TD La numération et l’estimation des populations microbiennes

Estimation de la population microbienne

Méthodes de dénombrement

Il est indispensable de connaître le nombre de bactéries dans un milieu donné.

C-à-dire de déterminer par exemple la concentration en bactéries contenues dans une préparation
initiale (échantillon)

Exemple:

Dans certains aliments le nombre de bactéries ne doit pas dépasser une certaines concentration (limite
supérieure de bactéries /mL) tel le yaourt ou l’eau potable.

Exemple : Eau potable

Comment apprécier si une eau est potable?

Pour que l'eau soit considérée comme potable, elle doit répondre à un certain nombre de critères

- Qualité microbiologique suffisante, avec en particulier absence de bactéries pathogènes

- Qualité chimique suffisante: les ions minéraux doivent être à des concentrations
comprises entre certaines valeurs fixées réglementairement.

Les contrôles microbiologiques doivent permettre de garantir une bonne qualité hygiénique

Critères de potabilité des eaux (Qualité microbiologique)

La production et la distribution de l’eau potable sont encadrées par une réglementation stricte qui
impose des normes définissant la qualité exigible de l’eau destinée à la consommation humaine.

Exemple concernant les bactéries :

*Les coliformes totaux et fécaux

- Absence d’E. coli dans 100 ml d’eaux traitées et

- Absence d’E. coli dans 100 ml d’eaux non traitées

Que 95% au moins des échantillons prélevés ne doivent pas contenir de coliformes totaux dans 100
ml d’eau

*Les streptocoques fécaux

- Absence de streptocoque dans 50 ml d’eaux traitées et

- Absence de streptocoque dans 50 ml d’eaux non traitées

* Les spores de bactéries anaérobies sulfito-reductrices

- 0 ou 1 spores dans 20 ml d’eau traitées et
- < 10 spores dans 20 ml d’eau non traitées

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Pour rechercher les bactéries pathogènes

Exemple : Présence probable de Salmonelles.

Dans la plupart des cas, on estime le nombre probable des bactéries pathogène par rapport au nombre
d’E. coli présent dans 100 ml.

Nombre d’E. coli dans 100 ml d’eau Probabilité de présence de salmonelles

< 1000 10 à 30%

> 2000 70 à 90%

Quels sont les méthodes utilisées pour le dénombrement des bactéries en microbiologie?

Cette estimation de la population bactériennes peut être basée sur le dénombrement ou comptage des
bactéries ou sur la mesure de la quantité de matière vivante (biomasse)

Il est possible de déterminer le nombre total des bactéries par :

- Dénombrement direct
- Dénombrement indirect

Dénombrement direct
- Au microscope

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Exemple :
Si on dépose 0,1 ml du milieu
Les bactéries se déposent au centre des rectangles
On compte la totalité des carrés ou une partie

10 carré 13 bactéries / 0,1 ml

100 carré 130 bactéries / 0,1 ml
Donc dans 1ml 1300 bactéries

Quelle est l’utilité du dénombrement de cellules microbiennes par la méthode de lecture directe
au microscope ?

Avantage : Numération immédiat, rapide

Inconvénient : Numération totale des microorganismes par excès:

Cette observation ne permet pas de différencier les cellules vivantes des cellules mortes qui ont la
même apparence Comptage des bactéries viables ou mortes.

Dénombrement indirect direct

Dénombrement sur milieu de culture solide

(Après culture des bactéries)

Le dénombrement se base sur l’évaluation de cette biomasse par :

Comptage des colonies bactériennes, après inoculation (Ensemencement) d’une quantité définie de
l’échantillon dans une boite de Pétri contenant le milieu de culture gélosé.

Remarque : Ensemencement de l’échantillon peut se faire avec :

- La solution mère directe ou

- La dilution de l’échantillon ou
- La membrane filtrante après filtration

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Lecture de résultats (étalement en surface)

Il est fortement recommandé de ne prendre en compte que les boites de Pétri ou le nombre de
colonies soit compris entre 30 et 300 colonies.

Exemple : Analyse avec 3 exemplaires : 3 boites de Pétri (B1, B2, B3),

Il faut faire la moyenne :
Nombre de colonie: B1+ B2+ B3
3

Si le nombre de colonie est supérieur à 300, les colonies seront serrées et elles forment une nappe
bactérienne
La culture ne sera pas exploitée pour le dénombrement Il faut faire la Dilution

*Cas de deux ou trois boite ensemencée par l’échantillon de la dilution

1) Cas ou une seule dilution qui montre des colonies dénombrables ( 30 < Nbr < 300)
- Ensemencement de la solution mère de l’échantillon
- Exemple : Eau de robinet ou eau embouteillée etc….

UFC /ml

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Dénombrement indirect sur milieux de culture liquide

Rappel :

La technique est basée sur le nombre le plus probable (NPP)

Principe voire (schéma)

Cette méthode repose sur une série de dilution de l’échantillon et sur son ensemencement dans 3 tubes
par exemple :

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6
Exemple 1:

Exercice

Du lait sous forme de poudre a été soupçonné d’être contaminé, après la préparation d’une suspension
mère (eau distillée stérile)) et après dilution, on a ensemencé trois boites de Pétri avec 1mL de chaque
dilution, les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Boite B1 B2 B3
Dilution
10-4 490 534 482
10-5 125 105 112
10-6 13 10 5

Questions :

1) Quelle est la ou les dilutions choisis ?

2) Déterminer le nombre de bactéries de la solution mère?

Exercices 2:

Dénombrement (numération), colimétrie

1)Vous ensemencez en profondeur 4 boîtes de Pétri avec 1 ml des dilutions suivantes: 10 -1, 10-2, 10-
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et 10-4.

Les résultats obtenus sont :

10-1 : 110 colonies

10-2 : 9 colonies

10-3 : absence de colonies

10-4 : absence de colonies

a) Donnez le résultat en UFC/ml.

b) Quelle formule mathématique générale utilisez-vous pour faire ce calcul ?

c) Le critère de qualité microbiologique est fixé à 100 UFC/ml. La qualité du produit est-elle
satisfaisante ?
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Correction

Exercice 1

1) Condition : les boites de Pétri ou le nombre de colonies est compris entre 30 et 300 colonies

- 3 boites de Pétri ensemencées, donc (B1+ B2+ B3) = 30 <Nbr< 300

- Pour la dilution 10-4: La somme de nombre de colonie est supérieure à 300

- Pour la dilution 10-5:

Application numérique :

125 +105+ 112 = 114

- La somme de nombre de colonie est : 30 <Nbr< 300

-
- Pour la dilution 10-6: La somme de nombre de colonie est inférieure à 30

Donc c’est la dilution 10-5qu’il faut choisir pour faire le dénombrement

2) Le nombre de bactérie de la solution mère :

Application numérique :

Nbr UFC/ml= 114 = 114 105 ou 1,14 107 UFC/ml

1 x 10-5

Nbr UFC/ml= 1,14 107 UFC/ml