Les milieux de cultures

en bactériologie
Préparée par : Cherni Islem
Terrain de stage : CHU Fattouma
bourguiba-Monastir
Définition :
Un milieu de culture est une préparation au sein de laquelle des micro-
organismes peuvent se multiplier .Il est  indispensables pour multiplication
bactérienne, ce qui permet par la suite l’identification ainsi que l’étude de 
la sensibilité aux antibiotiques lorsque la bactérie est isolée en culture pure.
Ce milieu contient les élément strictement nécessaires à la croissance d’un
microorganisme .
Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-organisme
étudié et posséder les propriétés physico-chimiques convenant à cette
culture:
*Couvrir les besoins en ions minéraux, en facteurs de croissance, apporter la
source de carbone, d’énergie et d’azote.
*Présenter un pH voisin au pH optimal, une pression osmotique et une
viscosité adéquate.
Classification des milieux de
culture selon leur mode
d’utilisation
1. Milieu de culture simple
• Les milieux de cultures simple, base, sont ceux qui
peuvent être utilisés pour la culture de bactéries
non exigeantes. Généralement utilisé dans le
diagnostic de routine en laboratoire pour
l'isolement primaire des bactéries. Ce type de
milieu peut être rendu plus riche, par l'ajout de
suppléments, ou sélective, par l'ajout de
concentrations variables de chlorure de sodium.
Exemple: Bouillon nutritif, gélose nutritive et eau
peptonée
 Gélose nutritive
*la gélose nutritive apporte les éléments nutritifs
nécessaires à la croissance d'une large gamme de
micro-organismes, elle est utilisée pour la culture
de bactéries et pour le dénombrement des
organismes dans l’eau, les eaux usées, les urines,
les matières fécales et d’autres matériaux.
*Ne permet pas se sélectionner une souche
bactérienne précise .
*Réalisation des différents test enzymatique sans
donner de faux résultats .
2. Milieu de culture enrichi
– Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des
bactéries dites « exigeantes » en y ajoutant de
suppléments sous forme de sang, de sérum, de
jaune d'œuf, etc.
Exemple: Gélose au sang frais, gélose au sang cuit.
 Gélose Columbia
La gélose Columbia est un milieu très nutritif
permettant la culture et l’isolement d’une
grande variété de microorganismes et plus
particulièrement des germes très exigeants
(tels que streptocoques et pneumocoques).
Par addition de sang, d’agents sélectifs ou
d’accélérateurs de croissance, il est possible
de préparer une grande diversité de milieux
adaptés à des utilisations spécifiques.
Atmosphère d’incubation
• Certains germes, pour lesquels la gélose au sang est
préconisée, cultivent mieux en atmosphère enrichie
en CO2. C’est le cas tout particulièrement des
streptocoques. C’est pourquoi, il est d’usage de les
incuber en atmosphère enrichie en CO2.
Étude du caractère hémolytique
• Cette étude repose sur l’aspect du milieu autour des colonies. Cet
aspect dépend de 2 phénomènes :
• la lyse des hématies par les toxines bactériennes
Le milieu devient plus ou moins tranparent.
– transparence totale dans le cas d’une hémolyse complète
– léger trouble dans le cas d’une hémolyse partielle

• la digestion plus ou moins complète de l’hémoglobine libérée

La couleur du milieu dépendra du niveau de digestion de
l’hémoglobine.
– il retrouve la couleur d’origine de la base nutritive (jaune clair) quand la
digestion est complète
– il présente une coloration verdâtre lorsque la digestion de l’hémoglobine
est incomplète.
•  
Schématiquement, on décrit 2 types d’hémolyse : l’hémolyse α et l’hémolyse β
• L’hémolyse α est une hémolyse partielle avec une dégradation incomplète de
l’hémoglobine. Le milieu autour de la colonie n’est pas transparent et présente une
couleur verdâtre. Cette zone d’hémolyse  est généralement étroite et à bords flous
• L’hémolyse β est une hémolyse totale avec une digestion complète de
l’hémoglobine. Le milieu autour de la colonie est transparent et présente la
couleur de la base nutritive (jaune clair) . Cette zone d’hémolyse est assez souvent
large et à bords nets.
 Gélose chocolat enrichie
La gélose chocolat enrichie est un milieu d’isolement non sélectif, utilisé pour
la culture de bactéries exigeantes comme
les Neisseria, Haemophilus et Streptococcus pneumoniae. Elle est tout
particulièrement adaptée pour l’analyse des sécrétions
bronchopulmonaires, des prélèvements ORL, 
des liquides céphalorachidiens, des hémocultures.
Pour convenir à la culture des bactéries exigeantes, un supplément
polyvitaminique est introduit au cours de sa préparation.
• l’hémoglobine apporte le facteur X (hémine) et le polyvitex apporte le
facteur V (NAD) nécessaires, tous les deux, à la culture d’Haemophilus
influenzae.
• Certaines bactéries exigeantes cultivées sur ce milieu exigent une
atmosphère enrichie en CO2, les cultures sur ce milieu sont donc
systématiquement incubées en atmosphère enrichie en CO2.
 4.Milieu de culture différentiel :

Le milieu différentiel: permet la différenciation de

clones en milieu solide .
La différenciation:  Les milieux différentiels permettent de
distinguer un type de micro-organisme d'un autre se
développant sur le même milieu. ils contiennent des composés
qui permettent de distinguer visuellement des groupes de
micro-organismes par l'apparence de la colonie ou du milieu
environnant,
3.Milieu de culture sélectif
Favorise la croissance de certains micro-organismes grâce à une
pression résultant de sa composition
• La sélectivité : Les milieux de culture peuvent contenir des
composants sélectifs qui inhibent la croissance de micro-
organismes non ciblés. Ces milieux sont particulièrement
utilisés pour l'isolement de micro-organismes spécifiques à
partir de populations mixtes.
Plusieurs techniques sont utilisées pour rendre le milieux sélective
:
• En ajoutant un composant toxique : sels biliaires, le sélénite, des
concentrations élevées de chlorure.
• En ajoutant d'antibiotiques : le cycloheximide, la gentamicine,
l'acide nalidixique, la vancomycine.
• En utilisant une seule source d’énergie.
 Milieu Chepman
• La gélose Chapman ou gélose au sel de mannitol est un
milieu sélectif utilisé pour l'isolement, le
dénombrement et la différenciation des Staphylococcus
 à partir d'échantillons cliniques, alimentaires,
antiseptiques et cosmétiques.
• Ce milieu est à la fois
une gélose sélective et différentielle. Le milieu
sélectionnera des organismes qui peuvent vivre dans
des zones à forte concentration en sel (chlorure de
sodium) et la fermentation du mannitol, mise en
évidence par le virage au jaune de l’indicateur pH
(rouge de phénol), permet d’orienter le diagnostic.
◈ La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence
de chlorures de sodium (7.5%) qui inhibe la plupart des
bactéries à Gram négatif et à Gram positif.
◈ La différenciation est basée sur la capacité à fermenter ou
non le mannitol (le seul sucre du milieu). S'il y a
fermentation, cela induit une acidification qui entraîne, à
des niveaux de PH inférieurs à 6.9, une coloration jaune du
milieu en présence de rouge de phénol (indicateur de PH).
 Observation Interprétation Conclusion

Colonies Virage de l’indicateur de pH Utilisation du mannitol pae

Jaunes à sa teinte acide du à la les bactéris .
production de composés Elles sont dites manitol +
acides par des bactéries

Colonies rouges Absence de virage de Absence d’utilisation du

l’indicateur de pH mannitol par les bactéries.
Elles sont dites mannitol-
 Exemple de milieu sélectif : Milieu cétrimide
• Gélose Cetrimide, ou gélose pseudomonas
 Cetrimide, est un milieu sélectif et différentiel
utilisé pour l'isolement et l'identification de
Pseudomonas aeruginosa à partir d'eau et
d'échantillons cliniques.
• Le cétrimide est un composé d'ammonium
quaternaire ayant une activité bactéricide
contre un large éventail d'organismes Gram-
positifs et certains organismes Gram-négatifs,
y compris des espèces de pseudomonas autres
que Pseudomonas aeruginosa .
Gélose Drigalski: Isolement sélectif des Entérobactéries

• La gélose Drigalski est un milieu d’isolement

lactosé, sélectif des bacilles à Gram négatif
non exigeants.
• Le désoxycholate de sodium et le cristal violet
inhibe la croissance des bactéries à Gram
positif.
• Comme la base nutritive est ordinaire, seule
les bactéries non exigeantes y cultivent. Les
coques à Gram négatifs ont des exigences
nutritives qui ne leur permettent pas de
cultiver sur ce milieu. Ainsi ce milieu est
sélectif des bacilles à Gram négatif non
exigeants.
• La présence de lactose et de bleu de
bromothymol permet de connaitre le
caractère lactose des bactéries.
 Observation Interprétation Conclusion

Absence de virage de Les bactéries n’utilisent

l’indicateur de pH pas le lactose
Pas de production des
composés acides par les ELLES sont dites
bactéries « LACTOSE- »

Observation Interprétation Conclusion

Virage de l’indicateur de Les bactéries utilisent le

pH à sa teinte acide du à lactose
la production de
composés acides par les Elles sont dites
bactéries « LACTOSE+ »
 Gélose SS
La gélose Salmonella-Shigella ou gélose SS est un milieu sélectif et différentiel pour
l'isolement des bacilles entériques pathogènes, en particulier Salmonella et Shigella, à partir
de selles, d'aliments et de matériel clinique.
Principe de la gélose Salmonella-Shigella (SS)
◈ Sélectivité : La sélectivité de ce milieu repose sur la présence
de vert brillant, citrate de sodium et de sels biliaires qui inhibent
totalement la croissance des bactéries Gram positives et inhibent
partiellement la croissance des Enterobacteriaceae et Proteus.
◈ Différenciation : La différenciation, dans le milieu SS, des
organismes entériques est réalisée par :
*L'incorporation de lactose dans le milieu. Les organismes qui
fermentent le lactose produisent de l'acide qui, en présence de
l'indicateur rouge neutre, entraîne la formation de colonies rouges.
Les non-fermenteurs de lactose forment des colonies incolores
*Une différenciation supplémentaire reposant sur la production
d’hydrogène sulfuré (H2S) est possible grâce à la présence de
thiosulfate de sodium et de citrate de fer. Elle se traduit par des
colonies noir ou à centre noir.
 Gélose Hektoen 
• La gélose Hektoen est un milieu différentiel modérément sélectif servant à
l’isolement et à la culture de microorganismes entériques à Gram négatif,
en particulier à l’isolement des espèces Shigella et Salmonella issues
d’échantillons fécaux (flore mixte) .
Principe :

•La gélose Hektoen est un milieu sélectif et différentiel pour

l'isolement et la différenciation des agents pathogènes à partir
d'échantillons cliniques.
◈ La sélectivité : La présence de sels biliaires et
de colorants inhibe la plupart des organismes à Gram positif, ce
qui permet uniquement aux bacilles à Gram négatif de se
développer sur la gélose.
•La forte concentration de sels biliaires inhibe partiellement ou
totalement la plupart de la flore coliforme non pathogène du
tractus intestinal. Étant donné que Salmonella et Shigella
peuvent tolérer ces substances inhibitrices, ils se développent
généralement plus rapidement et plus gros que les coliformes.
◈ La différenciation : La fermentation des glucides tels que le
lactose, le saccharose et la salicine est l'une des caractéristiques
différenciatrices utilisées pour identifier les coliformes. Le bleu
de bromothymol qui vire au jaune en présence d’acide et la
fuchsine qui se colore en rouge en présence d’aldéhyde .
• Une différenciation supplémentaire reposant
sur la production d’hydrogène sulfuré est
possible grâce à la présence de thiosulfate de
sodium et de citrate de fer. Elle se traduit par
des colonies noir ou à centre noir, coloration
due à la formation de sulfure de fer .
5. Milieu de transport
Ces milieux sont utilisés lorsque les spécimens ne peuvent pas
être cultivés peu de temps après le prélèvement. Les milieux
de transport empêchent le dessèchement de l'échantillon et
inhibent la prolifération de bactéries indésirables.
Exemple: Gélose Cary-Blair, écouvillons de transport gélosés
amiès.
6. Milieu anaérobie
• Les bactéries anaérobies ont besoin d'un potentiel d'oxydo-
réduction réduit et de nutriments supplémentaires. De tels
milieux peuvent être réduits par des moyens physiques ou
chimiques.
Exemple: La gélose anaérobie Schaedler, gélose Wilkins-
Chalgren.
Classification des milieux
de culture selon leur
nature physique
1.Milieu de culture liquide:
Les constituants du milieu sont dilués dans l’eau (bouillon)
• L'agar n'est pas ajouté lors de la préparation du milieu, la
croissance se traduit par un trouble, un dépôt ou une voile
superficielle. La présence de plus d'un type de bactéries ne
peut pas être détectée et les cultures mixtes ne peuvent pas
être séparés.
Exemple : bouillon nutritif, bouillon trypticase soja.
2. Milieu de culture semi-solide
*Contenant 0.5-0.75 % d’agar de consistance
molle, il est utilisé pour démontrer la motilité
bactérienne.
Exemple: Milieu mannitol mobilité.
*Permet l’tude de la fermentation du mannitol,
la mobilité de la souche et la recherche de la
nitrate réductase
3. Milieu de culture solide
Milieu liquide auquel on ajouté un élément gélifiant , souvent un
polysaccaride
agar : polysaccharide gélifiant extrait d’algues rouges
Gels de silice ,utilisés pour la culture d’autotrophes
( CO2source de carbone )
Gels de gellane , polysaccharide bactérien formant des gels
thermostables ,utilisé pour la culture d’hyperthermophiles
On obtient un milieu solide en ajoutant un agent gélifiant, "l’agar-
agar" ou gélose, à un milieu liquide. Il permet l'identification
des bactéries en étudiant les caractères des colonies
(morphologie, pigmentation, l'hémolyse...) et Les cultures
mixtes peuvent être séparées.
Exemple: Gélose nutritive,
Examen cytobactériologie des
urines
 introduction
L'ECBU ou examen cytobactériologique des urines
est l’examen de biologie médicale de première
intention prescrit par le médecin en cas de suspicion
d’infection urinaire ou dans le cadre d'un contrôle de
l’efficacité d’un traitement antibiotique.
La phase
pré-analtique
La prescription
La feuille de prescription doit donc fournir les renseignements suivants :
• identification du prescripteur
• identification univoque du
patient avec sexe et date de
naissance
• nature de l’échantillon et
analyses
• date et heure du prélèvement
• identification du préleveur
Renseignements utiles à l’interprétation de
l’ECBU:

•Une fiche de renseignements doit accompagner

le prélèvement mentionnant:

 les indications de l’ECBU (les symptômes

cliniques, le contexte de prescription)

 le mode de recueil de l’urine

 le port d’une sonde urinaire

 les particularités du patient (âge, sexe, notion
d’hospitalisation actuelle ou récente, grossesse
éventuelle en précisant la date des dernières
règles)

 la présence de pathologies préexistantes

( diabète, immunodépression, anomalie de
l’appareil urinaire, infection urinaire récidivante )

 l’existence d’un traitement antibiotique ou

chimio thérapeutique récent ou en cours.
 Recueil de l’urine :
• Les échantillons doivent être collectés dans des conditions
strictement aseptiques. 
• L’urine ne doit pas être souillée par la flore commensale de
voisinage (digestive et/ou vaginale) qui colonise l’urètre et la
région périnéale ni par la flore des mains du patient.
• L’importance du recueil
• La qualité du prélèvement conditionne directement la qualité
du résultat. En effet, les préconisations suivantes sont à
respecter scrupuleusement pour éviter toute souillure
susceptible de gêner l’interprétation.
 1-Chez l’adulte (Patient non sondé):
• Après une continence d’au moins 4 heures,
Recueillir les urines en milieu de jet.
2-chez le nouveau-né, le nourrisson et le jeune enfant

Réaliser une toilette génitale minutieuse à

l’eau et au savon neutre.
Bien sécher la peau.
Le recueil des urines est réalisé à l’aide
d’une poche à prélèvement spécifique
posée après désinfection de la zone où
est placée la poche
Ne pas laisser en place plus de 30
minutes, dès la miction terminée
recueillir immédiatement les urines
Si la poche est vide au bout des 30 mn, ou
souillée par des selles, procéder à son
remplacement.
3- Patient sondé
* Ne pas déconnecter la sonde
(respect du système clos) et
utiliser systématiquement le
système de ponction.
*Commencer par réaliser une
hygiène des mains.
*Clamper le tuyau du sac
collecteur.
*Désinfecter le site de ponction
avec une compresse stérile
imbibée d’antiseptique alcoolique.
*Prélever avec aiguille et seringue stériles un échantillon
d’urine et transférer dans un flacon de recueil stérile.
*Homogénéiser le tube par 8 retournements
*Identifier et refermer hermétiquement le flacon.
*Déclamper le tuyau et réaliser une hygiène des
mains.
* Informations à noter pour le laboratoire : urines sur
sonde, heure du prélèvement, signes cliniques
d’infection (fièvre?)
 Conservation et acheminement au laboratoire:

• La bactériurie est un critère majeur pour l’interprétation de l’ECBU.

• Pour ne pas surestimer la bactériurie, il est donc indispensable d’empêcher la

multiplication des germes.

• La meilleure des solutions consiste à ensemencer immédiatement les milieux de culture

(moins de 2 heures dans le cas d’une conservation à température ambiante)

• Comme ce n’est pas toujours possible, de nombreux laboratoires utilisent actuellement

des tubes contenant un stabilisateur de la croissance bactérienne (comme l’acide
borique).

• Ils permettent de conserver les urines pendant 48 heures à température ambiante.

• Il est possible de conserver les urines à + 4 °C jusqu’à 24 heures mais les

• leucocytes risquent de s’altérer au-delà de la 12ème heure.
Phase
analytique
 Examen macroscopique
Une urine normale est jaune et limpide.
Il est indispensable d’homogénéiser les urines avant de
les observer. On note :
- la présence ou pas d’un trouble : un trouble
correspond souvent à une infection bactériennemais la
présence de nombreux cristaux peut également troubler
l’urine ;
-la couleur : une coloration rose ou rouge de l’urine
permet de suspecter une hématurie mais certains
traitements médicamenteux comme la prise de
rifampicine peuvent également colorer l’urine.
 Examen cytologique
Le diagnostic des infections urinaire demande
une cytologie quantitative pour certains
éléments comme les leucocytes.
Leucocyturie
• Une leucocyturie > 104/mL  signe une réaction
inflammatoire consécutive à une infection
urinaire.
• Dénonbrer le nombre des leucotytes présentes
• S’il y’ a des leucocytes altérées , signaler leurs
présences
Hématurie
• Une urine normale contient moins de 1 000
hématies/mL
• Une hématurie > 104/mL est anormale. Les
hématies intactes ont une forte probabilité de
provenir de la vessie ou de l’urètre. Les
hématies altérées viennent du rein.
• Cellules épithéliales
• Des cellules épithéliales peuvent être retrouvées en petite
quantité dans l’urine : elles proviennent du
renouvellement normal de l’épithélium urinaire de
surface (exfoliation)..
• En routine, sur une préparation à l’état frais de l’urine
homogénéisée, on se contente de différencier :
les cellules urothéliales ;
les cellules rénales ;
et les cellules pavimenteuses.
• Pour chaque type, il faut quantifier les
résultats : rares+/--, quelques-/+, assez nombreuses++,
nombreuses+++, très nombreuses++.
Cylindres
Les cylindres sont des éléments de grande taille
épousant la forme d’une partie des tubules
rénaux.
Cristaux
Bien que les cristaux ne soient pas des cellules,
leur recherche est abordée ici car elle se fait
en même temps que l’étude cytologique.
• Examen bactériologique
Examens microscopiques
État frais
• Numération des leucocytes et des hématies par ml d'urines
(leucocyturie et hématurie ) à l'aide d’une cellule de
Malassez .

• Recherche de la présence dune flore microbienne.

• Noter la présence de cristaux, cylindres, trichomonas,

levures, spermatozoïdes.

• Appréciation semi-quantitative des cellules épithéliales:

rares, quelques, nombreux, assez nombreux.
 Méthodes de dénombrement
Méthode de l’anse calibrée de 10 µL
-La culture doit être réaliser avant l'examen microscopique pour éviter toute
contamination.
-homogénéiser le prélèvement.
Ensemencement sur une gélose nutritive:
-immerger l'extrémité d’une anse calibrée à 10ul dans les urines en tenant
verticalement.
-Faire une strie centrale sur la boîte de gélose nutritive pour décharger l'anse,
-Puis sans la recharger, faire des stries perpendiculaires serrées sur toute la
surface de la boîte.
• La méthodes de dénombrement des germes urinaires repose
sur une comparaison de la densité des colonies présentes sur
la partie supérieure de la gélose à celle du schéma fourni avec
la fiche technique.
• Rendre le résultat en nombre UFC / mL d’urine.
• Planches étalons
Pratiquer l'antibiogramme .
Lorsque la présence de l'infection est révélée par l'ECBU, un examen complémentaire est réalisé :
l'antibiogramme.
L’antibiogramme permet de tester in vitro la sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques 

Interprétation des résultats de l’ECBU

L’interprétation de l’ECBU est difficile et tient principalement compte de 6 critères :

la leucocyturie,
la bactériurie,
le nombre d’espèces isolées,
la classe d’uropathogénicité des espèces isolées
le contexte clinique.
la concordance entre les résultats de la culture et de l’antibiogrmma
 Cellule de Mlassez
Qu’est ce que c’est que la cellule de Malassez ?
La cellule de Malassez ou encore hématimètre de Malassez est une lame de verre
creusée selon des dimensions bien précises. Elle permet de faire la numération
d’éléments, essentiellement des cellules dans un volume de 1mm 3. 
Échantillons pour lesquels la cellule est recommandée 
Les échantillons pour lesquels la cellule de Malassez est recommandée, sont
les liquides à forte densité cellulaire. Par  exemple le sang,  pour le comptage de
leucocytes ou des hématies. Il est également possible de compter les
spermatozoïdes dans le sperme par exemple.
Comment charger la cellule de Malassez
• Il s’agit tout simplement de mettre l’échantillon à diluer entre une lamelle et le
quadrillage de la cellule de Malassez. En effet, comme nous le verrons plus
loin, le quadrillage de la cellule de Malassez présente un volume dans lequel
nous allons compter. 
• S’ il est  nécessaire de diluer l’échantillon dont  nous voulons compter les
éléments,  il faudra tenir compte du facteur de dilution au moment du calcul
du nombre de ces éléments.
Principe de comptage
Si on czlcule le nombre de celllules:
-sur toute une bande :bande trouvé 10
-surun grand carré : nombre trouvé 100
-sur un petit carré : nombre trouvé 2000