multilatéral

Sur RAT ou PCB: Pseudofilamentation absente ou rudimentatire.

Présente une uréase

 Inositol négative (≠ Cryptococcus.sp)

Sensible à l’actidione
Caractéristiques morphologiques des principales
levures d’intérêt médical
Caractéristiques morphologiques des principales
levures d’intérêt médical
 ACTIDIONE
NB: Sensibilité à l’actidione
↓
Critère d’identification:
Certaines espèces de Candida:
C. tropicalis, ne pousse en présence
d’actidione.
Cryptococcus, Saccharomyces,
Rhodotorula et certaines espèces de
Trichosporon: ne poussent en présence
d’actidione
(SC, SAC)
SCHÉMA D'IDENTIFICATION DES LEVURES