République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique

Ecole Nationale Supérieure Vétérinaire d’Alger

Rapport de stage
Confirmation Moléculaire des souches de Salmonella spp isolées des viandes

Dr. Siham Nouichi

Laboratoire d’accueil : Hygiène Alimentaire

Université Mustafa Kemal
Faculté de Médecine Vétérinaire
Campus Tayfur Sokman
Hatay Turquie

Date : Dimanche 30 Novembre 2014

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Introduction

La salmonellose, est l’une des maladies d’origine alimentaire les plus courantes et les plus
répandues, dont l’agent causal est la bactérie Salmonella. Elle représente une charge
importante pour la santé publique et un cout considérable pour la société de nombreux pays.
Chaque année, des millions de cas sont signalés partout dans le monde, entrainant des milliers
de décès.

Les salmonelles font partie de la famille des entérobactéries, bacilles à Gram négatif. La
détermination des nombreux sérotypes est antigénique. Chaque sérotype possède une
mosaïque d’antigènes : somatique O, capsulaire Vi, flagellaire H. On a identifié à ce jour plus
de 2500 sérotypes. Salmonella Enteritidis, et Salmonella Typhimurium, sont les deux
principaux sérotypes de salmonellose transmise de l’animal à l’homme dans la plupart des
régions du monde. Salmonella est une bactérie omniprésente et résistante, qui peut survivre
plusieurs semaines dans un environnement sec et plusieurs mois dans l’eau.

Ces souches provoquent classiquement des gastro-entérites, qui peuvent être graves chez les
enfants, les personnes âgées, et les patients dont les défenses immunitaires sont affaiblies.

Les viandes, volailles, œufs, les fruits de mer, et les crèmes glacées, sont généralement
incriminés dans la dissémination des épidémies de salmonelloses humaines.

Matériels et méthodes

Origine des souches

Un total de 80 souches de Salmonella spp isolées des carcasses et des matières fécales de
bovins et d’ovins abattus aux abattoirs d’Alger (Algérie) ont été utilisées dans ce travail. La
recherche des souches de Salmonella spp à partir de ces échantillons a été réalisée selon la
norme ISO 6579, et l’identification a été faite par le système API 20E (Bio-Mérieux).

Extraction de l’ADN

L’extraction de l’ADN (Acide désoxyribonucléique) est une technique qui isole de l’ADN à
partir d’une cellule en quantité et en qualité suffisantes pour permettre son analyse.

L’extraction se fait à partir des cultures fraiches de 24 heures sur gélose nutritive en boîte de
Pétri.

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Durant ce stage, deux méthodes de purification de l’ADN ont été utilisés :

1. Technique d’extraction de I’ADN au NaCl

C’est une méthode d’extraction rapide de l’ADN.

Protocole

- Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, une ou deux colonies prélevées à la surface de la
culture sont mises en suspension dans 500µl d’eau biologique moléculaire, et lysées par
action thermique dans une eau bouillante (bain marie) à 95°C pendant 10min.
- 100 µl de NaCl (5M) sont ajoutés, et l’ensemble est bien homogénéisé par agitation des
tubes.
- Le mélange est centrifugé pendant 5 min à12000 rpm, le surnageant (environ 400µl) est
repris dans un nouveau tube.
- Un volume équivalent d’environ 500 µl de l’éthanol 100% est ajouté.
- Une centrifugation à 14.000 rpm pendant 10 min est réalisée.
- Le surnageant est ensuite pipeté soigneusement en faisant attention à ne pas toucher la
pelote de l’ADN.
- L’ADN est rincé avec 500µl avec l’éthanol 70%.
- Après avoir versé l’éthanol, les échantillons sont centrifugés pendant 10 min à 12000 rpm.
- La phase supérieure est prélevée (utiliser le culot), et les tubes sont séchés en ouvrant leurs
couvercles dans une étuve à 37°C pendant 30 min.
- L’ADN est ensuite repris dans 100µl de l’eau DPEC, agité dans un vortex, et conservé à -
20°C jusqu’à utilisation.

2. Extraction de l’ADN à l’aide du Kit commercial : GF1 bacterial DNA extraction

kit (Vivantis Sdn Bhd, Malaysia)

L’ADN est purifié selon le protocole fournis par le fabriquant (Figure n°01) comme suit :

- Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml, une ou deux colonies prélevées à la surface de la
culture sont mises en suspension dans 100 µl du tampon R1.
- 10 à 20 µl de lysozyme sont ajoutés, et le mélange est incubé à 37°C pendant 20 minutes.
- Une première centrifugation est réalisée à 13.000 rpm pendant 3 minutes, et le surnageant
est enlevé.

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- 20µl de Protéinase K sont ajoutée après avoir re-suspendu les cellules dans 180 µl du
tampon R2, le mélange est incubé à 65°C pendant 20 minutes.
- Une étape d’homogénéisation est faite par l’addition de 2 volumes du Tampon BG,
l’agitation des tubes, et l’incubation à 65°C pendant 10 minutes.
- 200 µl d’éthanol 100% sont ensuite ajoutés dans les tubes qui sont agités immédiatement.
- Le mélange est déposé dans les colonnes de purification (tubes vides fournis dans le kit)
contenant une membrane de silicate qui permet de fixer l’ADN.
- Une centrifugation est réalisée pendant 1 minute à 13000 rpm est réalisée.
- Les colonnes sont ensuite lavées avec 750 µl du tampon de lavage et centrifugées pendant
1 minute à 13000 rpm.
- Après avoir vidé les tubes, les colonnes sont séchées par une centrifugation à vide à 13000
rpm pendant 1 minute.
- Les colonnes sont déplacées vers des nouveaux tubes propres.
- L’ADN est enfin récupéré par l’ajout d’un tampon d’élution (50 à 100 µl) et une dernière
centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute, et conservé à 4°C ou -20°C.

Figure n 01 : Protocole d’isolement d’ADN selon le GF1 bacterial DNA extraction kit
(Vivantis Sdn Bhd, Malaysia)

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Technique du PCR

Principe

La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une méthode apparue en octobre 1985 grâce à Kary
Mullis. Elle consiste en une amplification enzymatique in vitro d’une petite séquence d’acide
nucléique (ADN) à l’aide d’amorces oligonucléotidiques complémentaires des séquences en
5´ et 3´ du segment à amplifier. Ceci est assuré par l’action cyclique d’une ADN polymérase
thermostable : Taq plymerase, isolée d’une bactérie thermophile : Thermus aquaticus.

Figure n° 02 : Eléments nécessaires à la réaction du PCR

La PCR est basée sur une répétition de cycles de changement de température.

En théorie, la quantité d’ADN obtenue par PCR est de 2n, où n représente le nombre de cycle.

30 cycles suffisent généralement pour obtenir une concentration d’ADN permettant sa

visualisation sur gel d’agarose, son clonage et son séquençage.

Chaque cycle comprend 3 étapes (figure n° 3) :

- Une phase de dénaturation où les brins d’ADN sont séparés grâce à une augmentation
de la température.

- Une phase d’hybridation où, suite à une baisse de la température, les amorces
spécifiques s’hybrident sur les molécules simple brin d’ADN.

- Une phase d’élongation où les polymérases synthétisent le brin complémentaire de

leur ADN. Ce brin est fabriqué à partir de dNTPs libres présents dans le milieu
réactionnel.

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 Figure n° 3 : Illustration schématique de la PCR

Protocole

Nous avons utilisé la PCR pour confirmer les souches de Salmonella spp et le sérotype
Typhimurium en amplifiant respectivement un fragment d’ADN du gène invA et du gène Spy,
en utilisant les amorces dont les caractéristiques sont détaillées dans le tableau n° : 01

Mélange pour PCR

La réaction d’amplification a été faite dans un volume final de 25 µl du mélange suivant:

-Tampon de la réaction 10X 2.5 µl

- MgCl2 (25mM) 3 µl

- une solution des différents désoxyribonucléotides triphosphates dNTPmix:

dNTPs (10 mM) 0.5 µl

- Amorce forward (10 pmol) 1µl

- Amorce reverse (10 pmol) 1µl

- Taq polymérase 0,2µl

- H2Ostérile 14.8 µl

Dans un premier temps un mélange ou mix est réalisé pour un nombre n de tubes, puis
réparti à raison de 2323 µl/ tube. L’ADN (2 µl) est ajouté en dernier au mélange réactionnel.

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Tableau n° 1 : Propriétés des amorces utilisées dans cette étude.

Nom Séquence d’oligonucléotide Gène Taille (bp) Réference

d’amorce (5´→3´)
S139 gtgaaattatcgccacgttcgggcaa Gène InvA pour le 284 Rahn et al.,
S141 tcatcgcaccgtcaaaggaacc genre Salmonella 1992
Typh F ttg ttc act ttt tac ccc tga a Gène Spy pour 401 De Freitas et
Typh R ccc tga cag ccg tta gat att S.Typhimurium al., 2010

Programme PCR

La réaction d’amplification proprement dite est effectuée grâce à différents cycles de

température réalisés sur un thermocycler (BOECO TC- SQ, Allemagne)

- Dénaturation initiale de l’ADN: 94°C pendant 3 min

- Dénaturation : 94°C pendant 30 secondes
- Hybridation : 58°C pendant 45 secondes 30 cycles
- Elongation : 72°C pendant 60 secondes
- Extension finale : 72°C pendant 5 minutes

Electrophorèse sur gel d’agarose

Principe

Cette technique est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement
à cause de l’ionisation de leurs groupements phosphates sous l’effet d’un champ électrique.
En effet, les acides nucléiques se déplacent de l’électrode négative (cathode) vers l’électrode
positive (anode). La séparation se fait à travers le gel d’agarose. La vitesse de
déplacement des molécules à travers le gel est limitée par la dimension des pores: les acides
nucléiques ayant le même rapport charge/masse seront séparés d’après leur longueur car les
molécules plus longues migrent plus difficilement à travers les pores du gel, alors que les
plus petites molécules se déplacent plus vite et migreront donc plus loin. On utilise des
marqueurs de taille pour pouvoir déterminer la taille (en pb) des acides nucléiques.

Le Bromure d’Ethidium étant un cation qui s’intercale entre les bases de l’ADN, le complexe
ion éthidium/ ADN est fluorescent sous UV. Ainsi il est possible de visualiser les fragments
d’ADN dans le gel et de prendre des photos polaroïd en noir et blanc (figure n° 4). Basé sur
des références, la dimension du fragment d’ADN (nombre de paires de bases) spécifique au

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micro-organisme recherché est connue. Il suffit de comparer la hauteur de la bande
apparaissant sur le gel d’agarose avec l’échelle de poids moléculaires. Si la bande est à la
bonne hauteur, on est alors en présence du micro-organisme recherché.

Préparation du gel

L’agarose en poudre est pesée et mise dans la quantité adéquate de tampon TAE (0,5X). Le
mélange est fondu au four micro-ondes jusqu’à ce qu’il devienne limpide; puis il est refroidi
et coloré avec du bromure d’Ethidium (BET), puis coulé dans un petit porte gel où un peigne
a été soigneusement placé. Il est laissé jusqu’à polymérisation complète. Le peigne sera
soigneusement ôté.

Le gel solidifié est déposé dans un appareil à électrophorèse puis recouvert par le tampon
TAE (0,5X).

Dans chaque puits, une quantité d’amplifiat préalablement mélangée avec du tampon de
charge de couleur orange (6X) sera déposée. Le premier puits est réservé au marqueur de
poids moléculaire.

La migration de l’ADN est réalisée à 120 volts pendant 40 minutes. Les fragments d’ADN
amplifiés sont visualisés sous UV et photographiés.

Figure n° 4: Visualisation de l’ADN et interprétation des résultats (Présence ou absence d’une bande
du même poids moléculaire que notre ADN cible). M : Marqueur de poids moléculaire 100 bp ; P:
contrôle positif (Salmonella spp) ; N : contrôle négatif (mélange de PCR sans l’ADN) ; R42, R43,
R45, H1, H2, H3, et H4 : Fragments d’ADN de 284 bp caractéristiques du genre Salmonella spp, P1 :
contrôle positif (Salmonella Typhimurium), S13, et S16 : Fragments d’ADN de 410bp caractéristiques
du sérotype Salmonella Typhimurium.

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Références

De Freitas, C. G., Santana, A. P., da Silva, P. H., Goncalves, V. S., BarrosMde, A., Torres, F.
A., & et al. 2010. PCR multiplex for detection of Salmonella Enteritidis, Typhi and
Typhimurium and occurrence in poultry meat. International Journal of Food Microbiology,
139: 15- 22.

Rahn. K., De Grandis. S.A., Clarke. R.C., McEwen. S. A., Galan. J. E., Ginocchio. C., Curtis
III. R., and Gyles. L. C. 1992. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella
typhimurium by polymerasechain reaction as a specific method of detection of Salmonella.
Molecular and Cellular Probes, 6: 271- 279.