LICENCE PROFESSIONNELLE

VALORISATION DES PRODUITS

DU TERROIR

SPECTROMETRIE
DE MASSE
Pr. R. SLIMANI
I - INTRODUCTION
Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?
La spectrométrie de masse est une technique d'analyse
physico-chimique permettant de détecter, d'identifier et de
quantifier des molécules d’intérêt par mesure de leur
masse

Réaliser des analyses quantitatives rapides

Grande sensibilité de détection :

- micro-prélèvements
- Limites de détection < nanogramme (10-9 g) et
même au picogramme (10-12 g)
2
II - PRINCIPE

Son principe réside dans la séparation en phase

gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de
leur rapport masse/charge

(m/z)

De plus, la spectrométrie de masse permet de

caractériser la structure chimique des molécules en les
fragmentant.

3
 III - HISTORIQUE
1897: J. Thomson découvre l'électron et détermine son rapport
m/z (Prix Nobel de physique)
1912: Construction du 1ér spectromètre de masse

4
 III - HISTORIQUE

Trois grandes périodes:

1912 - 1960: Analyse élémentaire et augmentation du pouvoir de
résolution
1960 - 1980: - Analyse de composés organiques,
- augmentation de la gamme de masse,
1980: Analyse de macromolécules biologiques
Aujourd’hui:
- Miniaturisation des spectromètres de masse (stations
spatiales, salles d’opération,...)
- Vers des systèmes plus résolutifs et donc précis en
mesure de masse moléculaire

5
Spectromètre de masse X-Series 2 6
IV - APPLICATIONS
Pratiquement tous les domaines scientifiques :
Suivre les processus de fermentation …(dosage)
Obtenir une 1ére donnée sur une molécule inconnue extraite d’une plante
médicinale (chimie organique / chimie médicinale)
Détection et identification de drogue et médicament dans le sang, l’urine
et la salive (santé / sécurité)
Détecter la présence de dioxines dans des aliments contaminés (santé)
Détermination des résidus de pesticides dans la nourriture (santé)
produits organiques volatils dans l’eau de distribution (santé)
Etudes de pollution de l’air ‘soufre, plombe…’ (environnement)
Localiser un gisement en analysant les hydrocarbures dans les roches
(géophysique)
Détecter et identifier l’usage de stéroïdes chez les athlètes (dopage)
Etudier la composition de molécules trouvées dans l’espace
(astrophysique)
Etudier des mutations génétiques (médecine / Biologie)
Analyser et dater des pièces archéologiques (géologie)
7
Valider un nouveau médicament (pharmacologie)
V - APPAREILLAGES
Comment peser une molécule ?

Un spectromètre à très haute résolution au sein de l’Unité de 8

Recherches MolSys - Université de Liège
9
10
V.1 - ANALYSEUR

11
 A la sortie du analyseur, on collecte
les ions :
- chargés positivement
- vérifiant la condition
2 2
H r
m/z 
2V
 pic à une valeur m/z sur
le spectre de masse 12
V.2 – CARACTÉRISTIQUES D’ANALYSEUR

LES CARACTÉRISTIQUES PRINCIPALES D'UN ANALYSEUR SONT :

• La résolution R
• La gamme m/z qu'il peut analyser
• La rapidité de balayage en m/z
• La sensibilité
• La vitesse avec laquelle les ions le traversent

Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces

caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans
certaines limites.
Chaque type d'analyseur a son "point fort".

13
 V.2 – RÉSOLUTION D’UN ANALYSEUR

Pour un pic : Résolution R détermine la finesse des pics et donc la capacité à

distinguer des pics proches. Plus la résolution est élevée, plus le pic sera fin et plus
il sera possible de distinguer des pics proches.
M

R = M/M
Vallée à 50 %
= Largeur à
mi-hauteur
M
Vallée à 10 % Vallée à 10 %

M M M + M

Entre deux pics : la Résolution R est la capacité à séparer deux pics distants
d’une différence de masse M ie aptitude d’un analyseur à séparer l’ion M de
l’ion M+M
14
 CARACTÉRISTIQUES DES ANALYSEURS
Analyseurs Résolution Gamme m/z
Quadripôle (Q) 2 000 8 000
Magnétique (EB) 20 000 20 000
Temps de vol (TOF) 20 000-60000 500 000
Trappe ionique 5 000-20000 6 000
Cyclotron à résonance
des ions (FT-ICR) 1 000 000 4 000

15
 VI - SPECTRE DE MASSE

- axe des ordonnées :

abondance relative de ces
ions
pic le plus intense : fixé
arbitrairement à 100 %

- axe des abscisses :

rapports m/z des ions détectés
(m/z en Dalton Da)

Le dalton (Da) : masse de l’isotope 1 de l’hydrogène

1 Da = 1,673.10-27 kg = 1,007 uma
L’unité de masse atomique (uma) : 1/12 de la masse de l’isotope 12 du carbone
16
1 uma = 10-3 kg.mol-1/N = 1,661.10-27 kg (N étant le nombre d’Avogadro)
La spectrométrie de masse (MS) est une méthode de mesure des rapports masse sur
charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de
fragmentation

17
18
 Différents types de pics
Le pic de base :
Les pics fragments : le plus intense (100) :
différents ions ion le plus abondant
fragments donc le plus stable

Le pic moléculaire ou
pic parent :
de nombre de masse
= masse moléculaire

19
 Fragments du molécule Pic de base (le pic plus
haut – 100% intensité)
Intensité relative
Nombre d’ions

120
138
43
92 Aspirine
180
Pic
moléculaire
20

Rapportes masse-sur-charge (m/z)

VII - ANALYSE SPECTRALE

Deux étapes :
 Exploitation de l’ion moléculaire
masse moléculaire
parité
isotopes
formule brute...
 Exploitation des ions fragments
nature de la molécule
structure

21
 Quelles informations peut apporter
une source à ionisation douce ?

1- La masse moléculaire d’un composé

2- Pas de fragmentation
3- Une mesure de la quantité

Nombre d’ions Pic Moléculaire

M/z 22
 Quelles informations peut apporter
une source à ionisation dure ?

1- La masse moléculaire d’un composé

2- La masse des fragments de ce composé
3- Une mesure de la quantité

Nombre d’ions Pic Moléculaire

Fragments

M/z
23
 Hexane 86,17 g/mol

Pic moléculaire ≠ pic de base

 Ion moléculaire se fragmente facilement
24
Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?

1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse

moléculaire
2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une
partie de la structure
3- L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative

Cholestane

Pic moléculaire
100 217.0
m/z 217
m/z 149
218.0
% 149.0
108.9 357.1
372.1
55.0 81.0 94.9 148. 0 150.0 219.0
175. 0 203. 0
262. 1 302.1
232.0 373.2
315.1 343.1 410.1 416.2
0 Da/e
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

Fragments 25

Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.

LE PIC D’ION MÉTASTABLE

 Conditions normales :
Ion moléculaire (ou fragment) formé dans la source est
suffisamment stable pour atteindre le détecteur.
pic sur la spectre

 Si durée de vie < qq μs ion métastable

Ion métastable : se décompose

en partie sur le trajet

26
 Ion métastable : se décompose
en partie sur le trajet
AB+. A+ + B.

 Si la décomposition de AB+. (de masse m1) a lieu

entre source et analyseur
 Ion A+ (masse m2) donne une trace sur
le spectre à une masse apparente m* :

m* = m22/m1
m* ≠ masse réélle

27
 Une transition métastable  3 pics
- 2 pics (normaux) à m1 et m2

- 1 pic métastable à m* :
Faible, de forme diffuse, dont la position non
nécessairement une valeur entière
28
 VIII. Les Sources d’Ionisation les plus utilisées

Ionisation à Impact électronique (IE) Petites molécules

volatiles et DURES
Ionisation Chimique (IC) thermostables

Ionisation par bombardement d’ions molécules < 6000 Da

ou d’atomes rapides (LSIMS ou FAB)
ASSEZ DOUCES

Ionisation par électronébullisation

(électrospray ES ou ESI) Biomolécules (1 300 kDa) et
complexes non-covalents,
Désorption/Ionisation Laser assistée protéomique
par Matrice (MALDI)
DOUCES
29
1 - IONISATION DANS LA SOURCE

Production d’ions en phase gazeuse

30
Production d’ions en phase gazeuse

On introduit un gaz (méthane, ammoniac, isobutane…) avec le

composé M. Le gaz est ionisé par un bombardement d'électron. C'est
une ionisation douce qui permet de mieux repérer la valeur de M car
on observe principalement la formation de MH+ (ion
pseudomoléculaire)

31
Production d’ions en phase gazeuse

32
Production d’ions en phase gazeuse

33
Production d’ions en phase gazeuse

34
 Production d’ions en phase gazeuse

L’électronébulisation à pression atmosphérique repose sur une succession

de phénomènes physicochimiques. Leur description reste simple.

Tout d’abord, le champ

d’électrique positif (ou
négatif) provoque une
accumulation de charges
négatives (ou positives) à la
surface du liquide, par
utilisation de l’électrospray,
les ions sont déjà formés
35
dans la phase liquide
 Production d’ions en phase gazeuse

Sous l’effet des mouvements de ces charges, et la tension de surface,

la forme de goulette se déforme jusqu’à prendre la forme d’un cône
(nommé cône de taylor). Dès que les pulsions coulombiennes entre
charges positives dépassent la tension de surface du liquide, un jet de
gouttes chargées est émis à partir de la pointe du cône. Leur diamètre
est de l’ordre du micromètre. Il dépend de la valeur du potentiel
électrique, du débit de la solution, de la nature du solvant et de la
température du gaz N2. 36
IX- Pic moléculaire et masse moléculaire : définition

La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans

le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la
molécule étudiée, sans qu’il y ait eu rupture d’une liaison.

La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d’une charge

électrique.

La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire

(formule brute) de l’ion moléculaire.

L’existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics

moléculaires.
On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics
moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire »)

La présence d’isotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic

moléculaire ».
37
Pour cette molécule de 10 atomes de carbone, un atome de C13
peut être dans 10 positions différentes,mais la masse de la
molécule est toujours la même.

C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 Masse
Masse M

C13- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

C12- C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

C12- C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

C12- C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12

C12- C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12
Masse M+1
C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12 - C12

C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12 - C12

C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12 - C12
38
C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13 - C12

C12- C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C12 - C13
IX- 1 - MASSE MOLÉCULAIRE

 Masse de l’ion moléculaire = somme des masses

des isotopes les plus abondants (12C,1H,16O,..) des
éléments présents dans la molécule.
 - Méthane 12C1H :
4 ion moléculaire à m/z = 16

7 x 12C = 84
- Benzamide C7H7NO 7 x 1H = 7
Ion moléculaire M+. m/z = 121
1 x 14N = 14
1 x 16O = 16
M = 121

La spectrométrie de masse permet de déterminer la

masse moléculaire d’une substance inconnue. 39
IX-2. AMAS ISOTOPIQUE
Abondances naturelles relatives des isotopes des éléments
courants calculées / 100 (isotope majoritaire)

40
 Isotopes de faible abondance-Cas du carbone

 Exemple : CH4

 12C1H m/z = 16 pic M

4
 13C1H m/z = 17 pic M + 1
4
 12C2H1H m/z = 17 pic M + 1
3
 13C2H1H m/z = 18 pic M + 2
3
…….
Ces différents pics = Amas isotopique
Intensités relatives des pics de l’amas
isotopique selon abondance naturelle des
différents isotopes de l’élément
41
 Pic M+1 :

* 13C1H4 : Abondance isotopique du carbone 13 = 1,1%

 intensité du pic M+1 ≈ 1,1% de celle du pic M (12C )

12C2H1H
3: Abondance isotopique du 2H = 0,016%
42
 Amas isotopique : Ensemble des pics dus à
différents isotopes d’un élément :

 Nombre et intensités relatives des pics de

l’amas isotopique :
(a+b)n
a : abondance relative de l’isotope le plus léger
b : abondance relative de l’isotope le plus lourd
prise égale à l’unité
43
n : nombre d’atomes de l’élément considéré
 ISOTOPES D’ABONDANCE CONSIDÉRABLE
Cas du chlore et du brome
Isotope lourd (+2) est abondant
 Si la molécule contient n halogènes, l’intensité des
pics de l’amas isotopique est donnée par la relation
(a+b)n.
Exemple 1 : CH3Br
79Br: 100% 81Br:98%
a=1 b=1
Amas isotopique :
(a+b)1 = a + b 2 pics M et M+2 d’intensité
1 1 relative 1:1
M M+2
44
 (IE)

M (m/z = 156) M+2 (m/z = 158)

2 pics : 156 et 158

intensités presque égales car abondance naturelle relative
des isotopes presque égales : 45
79Br (100%) et 81Br (98%)
  Exemple 2 : CH237Cl2
M = 84

35Cl : 100% 37Cl : 32,5%

a = 3 b = 1
(a+b)2 = a2 + 2ab + b2
9 6 1
M M+2 M+4

3 pics M, M+2 et M+4

intensités relatives 9:6:1

 Exemple 2 : 12 + 2*1
+2* 35 = 84 46
IX-3. PARITÉ DE L’ION MOLÉCULAIRE

REGLE DE LA PARITE

 Si le pic parent a une masse impaire

 La molécule contient un nombre impair d’éléments
trivalents (N, P…) : CxHyOzNw (w =1,3,5…)

 Exemple :
Benzamide C7H7NO m/z = 121
Nombre d’atomes d’azote : 1 (impair).

47
X - LES FRAGMENTATIONS

48
X-1. PRINCIPES GÉNÉRAUX POUR LES FRAGMENTATIONS

49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81