MODE OPERATOIRE MO-MYC-004 P 1/12

Colorations et Examen microscopique Rév A

Indice de révision Nature de la modification

A Création

Sommaire

I - Objet
II - Réactifs
III - Méthodologie
IV - Lecture des lames
V - Notation des résultats
VI - Annexes
Rédigé par: Vérifié par : Approuvé
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le
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I - Objet
Ce document détaille les protocoles de coloration et d'examen microscopique des frottis colorés pour la
recherche et l'observation des mycobactéries.

II - Réactifs
Se reporter en annexes du document.

III - Méthodologie
A - Préparation des frottis
B - Fixation
C - Colorations
1 - Méthodes utilisant la fuchsine
2 - Méthodes utilisant l'auramine
3 - Méthode utilisant l'acridine orange

A - Préparation des frottis

- Graver au diamant sur la lame le N° du prélèvement correspondant.
- A partir du prélèvement (parcelle purulente si possible), faire un frottis fin sur les 2/3 de la lame (un
frottis fin permet de voir à travers les lettres noires d'une page imprimée); trop épais le frottis se décolle.
- A partir du culot de centrifugation, faire un frottis sur une surface de 1 x 2 cm.

NB : Si le frottis est fait à partir du flacon Bactec 12B, 0,1 ml de culot est ajouté à 0,1 ml de sérum de
lapin.

B - Fixation
- Laisser sécher le frottis (à l'air ou sur une plaque chauffante à température moyenne).
- Fixer à l'alcool méthylique.

C - Colorations
Plusieurs techniques sont utilisées pour colorer les mycobactéries présentes dans les prélèvements :
1 - Méthodes utilisant la fuchsine
2 - Méthodes utilisant l'auramine
3 - Méthode utilisant l'acridine orange
Remarques :
Pour toutes les colorations , le rincage à l'eau se fait sous un filet d'eau de robinet.
Le séchage entre 2 épaisseurs de papier filtre est à éviter.

1 - Méthodes utilisant la fuchsine

1.1 - Coloration de Ziehl-Neelsen à chaud

Réactifs
Fuchsine de Ziehl (RAL)
Acide nitrique au 1/5
Alcool à 95°
Bleu de méthylène
Technique
- Couvrir la lame de fuchsine phéniquée.
- Chauffer trois fois en 10 minutes jusqu'à émission de vapeurs
(le colorant ne doit pas bouillir ou se déssécher sur la lame; en ajouter si nécessaire).
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame d'acide nitrique dilué au 1/3. Laisser agir 45 secondes.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame d'alcool éthylique à 95°. Laisser agir 5 mn.
- Rincer à l'eau
- Recouvrir la lame de bleu de méthylène. Laisser agir 2 mn.
- Rincer à l'eau.
- Laisser sécher à l'air libre.

Remarques
* La coloration de Ziehl-Neelsen peut être faite à froid. Les lames sont immergées pendant au moins 3
heures dans la solution de fuchsine.
* On peut utiliser l'acide sulfurique dilué au 1/4 à la place de l'acide nitrique.
* On peut avantageusement remplacer les deux temps de la décoloration par l'utilisation d'un mélange
acide-alcool que l'on laissera agir pendant 2 minutes.
* Le réactif d'Armand qui contient l'acide, l'alcool, et le bleu de méthylène permet de réaliser en un seul
temps la décoloration et la recoloration des frottis préalablement colorés par la fuchsine.

1.2 - Coloration de Kinyoun

Réactifs
Fuchsine basique
Décolorant
Bleu de méthylène
Technique
- Couvrir la lame avec la fuchsine. Laisser 5 mn à froid sans chauffer.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame avec la solution acide alcool pendant 2 mn.
- Rincer.
- Couvrir la lame de bleu de méthylène. Laisser agir 2 mn.
- Rincer à l'eau.
- Laisser sécher à l'air.

2 - Méthode utilisant l'auramine

Coloration de Degommier
Réactifs
Acide trichloracétique 1 %
Auramine 00
Décolorant
Rouge de thiazine
Technique
- Couvrir la lame d'acide trichloracétique à 1% pendant 30 mn.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame avec la solution d'auramine pendant 15 mn.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame avec la solution décolorante pendant 2 mn.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir le frottis avec la solution de rouge thiazine pendant 1 mn 30.
- Rincer à l'eau.
- Décolorer avec la solution décolorante pendant 3 mn.
- Rincer à l'eau.
- Sécher à l'air.

3 - Méthode utilisant l'orange acridine

Réactifs
Orange acridine
Décolorant
Bleu de méthylène

Technique
- Couvrir la lame avec la solution d'acridine orange à 1% pendant 15 mn.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir la lame avec la solution de décoloration pendant 1 mn.
- Rincer à l'eau.
- Couvrir le frottis de bleu de méthylène pendant 1 mn.
- Rincer à l'eau.
- Décolorer avec la solution décolorante pendant 3 mn.
- Rincer à l'eau.
- Sécher à l'air.

IV - Lecture des lames

1 - Lecture des lames colorées à la fuschine

2 - Lecture des lames colorées à l'auramine
3 - Lecture des lames colorées à l'orange acridine

1 - Lecture des lames colorées à la fuschine

La lecture microscopique des lames colorées à la fuchsine par la méthode de Ziehl-Neelsen ou par la
méthode de Kinyoun se fait à l'immersion objectif 100 x et avec des oculaires de 10. C'est-à-dire
grossissement final de 1000.
Il faut examiner au moins 100 champs, ce qui requiert environ 15 minutes avant de déclarer une lame
négative.
Trois balayages du frottis doivent être réalisés.
Les Bacilles Acido-Alcoolo Résistants (B.A.A.R.) apparaissent rose sur fond bleu. Ils sont droits ou
légèrement incurvés de 2 à 4 µm sur 0.3 à 0.5 µm de large. Ils sont souvent granuleux et groupés en
amas.
A l'examen microscopique des frottis réalisés à partir de colonies, les bacilles peuvent apparaitre colorés
en bleu. Ces cultures sont soit trop jeunes, soit trop vieilles. Des formes coccoïdes ou filamenteuses
peuvent s'observer.
La réponse doit toujours être faite en terme de présence ou absence de B.A.A.R et non en terme de
bacilles tuberculeux, de bacilles lépreux, ou de toute autre espèce mycobactérienne.

2 - Lecture des lames colorées à l'auramine

Lire les lames au microscope à fluorescence, à l'objectif à sec métallographique 25 x pour un dépistage
rapide, et à l'objectif 40 x pour confirmation.
Il faut lire au moins 30 champs par lame avant de déclarer une lame négative.
Les mycobactéries apparaissent jaune fluorescentes sur fond rouge. Pour des cas particuliers, la
coloration de Ziehl peut se faire par sur coloration d'une lame déjà colorée à l'auramine.

3 - Lecture des lames colorées à l'orange acridine

Lire les lames au microscope à fluorescence à l'objectif 40 x. Il faut lire environ 70 champs par lame
avant de déclarer une lame négative.
Les mycobactéries présentent une fluorescence rouge à orange.

V - Notation des résultats

Nombre de BAAR Répondre

< 1 / 100 champs Négatif
1-9 / 100 champs 1 + examen suspect à
confirmer
10-99 / 100 champs 2+
1-9 / champ 3+
10-99 / champ 4+
>100 / champ 5+
Expression des résultats de l'examen microscopique selon le nombre de bacilles observés par champ
microscopique au grossissement 1000. Propositions de l'OMS.

VI - Annexes

1 - Coloration de Ziehl Nelson (à chaud)

2 - Coloration de Kinyoun modifiée (à froid)
3 - Coloration à l'auramine
4 - Coloration à l'Orange acridine

1 - Coloration de Ziehl Nelson (à chaud)

Fuschine de Ziehl (RAL)
Fuchsine basique RAL pour Bactériologie ................10 g
Phénol 55 g .......................................................................55 g
Alcool à 90° ......................................................................100 ml
Eau distillée ......................................................................1000 ml
Verser les 100 ml d'alcool dans un mortier de 2 litres. Ajouter la totalité du colorant en broyant au fur et
à mesure, puis peu à peu, l'acide phénique en triturant. Verser le mélange dans un flacon de verre teinté.
Rincer le mortier avec de l'eau distillée, plusieurs fois dans le flacon jusqu'à concurrence de 1 litre.
Laisser reposer 24 heures à l'étuve à 37°C. Filtrer sur papier.

Décolorant
Acide sulfurique...................................................................100 ml
Eau distillée........................................................................ 300 ml
Verser toujours l'acide très lentement dans l'eau.

Bleu de méthylène
Bleu de méthylène .............................................................. 1 g
Alcool à 95°...................................................................... 10 ml
Phénol................................................................................ 1 g
Eau distillée........................................................................ 100 ml
Même préparation que ci-dessus

Tous les réactifs se conservent à température ambiante pendant une longue durée.

2 - Coloration de Kinyoun modifiée (à froid)

Fuschine phéniquée de Kinyoun
Fuchsine basique RAL pour Bactériologie .................................... 4 g
Solution aqueuse de phénol à 8% .....................................................50 g
Alcool à 95 %........................................................................................ 20 ml
Dissoudre la fuschine dans les 20 ml d'alcool à 95% puis ajouter les 100 ml de la solution aqueuse de
phénol*.
*Chauffer doucement le flacon de phénol au bain-marie. Mesurer dans une éprouvette graduée ou avec
une pipette munie d'une poire, le volume nécessaire de phénol. Le mettre dans le flacon contenant le
volume d'eau nécessaire, placé également au bain-marie (l'éprouvette ou la pipette doit être mise
préalablement réchauffée par passage au bain-marie).

Décolorant
Acide chlorhydrique....................................................................... 3 ml
Alcool à 95 %................................................................................ 97 ml

Bleu de méthylène
Bleu de méthylène ......................................................................... 0,3 g
Eau distillée................................................................................... 100 ml

Tous ces réactifs se conservent à température ambiante pendant une longue durée

3 - Coloration à l'auramine
Acide trichloracétique à 1 %
Acide trichloracétique*........................................................ 10 g
Eau distillée............................................................................ 1000 ml
Dissoudre lentement l'acide dans l'eau.

Auramine
Auramine 00.......................................................................... 1 g
Phénol..................................................................................... 50 g
Chlorure de magnésium..................................................... 100 ml
Eau distillée (tiède)............................................................... qsp 1000 ml

Peser 1 g d'auramine, verser la poudre dans un ballon de 1 litre contenant 500 ml d'eau distillée, bien
mélangé,
Mettre à l'étuve pendant 24 heures.
Dissoudre 50 g de phénol dans 100 ml de la solution de chlorure de magnésium à 2 %.
Mélanger les 2 solutions. Compléter à 1000 ml avec de l'eau distillée.
Filtrer avec 2 filtres.
Conserver à l'obscurité et à + 4° pendant une durée maxima de 1 mois.
Décolorant
Alcool à 95 %...................................................................... 935 ml
Eau distillée........................................................................... 65 ml
Acide chlorhydrique pur.......................................................... 5 ml
Chlorure de sodium .................................................................5 g

Solution de rouge thiazine

Rouge de thiazine .....................................................................1 g
Chlorure de magnésium à 2 % ..................................................100 ml
Phénol .....................................................................................50 g
Eau distillée qsp. ......................................................................1000 ml
Mode de préparation identique à celui de l'auramine.

4 - Coloration à l'Orange acridine

Colorant orange acridine
Mesurer dans l'ordre et mettre dans un erlen de 6 litres :
Glycérol .....................................................................................1250 ml
Ethanol .......................................................................................1235 ml
Eau distillée .................................................................................2500 ml

Ajouter ensuite 250 g de phénol.*

Reprendre un flacon d'orange acridine (5 g) dans 20 ml d'éthanol et verser la solution ainsi préparée
dans l'erlen (pour une meilleure dissolution et récupération de la poudre orange acridine, il est
préférable de reprendre le flacon avec 5 ml d'éthanol à chaque fois, et de renouveler l'opération 4 fois de
suite).
Transférer un barreau magnétique dans l'erlen. Boucher l'erlen avec du film recouvrant, entourer l'erlen
de papier aluminium et mettre en route l'agitation pendant une nuit.
Filtrer le lendemain et conserver en flacons opaques.

Décolorant
Ethanol ................................................................................. 3700 ml
Eau distillée ........................................................................... 1300 ml

Mesurer et rajouter à la solution précédente :

Acide chlorhydrique à 35 % ...............................................25 ml
Contre colorant .......................................................................25 ml

Bleu de méthylène
Eau distillée .............................................................................1300 ml
Bleu de méthylène .................................................................10 g
Ethanol à 95°........................................................................... 3700 ml
Transférer un barreau magnétique dans l'erlen. Boucher l'erlen avec du film recouvrant, mettre en route
l'agitation pendant une nuit.

Remarques
*Le phénol, l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, et l'acide trichloracétique sont des produits
"corrosifs".
L'auramine et l'orange acidine étant des produits toxiques par inhalation et par contact, pour peser la
poudre d'auramine ou d'orange acridine, le manipulateur doit porter des gants et un masque à haute
filtration. Cette manipulation devrait se faire sous hotte à charbon actif.
L'évacuation des colorants doit s'effectuer selon une procédure particulière
Si les lames sont colorées dans des bacs, changer régulièrement les solutions (toutes les semaines) ou
plus selon le n
Coloration de Gram
Auteur: BIOLTROP
Editeur: Fondation Mérieux
Langue: Anglais, Français
Posté: 01/02/2012
Thème: Techniques bactériologiques
Principe
Par la coloration différentielle de Gram, les bactéries Gram positif (Gram+) sont colorées en violet, les
bactéries Gram négatif (Gram-) sont colorées en rose, ceci étant du à une différence de composition de
la paroi. Effectué à partir d'un frottis ou un étalement.
Matériel
Lames
Colorants
Mode opératoire
Lorsque l'on colore peu de lames, plutôt que d'immerger les préparations, on peut les recouvrir de
colorants. Les colorants doivent être changés chaque jour.
Risques d'erreurs
Faux Gram (+) :
Réaliser un frottis ou un étalement.
Fixer la préparation à la flamme sans dépasser 50 - 60° (brièvement supportable à la main), ce qui les
sèche puis laisser refroidir la lame.
Immerger (ou inonder) les lames dans la solution de Cristal Violet pendant 1mm.
Lavage à l'eau en transvasant les lames ou sous le robinet.
Immerger (ou inonder) les lames dans du Lugol pendant 1 mn en les agitant.
Laver à nouveau à l'eau.
Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte à goutte sur la
lame inclinée ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes dans le décolorant.
Laver à l'eau.
Contre colorer avec la solution de safranine diluée ou de fuchsine diluée pendant 20 à 30 secondes.
Laver à l'eau et sécher à l'air ou en chauffant vers 50°. Les lames doivent être parfaitement sèches.
Observer à l'objectif x 100, en immersion avec de l'huile à immersion.
Étalement trop épais (mauvais décoloration) : examinez dans une zone ou l'etalement esr mince.
Dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour y remédier.
Solution iodée de Gram mal égouttée.
Décolorant laissé trop peu de temps (globalement, mieux vaut trop que pas assez).
Solution de fushine laissée très longtemps (plus d'une minute).
Avidité de certaines bactéries (Neisseria et Acinetobacter en particulier) pour la fuchsine donnant un
rouge très foncé, difficile à distinguer d'un violet.
Faux Gram (-) :
Solution iodée de Gram laissée trop peu de temps.
Décolorant laissé trop longtemps et mal rincé
Préparation des réactifs
Violet de gentiane – adaptation de Hucker
Solution A :
Violet de gentiane 2g
Alcool à 95° 20ml
Solution B :
Oxalate d'ammonium : 0,8g
Eau distillée 80ml
Mélanger les solutions A et B, Laisser reposer 24 heures avant l'emploi, Verser à travers un papier filtre
dans un flacon.
Solution iodée de gram
Iode 1g
Iodure de potassium 2g
Eau distillée 300ml
Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dans environ 30 ml d'eau distillée, ajouter l'iode et mélanger
jusqu'à dissolution.
Ajouter le reste d'eau distillée, mélanger.
Conserver dans un flacon en verre brun ou en plastique opaque (à l'abri de la lumière).
Solution de safranine (préférer la safranine à la fuchsine)
Solution A :
Safranine O 2,5g
Alcool à 95° qsp 100ml
Solution A bis :
Solution A 10ml
Eau distillée 90ml
Décolorant
Mélanger à parties égale alcool à 95 ° et acétone (on peut utiliser seulement de l'alcool mais la
décoloration est plus longue : faire des essais).
Contrôle de qualité
Il est fortement conseillé de pratiquer régulièrement un contrôle de qualité de la coloration car sa qualité
est très dépendante de la qualité et de la composition des réactifs ainsi que de l’expérience de
l'opérateur, notamment à cause de l’étape de décoloration qui doit être appréciée « à l’œil ».
On peut ainsi préparer une série de lames de témoin Gram (-) riches en entérobactéries (gram d'une
CBU riche en Escherichia coli) et une autre série de lames de témoin Gram (+) riches en
Staphylococcus aureus (à partir d’une plaie ou autre).
OLORATIONS EN MICROBIOLOGIE
HISTORIQUE
Mises au point au 19e siècle. Durant le dernier siècle, l’utilisation des colorations a vraiment aidé au
développement technologique tant et si bien que maintenant, la coloration bactérienne est une technique de base
dans l’identification bactérienne.
2
COLORATIONS EN MICROBIOLOGIE
Les colorants existent sous forme de?
Préparation aqueuse ou organique
3
COLORATIONS EN MICROBIOLOGIE
Ils peuvent être utilisés pour :
Colorer du matériel biologique
Comme indicateur de pH dans les milieux de culture
Comme inhibiteur dans les milieux de culture(gram-/+Crystal violet)
Comme indicateur d’oxydoréduction
4
PRINCIPES DE LA COLORATION
Tous les colorants ont au moins deux propriétés en commun?
Présence de groupes chromophores.
Posséder un groupe auxochrome
5
PRINCIPES DE LA COLORATION
Ils sont colorés grâce à la présence de groupes chromophores
Qui ont pour origine la molécule de benzène ou une quinone. Ils peuvent se lier aux cellules par interaction
ionique, covalente ou hydrophobe.
6
PRINCIPES DE LA COLORATION
Les groupes de colorants qui nous intéressent sont ionisables et ils sont
divisés en deux groupes :
Les colorants basiques ou cationiques et les colorants acides ou anioniques.
7
PRINCIPES DE LA COLORATION
un groupe auxochrome
Qui est un radical ionisant attaché à la partie du colorant possédant le chromophore. Ces radicaux possèdent des
charges. Ils sont soit cationiques (NH2) ou anioniques (COOH-, OH-, SO3 H-). Il permettra au colorant de
s’attacher au tissu ou à la cellule.
8
PRINCIPES DE LA COLORATION
Le tissu ou le micro-organisme basophile (charge négative, anionique,
acide) se colore par
Des colorants possédant une charge positive donc : basiques, cationiques.
ex: La surface des cellules bactériennes, l’ADN, l’ARN, le mucus, le cartilage, les acides nucléiques, les protéines
et la chromatine sont: basophile anionique, de charge négative, acide
9
PRINCIPES DE LA COLORATION
Le tissu ou la cellule acidophile (charge positive, cationique, basique)
se colore par
Des colorants possédant une charge négative donc : acide, anionique.
ex: Le collagène, les érythrocytes, les éosinophiles, les mucosubstances carboxyles et sulfatés sont : acidophiles,
cationiques, de charge positive, basique.
10
Les colorants basiques utilisés en microbiologie, ils sont généralement
vendus sous forme de chlorures :
bleu de méthylène
fuchsine basique
cristal violet
safranine
vert de malachite
carbolfuschine
11
Les colorants acides:
fuchsine acide
éosine
rose Bengale
12
ÉTAPES D’UNE COLORATION
On reconnaît deux types de fixation :
la fixation par la chaleur
la fixation chimique
13
LA FIXATION PAR LA CHALEUR
Il s’agit de chauffer doucement un film bactérien séché à l’air. Ce procédé permet de conserver correctement la
morphologie générale, mais pas les structures intracellulaires.
14
LA FIXATION CHIMIQUE
On utilise ce procédé pour protéger les structures cellulaires fines et la morphologie de microorganismes plus
grands et plus délicats.

Ces fixateurs pénètrent dans les cellules et réagissent avec les composantes cellulaires, le plus souvent des
protéines et des lipides afin de les rendre inactifs, insolubles et immobiles.
15
Les mélanges de fixateurs utilisés le plus souvent sont?
Fixateurs chimiques?
le méthanol
l’éthanol
l’acide acétique
le chlorure mercurique
le formaldéhyde
le glutaraldéhyde.
16
Ne sont pas des colorations différentielles.
Les colorations de spores, de flagelles, la coloration pour la mise en évidence des capsules.
17
La coloration à l’encre de Chine est?
Une coloration négative des bactéries puisque ce n’est pas la bactérie qui est colorée, mais les éléments qui
l’entourent.
18
LA COLORATION DE GRAM
Les techniques de coloration différentielle divisent les bactéries en groupes distincts basés sur les propriétés de
coloration. La coloration de Gram a été mise au point par Hans Christian Gram, il y a un peu plus de 100 ans.
19
UTILITÉ DE LA COLORATION DE GRAM
Permet aussi de sélectionner les milieux de culture appropriés pour la croissance et l’identification de la bactérie
soupçonnée. Elle est donc une coloration de routine. Fournir une identification provisoire des micro-organismes
contenus dans un échantillon en déterminant:

la taille des bactéries

la forme des bactéries
l’arrangement bactérien
20
PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM
Coloration différentielle basée sur les propriétés de la paroi cellulaire des bactéries.
21
PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM
Pour les Gram positifs:
Le peptidoglycane agit avec les acides téichoïques comme barrière de perméabilité en empêchant la perte de violet
de cristal chez les bactéries. L'alcool réduit la dimension des pores du peptidoglycane. Le complexe colorant-iode
est maintenu pendant la décoloration. Ce même complexe masque l'action de la safranine et les bactéries
demeurent bleu violet.
22
PRINCIPE DE LA COLORATION DE GRAM
Pour les Gram négatifs:
La paroi cellulaire des Gram négatifs est très poreuse puisqu'elle contient de nombreux lipides. Durant la
coloration, le traitement à l'alcool acide extrait assez de lipides de la paroi cellulaire pour en augmenter la porosité
et en éliminer plus facilement le violet de cristal combiné à l'iode. Le complexe violet de cristal-lugol est remplacé
par la safranine. Les bactéries seront colorées en rose ou rouge.
23
Gram positif
Couche épaisse de peptidoglycane (90% de tous les constituants de la paroi Gram+)

lipides (inférieur à 4%)

acides teichoïques
polyosides
protéine M
acide poly glutamique
24
Gram négatif
Portion élevée de lipides (11 à 22%)
Trois couches de composition chimique différente:

couche mince de peptidoglycane

lipopolysaccharides
lipoprotéines
25
Principe de la coloration de Gram (paroi d’une bactérie Gram positif)
Peptidoglycane agit avec les acides téichoïque comme barrière de perméabilité en empêchant la perte de violet de
cristal
l’éthanol réduit la dimension des pores du peptidoglycane. Le complexe colorant-iode est maintenu pendant la
décoloration
Le complexe violet de cristal-lugol masque l ’action de la safranine
Les bactéries demeurent bleu-violet
26
Les types de colorations:
LA COLORATION DE GRAM
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN
AURAMINE-RHODAMINE
KINYOUN MODIFIÉ
COLORATION DE SPORES
COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN
COLORATION DE FLAGELLES
COLORATION À L’ENCRE DE CHINE
COLORATION MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
COLORATION D’ERNST-NEISSER
COLORATION D’ALBERT
COLORATION DE LOEFFLER
ORANGE D’ACRIDINE
CALCOFLUOR
FUNGI-FLUOR
COLORATION DE GRAM À ÊTRE RECOLORÉE PAR CALCOFLUOR OU PAR FUNGI-FLUOR
27
ÉTAPES DE LA COLORATION DE GRAM
Eau Courant
Contrôle positif: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Contrôle négatif : Escherichia coli ATCC 25922
1. Cristal violet (1min)
2. L'iode ou Lugol (1min)
3. Alcool acide, l'éthanol, de l'acétone ou l'alcool éthylique 95% (5 à 10 sec)
4.Safranine ou fuschine basique (1min)
28
Cause d'une mauvaise coloration de Gram?
pH du colorant
utilisation de colorants périmés
dépôt de colorant dû à une mauvaise filtration
temps de contact inadéquat des colorants
temps de décoloration inadéquat
Les antibiotiques peuvent affecter la coloration de Gram.
Il est très important de toujours fixer le matériel sur la lame avant de débuter toute coloration.
Cette étape prévient que le spécimen ne décolle de la lame lors du processus de la coloration.
29
COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN
Principe
(MISE EN ÉVIDENCE DES MYCOBACTÉRIES)
Bacille de Koch TB
Les mycobactéries sont recouvertes d’une couche épaisse de cire qui résiste aux colorants. Une fois colorée, la
cellule de la mycobactérie résiste à la décoloration par des solvants organiques forts comme l’alcool acide. Les
bactéries démontrant de telles propriétés sont connues sous le nom de bacilles alcoolo acido-résistants (« acid fast
bacilli » en anglais). Ce phénomène a été découvert en 1881 par Ziehl et Nelson, d’où le nom de la coloration.
30
ÉTAPE DE COLORATION DE ZIEHL-NEELSEN
Eau distillée
(MISE EN ÉVIDENCE DES MYCOBACTÉRIES)
Bacille de Koch TB
1. Carbol fuschine chauffée à émission de vapeur (3min)
2. Alcool-acide 3% (2-3min)
3. Bleu méthylène ou au vert de malachite (2-3min)
31
AURAMINE-RHODAMINE
Principe
Utilisé avec le bon filtre
Coloration fluorescente pour TB
L’auramine O et la rhodamine B sont liés à l’acide mucolique retrouvée dans la paroi cellulaire des mycobactéries.
Le colorant non lié est enlevé par la solution de décoloration.
Le permanganate de potassium agit comme contre-colorant supprimant la fluorescence non spécifique.
32
ÉTAPE AURAMINE-RHODAMINE
Eau distillée 40X
Contrôle négatif: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Contrôle positif: Mycobactérium tuberculosis H3+Ra
1. Auramine-Rhodamine ne pas chauffer (15min)
2. Différencier (2min)
3. Contre colorer au permanganate de potassium (2min)
Sécher lame a noirceur/perte de fluorescence à la clarté

N.B.: Essuyer l'huile sur l'objectif entre chaque lame afin d'éviter le transfert de bactérie alcoolo acido-résistante
d'une lame à l'autre.
33
KINYOUN MODIFIÉ
Principe
Les Nocardia, Rhodococcus et certains Actinomyces possèdent de l'acide mucolique intermédiaire dans leur paroi
cellulaire.
La coloration de Kinyoun modifiée met en évidence une acido-résistance plus ou moins complète de ces germes.
Cette acido-résistance s'accroît en cultivant ces germes dans des milieux riches en lipides (ex.: Lowenstein, lait).
34
ÉTAPE KINYOUN MODIFIÉ
Eau courante 1000X
Fixer la lame à la chaleur
1. Kinyoun carbolfuschine ne pas chauffer (5min)
2. Éthanol 50%
3. Acide sulfurique 1% (1-2min)
4. Contre color bleu méthylène (1min)
35
COLORATION DE SPORES
3 méthodes pour la coloration des spores?
Méthode de Schaeffer-Fulton (vert de malachite et fuchsine)
Méthode de Dorner (fuchsine et nigrosine)
Méthode de Wirtz-Conklin
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COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN
Principe
L’enveloppe des endospores des bactéries est imperméable à la plupart des colorants usuels. Ce phénomène est dû
à leur composition chimique. Les bactéries sporulantes colorées au Gram, montreront un espace clair non coloré à
la place de l’endospore. Les techniques de coloration des spores ont toutes le même principe qui est de favoriser
par chauffage, l’entrée des colorants à travers l’enveloppe de la spore. Le refroidissement de la membrane
empêche le colorant de s'échapper de la spore. Le reste de la bactérie est ensuite contre colorée.
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ÉTAPE COLORATION DE WIRTZ-CONKLIN
Eau courante
Résultats : Bacilles : rouges
Spores : vertes
1. Vert de malachite à 5% (3-6min ou 30min sans chauffage)
2. 0.5% safranine (30sec)
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COLORATION DE FLAGELLES
Principe
Méthode de Leifson
Méthode de Rhode
Attention préparation du solution de colorant, ne pas prendre solution
réfrigérer avec précipité. Ne pas re-mélanger
Les flagelles ne peuvent être mis en évidence de façon précise à l’état frais ou par toute autre technique de
coloration habituelle. La coloration de flagelle permet une imprégnation par l’acide tannique laissant voir les
flagelles après être colorées à l’acide tannique. C'est une coloration qui demande beaucoup de minutie.

Ne pas shaker, mais tourner pour sécher

On laisse la goutte du spécimen tomber lentement par gravité avec une petite angle. Assurer le trajet droit
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COLORATION À L’ENCRE DE CHINE
Il s’agit donc d’une coloration négative puisque l’encre de Chine ne colore pas la bactérie, mais les éléments qu’il
y a autour. La coloration à l’encre de Chine permet d’observer au microscope la présence de capsule chez la
bactérie.
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COLORATION À L’ENCRE DE CHINE
Les bactéries qu’elles entour sont dites encapsulées et considérées
comme virulentes. On observe une capsule chez certaines bactéries
provenant de spécimens cliniques. Parmi ces bactéries on compte?
le Streptococcus pneumoniae
le Klebsiella pneumoniae
le Cryptococcus neoformans

Pour le Cryptococcus neoformans, il s’agit d’un critère d’identification important. La coloration à l’encre
de Chine d’un spécimen de liquide céphalo-rachidien permet d’identifier avec confiance le Cryptococcus
neoformans chez un patient immunodéprimé.
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COLORATION MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
(FROTTIS SANGUINS, PARASITES)
PRINCIPE

Triton X-100
En hématologie pour l'identification des cellules sanguines. C'est aussi la coloration la plus sûre pour identifier les
parasites sanguins, en particulier pour les frottis minces. Il est très important que le pH de la solution colorante se
situe entre 7,0 et 7,2; qu'un contrôle de qualité soit utilisé pour la coloration. La coloration de Giemsa est une
coloration oxydative. L'oxygène contenu dans l'eau initie la réaction et par conséquent, après une journée, notre
solution de coloration doit être changée.
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POUR LES GRANULATIONS MÉTACHROMATIQUES OU
CORPS DE BABES DE CERTAINES ESPÈCES DE
CORYNEBACTERIUM
3 Colorations?
COLORATION D’ERNST-NEISSER
COLORATION D’ALBERT
COLORATION DE LOEFFLER
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ÉTAPË COLORATION D’ERNST-NEISSER
Les granulations forment une combinaison stable avec le bleu acétique
sous l’effet de la chaleur.
1. Fixer la lame à la chaleur
2. Recouvrir la lame de bleu acétique 10 minutes
3. Laver à l’eau courante
4. Recouvrir de vésuvine 1 minute
5. Laver à l’eau, sécher et observer à l’immersion

Les bacilles apparaissent en brun pâle, les granulations métachromatiques se détachent en bleu foncé.
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ÉTAPE COLORATION D’ALBERT
Les granulations métachromatiques du Corynebacterium diphteriae
sont colorées facilement par le bleu de méthylène et apparaissent en
bleu foncé.
1.Recouvrir la lame de la Solution 1 pour 5 minutes
2.Égoutter la lame sans la rincer
3.Recouvrir la lame de la Solution2 pour 1 minute
4.Rincer à l'eau courante, sécher+observer à l’immersion

Les granulations métachromatiques se colorent en noir, les bacilles en vert pâle.

Dans certaines espèces de Corynebacterium, les stries sont colorées du vert foncé au noir.
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ÉTAPE COLORATION DE LOEFFLER
Les granulations métachromatiques du Corynebacterium diphteriae
sont colorées facilement par le bleu de méthylène et apparaissent en
bleu foncé.
1. Fixer le frottis à la chaleur
2. Recouvrir la lame de bleu de méthylène à 80%
3. Rincer à l’eau courante et laisser sécher

Résultats : Granulations bleu foncé

Note : Certaines bactéries comme les Actinomycetes, certaines espèces de streptocoques et d’autres bactéries
peuvent morphologiquement ressembler aux Corynebacteries et doivent être différenciées par des cultures et des
tests biochimiques.
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ORANGE D’ACRIDINE
Cette méthode de coloration est principalement utilisée aux
hémocultures lorsque l’appareil nous signale une bouteille positive et
que le Gram ne démontre aucune bactérie. Il s’agit d’une coloration
fluorescente qui pourrait aussi être utilisée pour observer des
Trichomonas vaginalis.
1.Laisser sécher la lame à l’air
2.Placer la lame sur un support à coloration
3.Fixer la lame au méthanol 50-100% (1-2min)
4.Laisser sécher la lame à l’air après vous être débarrassé de l’excédent de fixatif
5.Ajouter l’orange d’acridine sur la lame 2 minutes
6.Rincer à l’eau courante et permettre de sécher avant d’observer
7.le spécimen au microscope à fluorescence.
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CALCOFLUOR
(cherche la présence des hyphes/long chemin)
En mycologie pour l'observation directe des spécimens clinique. Il s'agit d'une coloration non spécifique au
fluorochrome, pour la détection rapide des éléments fongiques. Les éléments fongiques apparaîtront vert pomme
brillant fluorescent. Les débris ou le tissu peut apparaître jaune vert brillant. La morphologie des cellules
tissulaires et des éléments fongiques vont aider à les distinguer les uns des autres.
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CALCOFLUOR
(cherche la présence des hyphes/long chemin)

Squames, cheveux, ongles**

Tissus autres que pulmonaires
Liquides biologiques (autre que respiratoire)
1.Une goutte de KOH 10% sur une lame propre
2.ajouter une petite portion de spécimen et émulsifier dans le KOH 10% (le matériel dur et solide peut prendre
plus de temps à se dissoudre)
3.Une goutte de réactif "calcofluor white" et mélanger
4.Disposer une lamelle no.1 sur la préparation et appuyer délicatement
5.Sous le microscope UV avec le filtre G (filtre #3)
6.toujours faire un contrôle de qualité à chaque utilisation

Contrôle positif: Suspension de Candida albicans dans une goutte d'eau distillée +une goutte de calcofluor white
Contrôle négatif:goutte de (KOH 10% + calcofluor white)
Présence ou absence d'hyphes (MCFP, MCFN)
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FUNGI-FLUOR
Cherche des hyphes et levures de champignon. Rare positif.
RT Normalement infection pulmonaire
En mycologie pour l'observation directe des spécimens clinique provenant du système respiratoire. Les chaines
polysaccharides B présentes dans la cellulose et la chitine retrouvée dans les parois de la cellule fongique sont
colorés par le colorant fluorescent et fungi-fluor. Lorsqu’examinés au microscope à fluorescence, les éléments
fongiques seront.
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ÉTAPE FUNGI-FLUOR
1.Laisser sécher les lames à l'air
2.fixer la lame avec du méthanol absolu pendant 5 minutes, ou jusqu'à évaporation complète du méthanol
3.ajouter une goutte de Fungi-Fluor, attendre une minute
4.rincer délicatement avec de l'eau distillée
5.mettre le contre-colorant solution B
6.rincer délicatement à l'eau
7.mettre une lamelle sur la lame mouillée et examiner au microscope à fluorescence avec le filtre "G". S'il y a un
délai entre le montage de la lame et la lecture de celle-ci, ajouter de l'eau sous la lamelle avant de lire la lame.
8. Utiliser l'objectif 20x ou 40x.

Contrôle positif: Lame de Candida albicans

Périodiquement, une lame contenant du Pneumocystis carinii et une lame contenant des hyphes devrait être incluse
lors de la coloration.

Résultat: Le matériel fongique apparaitra comme une coloration périphérique avec une morphologie
caractéristique