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Chromatographie

Pr. Franck DENAT


ICMUB UMR 5260
9, Av. Alain Savary
BP 47870 21078 Dijon
Franck.Denat@u-bourgogne.fr

Chromatographie
I. Gnralits.
Mthode de sparation des constituants dun mlange.
Applications: Identification, dosage (quantification), purification.
Quelques noms et dates :
- 1903 : mise en vidence par Mikhail TSWETT, botaniste russe
- 1931 (KUHN et LEDERER) : chromatographie sur colonne (chromatographie liquidesolide CLS)
- 1938 (IZMAILOV et SCRAIBER) : chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC),
TAYLOR et UREY : chromatographie par change dions
- 1941 (MARTIN et SYNGE, Nobel en 1952) : concept de chromatographie gaz-liquide,
chromatographie de partage liquide-liquide
- 1952 : dveloppement pratique de la chromatographie gaz-liquide
- 1955 : 1er chromatographe gaz-liquide sur le march (chromatographie en phase
gazeuse : CPG ou GC)
- 1965 (HALASZ, HORVATH) : Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP ou
HPLC)
Rfrences :
- F. Rouessac et A. Rouessac. Analyse Chimique. Mthodes et techniques
instrumentales modernes, 6me dition (Dunod)
- D.A. Skoog, D.M. West, F.J. Holler. Chimie analytique (De Boeck).

I. Gnralits.
I. 1. Principe :
Le principe repose sur l'quilibre de concentrations des composs prsents entre deux
phases en contact : la phase stationnaire et la phase mobile (gaz ou liquide) qui se
dplace. La sparation est base sur l'entranement diffrentiel des constituants du
mlange. Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps proportionnels
leurs proprits intrinsques (taille, structure, ...) ou leur affinit avec la phase
stationnaire (polarit, ...).

A phase mobile
K = CS/CM

A phase stationnaire

K : Coefficient de distribution
CS : Concentration de lanalyte A dans la phase
stationnaire
CM : Concentration de lanalyte A dans la phase mobile

Chromatographie : partition phase stationnaire - phase mobile


Extraction : partition entre deux phases liquides non miscibles
Cristallisation : partition entre phase liquide - phase cristalline
Distillation : partition entre phase liquide - phase gazeuse
Sublimation : partition entre phase solide - phase gazeuse

I. 2. Classification des mthodes chromatographiques :


On distingue les diffrentes mthodes chromatographiques selon la nature des phases.

Phase stationnaire : - dans une colonne au travers de laquelle progresse la phase mobile par
gravit ou sous laction dune diffrence de pression chromatographie
sur colonne
- sur une surface plane chromatographie sur couche mince (CCM)

Phase mobile :

phase qui se dplace sur ou travers la phase stationnaire, entranant


avec elle lanalyte. Le processus dentranement de cet analyte est
appel lution. La phase mobile peut tre un liquide ou un gaz.

I.2.1. Chromatographies en phase liquide (CPL)


La phase mobile est un liquide. On distingue:

- Les chromatographies de partage :


- La chromatographie liquide-liquide (CLL) ou chromatographie de partage :
la phase stationnaire est un liquide immobilis sur un support solide inerte : soit imprgne
dans un solide poreux (risques de lessivage), soit greffe sur le solide (phase greffe).
La sparation repose sur le coefficient de partage du solut dans les deux phases liquides.
- La chromatographie dexclusion, ou permation de gel, ou tamisage molculaire :
la phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase
fixe, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel et sont donc retards.

-Les chromatographies dadsorption :


- La chromatographie liquide-solide (CLS) ou chromatographie dadsorption (la
plus ancienne et la plus gnrale) :
la phase stationnaire est un adsorbant solide polaire (silice ou alumine) : chromatographie
sur colonne ou CCM. Lanalyte adhre la phase stationnaire par physisorption et
chimisorption coefficient dadsorption. La phase stationnaire peut tre modifie pour tre
apolaire : chromatographie dadsorption en phase inverse.

-Les chromatographies dadsorption :

- La chromatographie par change dions ou chromatographie ionique :


la phase stationnaire est une rsine changeuse dions (polymre porteur de groupements
ioniss, ngativement pour sparer des cations, positivement pour sparer des anions) :
interactions lectrostatiques.
- La chromatographie daffinit :
la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greff un effecteur qui
prsente une affinit pour un solut de lchantillon analyser (affinit enzyme-substrat,
ligand-rcepteur, antigne-anticorps).

I.2.2. Chromatographies en phase gazeuse (CPG)


La phase mobile est un gaz vecteur. On distingue :
- chromatographie de partage :
- La chromatographie gaz-liquide : la phase stationnaire est un liquide immobilis sur un
support solide par imprgnation ou par greffage.
- chromatographie dadsorption :
- La chromatographie gaz-solide : la phase stationnaire est un solide poreux, rserv
lanalyse de mlanges de gaz ou de liquides bas points dbullition.
Eventuellement, la phase mobile peut tre un fluide ltat supercritique (ex CO2 50C et
150 bars)

I.3. Choix de la technique :


Les diffrentes techniques sont complmentaires plutt que concurrentes.
Le choix de lune ou lautre dpend :

- de la nature du solut : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide,


macromolcule, espce organique, polaire, ionique,
- du but de lanalyse : identification de composants dun mlange, ncessit ou non
de coupler la chromatographie avec une mthode spectroscopique ou avec la
spectromtrie de masse (CPG/SM ou GC/MS), contrle de puret, purification de
produits (colonnes prparatives), suivi de raction en continu pour optimiser des
paramtres, dosages (quantification)

II. Chromatogramme.
Diagramme montrant lvolution du signal du dtecteur ( la concentration en solut) en
fonction du temps dlution (plus rarement du volume dlution)

Elution : entranement dun solut travers la phase


stationnaire par le mouvement de la phase mobile.
En CLS (colonne ou CCM), la phase mobile peut tre
appele luant
Lanalyse du chromatogramme permet une analyse :
-qualitative : identification / position du pic
-quantitative : aire des pics

Chromatogramme :

t0 : dbut de l'injection
Vm : volume mort de la colonne
tm : temps mort
Ve : volume d'lution ( de rtention, Vr )
d'un compos
tr : temps de rtention ( d'lution, te ) d'un
compos
Ve (volume d'lution) = d (dbit) x t (temps)
Ve' : volume d'lution rduit (Ve = Ve' + Vm)
tr' : temps de rtention rduit (tr = tr' + tm)
Wb : largeur du pic la base ()
Wh : largeur du pic mi-hauteur ()
Facteur de rtention (ou facteur de capacit) k :

k=

k=

tr
tm

tr-tm
tm

mS
mM

CSVS
CMVM

= K

VS
VM

K : coefficient de distribution
mS : masse de solut dans la phase stationnaire
mM : masse de solut dans la phase mobile

Idalement 1<k<10 pour les soluts dun mlange

Caractristiques dune courbe de Gauss (pic idal) :

Les molcules subissent un grand nombre de transferts phase mobile phase


stationnaire. Or la progression (lution) na lieu que lorsque la molcule est dans la phase
mobile. Certaines molcules progressent plus rapidement car elles passent plus de temps
dans la phase mobile que la moyenne, dautres au contraire sont retardes car elles restent
plus longtemps que la moyenne sur la phase stationnaire : rpartition statistique autour
dune valeur moyenne.
La largeur du pic est lie lefficacit de la colonne.

III. Efficacit dune colonne


III.1. Modle des plateaux (cf distillation fractionn)
Approche ancienne mais toujours utilise : le phnomne de migration qui est en ralit
dynamique et continu est considr comme une suite dtapes distinctes (quilibres
successifs). On considre alors quune colonne de longueur utile L est compose de N
petits disques fictifs superposs (plateaux thoriques) de mme hauteur H.
L : longueur utile de la colonne

H=

N : nombre de plateaux thoriques : 100 - 106

H : hauteur quivalente un plateau thorique


(HEPT) : 1 cm - 10 m

Une colonne sera dautant plus efficace que N est grand (L grand) et H est petit.
On peut montrer que : H =

Donc H =

L2
16tR2

et =

L
et

L
4tR

N = 16(tR/)2

ou

N = 5,545 (tR/)2

III.2. Facteur de sparation entre deux soluts


(facteur de slectivit)

III.3. Facteur de rsolution

tR2 - tR1
R=2
1 + 2

On peut montrer que R est


N, dpend aussi de k et

k2
k1

tR2
tR1

III.4. Effet de la vitesse dlution sur lefficacit de la colonne


Mis en vidence par Van Deemter quation simplifie :

H = A +

B
u

+ Cu

u : vitesse linaire moyenne dcoulement de la phase mobile (cm/s)


Allure de la courbe de Van Deemter en CPG :
(cm)
(cm2/s)
(s)

uopt =

B
C

A : Coefficient de diffusion turbulente ou terme de remplissage


Chemins prfrentiels dus la granulomtrie de la phase stationnaire (taille et rpartition
des particules) changes imparfaits entre les phases perte defficacit.
A est donc li au diamtre des particules du support et lirrgularit du remplissage.

B : Coefficient de diffusion longitudinale


Diffusion : migration des espces des rgions les plus concentres vers les rgions plus
dilues. La vitesse de diffusion est au coefficient de diffusion.
Le coeff. de diffusion est plus important dans les gaz que dans les liquides phnomne
important en CPG (principale cause dlargissement des pics). B est inversement u
(moins de diffusion lorsque lanalyte sjourne moins longtemps dans la colonne).
Rq.: viter dinterrompre une chromatographie en cours.

C : Coefficient de transfert de masse


Coefficient de transfert de masse du solut entre les deux phases, important lorsque le
passage est trop rapide pour que lquilibre soit atteint (C u ).

III.5. Comparaison de lefficacit des colonnes en CPL et CPG :


u plus faible en CPL quen CPG, H plus petit en CPL quen CPG, mais L plus grand
en CPG ( 50 m) quen CPL (25 50 cm max (trop de pertes de charge au del))
En gnral, meilleure efficacit en CPG (N plus grand).

III.6. Optimisation dune analyse chromatographique


R (facteur de rsolution) dpend de N, k et
- N peut tre optimis en jouant sur H (diminution du des particules, optimisation
du de la colonne, L, et u (Van Deemter)
- k (facteur de rtention) R augmente avec k mais le temps aussi (compromis :
1<k<10). Pour augmenter k : baisser la T en CPG, modifier la composition de la phase mobile
en CPL.
- Inutile doptimiser N et k si (facteur de
sparation) = 1. Pour augmenter tout en conservant
1<k<10 : programmation de T en CPG, modifier la
composition de la phase mobile en CPL, modification de
la phase stationnaire, ajouter une espce chimique
susceptible dinteragir avec certains constituants.

IV. Chromatographie en phase gazeuse


Lchantillon est vaporis et inject au sommet de la colonne. Llution est assure par un
flux de gaz inerte appel gaz vecteur (phase mobile). Il ny a pas dinteraction entre lanalyte
et la phase mobile en CPG.

IV.1. Schma de principe

IV.2. Alimentation en gaz vecteur


Gaz inerte vis--vis de lchantillon et du garnissage de la colonne (phase stationnaire) : He,
N2, H2, Ar (le choix du gaz dpend du dtecteur utilis).
Le gaz doit tre exempt de traces dH2O et O2 : gaz purs et desschs (tamis molculaire).
Contrainte : rgulation du dbit (u) : dbit = 1% tR = 1%
En gnral :

25 100 ml/mn pour les colonnes remplies


0,5 5 ml/mn pour les colonnes capillaires

IV.3. Injection de lchantillon


Microseringue (1l 10L). Injection travers un septum (lastomre) dans une chambre
vaporisation instantane (injecteur) situe une extrmit de la colonne.
Temp. de linjecteur : doit permettre la vaporisation mais viter la dcomposition ( 50C au
dessus du point dbullition du constituant le moins volatil)
Les caractristiques de linjecteur dpendent du type de colonne utilis :
-Colonnes remplies : injection de 0,1 0,5 l de solution de lchantillon, injecteur
classique, vaporisation directe.
-Colonnes capillaires (faibles dbits) : quantits trs faibles, difficiles mesurer : injecteur
avec ou sans division (split/splitless)

Injecteur split/splitless :

Mode split : le gaz vecteur pntre dans la chambre de vaporisation avec un dbit lev
(ex: 50 ml/mn), une vanne de fuite, rglable, permet dvacuer la plus grande partie du
gaz et de ne laisser entrer dans la colonne quune faible partie (1/20 1/500), ex: 1% de
50 ml/mn, soit un dbit dans la colonne de 0,5 ml/mn : seulement 1% de lchantillon
inject passe rellement sur la colonne.
Mode splitless : rserv aux solutions trs dilues (analyse de traces)

Injecteur on column :

Injection directe, froid (40C), de lchantillon lintrieur de la colonne (microseringue spciale). La vaporisation na lieu quaprs le dpt.
Adapt aux composs fragiles (thermodgradables), en biochimie par ex.

Injecteur temprature programmable (PTV) :

Programmation de la temprature de la chambre dinjection de 20 300C en


quelques dizaines de secondes : conjugue les avantages de linjecteur split/splitless et de
linjecteur on column : possibilit dinjecter froid, en mode split, avec une seringue
classique.

IV.3. Colonne et four


Colonne (une ou deux) dans enceinte thermostate (40 400 C) avec possibilit de
programmation de temprature. Doit tre trs stable : T de1 C tR de 2 3%.
T (C)

pente (C/mn)

IV.3.1. Colonnes remplies ( garnissage) (les plus anciennes)


Tube en acier inox, verre, ou tflon de 1/8 ou 1/4 de pouce de (3,18 ou 6,35 mm) et 1 3 m
de long, rempli dun support poreux, inerte et stable, finement et uniformment divis,
pralablement recouvert dune couche mince de la phase stationnaire liquide. La phase
stationnaire est donc imprgne (taux de 3 25%) dans les pores (pb de lessivage). Grand
choix de phases stationnaires.
Support le plus utilis : terre de diatomes (silicates fossiles) : chromosorb
moyen des grains efficacit , pertes de charge .
Granulomtrie = 60 100 mesh (0,25 0,15 mm)

(mesh x mm = 15)

IV.3.2. Colonnes capillaires


Golay (1957), dveloppes dans les annes 70.
Colonnes tubulaires ouvertes : la phase stationnaire tapisse les parois internes, sous forme
dun film (paisseur 0,05 5 m) : WCOT (Wall Coated Open Tubular).
1res colonnes en acier, puis en silice fondue (trs pure) (FSOT : Fused Silica Open Tubular)
recouvert dune gaine extrieure en polyimide (thermiquement rsistant)
intrieur = 0,1 0,35 mm, L = 10 100 m (25 m) enroule en spirales de 15 cm

: Grande efficacit 200000 plateaux ( 1000 pour une colonne remplie). A noter que le
terme de remplissage A de leqt de Van Deemter est ici nul.

: cot, fragilit (casse, oxydation), faible capacit injecteur split-splitless.

IV.4. La phase stationnaire


- faible tension de vapeur (Eb. au moins 100 C > la Tmax dutilisation
de la colonne;
- stabilit thermique;
- inertie chimique;
- proprits telles que les valeurs k et soient correctes.

Colonnes remplies :
Grand choix de phases stationnaires, facile mettre en uvre car simple imprgnation
dans les pores du support.
Classement de 200 phases stationnaires (Mc Reynolds) I = Iphase - Isqualane
(I = indice de rtention de Kovats, squalane (C30H62) phase stationnaire de rfrence, la
moins polaire)

Colonnes capillaires :

Choix beaucoup plus limit (phases pouvant conduire la formation dun film greff) :

Polysiloxanes :

R
R
R
R - Si - O - Si - O - Si - R
R

nR

R = Me : polydimthylsiloxane (OV1 ou SE30) apolaire.


Possibilit de substituer des groupes Me par R = Ph (5%, 50%,), C3H6CF3, C3H6CN :
polarit

Polythylne glycol (PEG) :

HO - CH2 - CH2 - O - CH2 - CH2 - OH


n

Carbowax

Phase stationnaire solide (chromatographie gaz/solide) :


Matriau adsorbant (silice ou alumine) dpos sous forme de fines
particules trs fines sur la paroi interne des colonnes capillaires : PLOT (Porous
Large Open Tubular).
Pour sparation de gaz (N2, CO, CO2) et hydrocarbures trs lgers.

IV.5. Principaux dtecteurs


Performances du dtecteur :
- sensibilit (10-8 10-15 g/s)
- rponse linaire sur plusieurs dcades
- slectivit : dtecteurs universels ou slectifs / classe de composs.

IV.5.1. Dtecteur conductibilit thermique (TCD) ou catharomtre


Mesure des variations de la conductivit thermique du gaz vecteur (H2 ou He) 6 10 x >
la plupart des produits organiques
Prsence de molcules de la conductivit thermique ( [ ]) de la T du
dtecteur (filament Pt, Au ou W) : systme diffrentiel (pont de Wheatstone)

: simple, linarit 105, universel, non destructif, colonnes remplies ou capillaires


: sensibilit (10-8 g/s).

IV.5.2. Dtecteur ionisation de flamme (FID) (le plus utilis).


La phase mobile pntre dans un brleur aliment par un mlange H2 + air
combustion, production dions et dlectrons faible courant lectrique amplifi par un
lectromtre.
Laire du pic est ici la masse et non la [ ], donc non dpendante des variations de
dbit de la phase mobile .
: forte sensibilit (10-13 g/s), linarit (107-108), quasi-universel
: destructif (pyrolyse)

IV.5.3. Autres dtecteurs


- Dtecteur thermoionique :
Semblable au FID + cramique en silicate de Rb ou Cs lextrmit de la flamme :
formation dun plasma dans lequel se forme un nombre lev dions en prsence de
molcules phosphores ou azotes.
Slectif aux composs contenant P et N (applications : pesticides,)
- Dtecteur photomtrie de flamme : excitation des lments par de la lumire des
caractristiques (526 nm pour P, 394 pour S)
- Dtecteur capture dlectrons (composs halogns)
- Mthodes couples : information structurales
-Dtecteur IR
-Dtecteur de masse : GC-MS : spectromtre de basse rsolution (souvent
quadriple)

V. Chromatographie Liquide Haute Performance


CPL / CPG :
-

+ gnral : composs thermosensibles, trs polaires (ions), peu volatils

(macromolcules)
- efficacit moindre (L + faible)
- + dinteractions :
CPG

CPL

Solut

Solut

phase stat.

phase mobile

phase stat.

moyen des grains efficacit (terme A ), pertes de charge .


= 3 10 m : ncessit de pousser la phase mobile P 400 bars : CLHP (HPLC)

V.1. Appareillage.

Elments relis entre eux par des tubes ( = 0,1 mm) en inox ou PEEK

V.1.1. Rservoirs de phase mobile (solvants trs purs)


Verre ou inox (V = 0,5 2L)
Filtre (poussires), dgazage (barbotage de gaz inerte)
- Mode isocratique (luant unique)
- Mode gradient dlution (mlange de solvants)

V.1.2. Systme de pompage


- P 420 bars
- pas de pulsation : pompes piston alternatif
- 0,1 < dbit < 10 ml/min ( = 0,5 %)
- rsistance la corrosion

V.1.3. Injecteurs
Vanne dinjection boucle (5L < V < 500L)

V.1.4. Colonnes
standard : Inox (5 cm < L < 30 cm, 4 mm < int.< 10 mm), efficacit 50 000 plateaux / m
Micro-colonnes (L 5 cm, int 1 mm, 100 000 plateaux / m) : rapidit, faibles volumes
de solvants
Matriau de remplissage : gel de silice prpar par procd sol-gel
Si(OEt)4

H2O

SiO2

ure + formol
pH = 2

, O2

H+
Sol-gel

3-6m

silice celle utilise en CPL prparative (sable Na2SiO3 Si(OH)4 SiO2)


Proprits et caractristiques de la silice :
- polaire (silanols Si-OH), 5 silanols / m2
- poreux : moyen des pores, distribution poreuse, surface spcifique ( 350 m2/g)
- adsorbant : CPL prparative = CLS (chromato dadsorption),
CLHP = CLL, plus exactement Liquide -Phase greffe (chromato de partage)
la silice est donc modifie.

V.1.5. Dtecteurs
- sensibilit : limite de dtection (LD) : signal / bruit 2
- rponse linaire sur un large domaine de [ ]

a. Dtecteur spectrophotomtrique (absorbance)


- monochromatique :
source (D ou vapeur de Hg), monochromateur (ex. raie 254 nm du Hg), cellule, PM
Slectif : la dtection dpend de de chaque espce la choisie. LD 0,3 ng / ml,
linarit 104
- polychromatique :

b. Dtecteur spectrofluorimtrique (fluorescence)


Peu de composs fluorescent naturellement drivatisation : ex. FMOC pour les amines
COCl

Trs sensible : LD 8 pg / mL, linarit 104

c. Rfractomtre (indice de rfraction)


Variation de lindice de rfraction / prsence de solut dans le solvant
Universel
Peu sensible ( 1 g / mL), Utilisable seulement en mode isocratique.

d. Autres dtecteurs
- lectrochimiques (mesures potentiomtriques, conductimtriques, voltampromtriques)
- couplage / spectromtre de masse (electrospray) voire RMN.

V.2. Phase stationnaire


Phases greffes : silanisation de silices
OH
OH
OH

ClSiMe2R

silice

Me
O Si R
OHMe Me
O Si R
Me

V.2.1. Phases polaires ou normales


- fonctions amine : R = -(CH2)n-NH2
R = -(CH2)n-NMe2
R = -(CH2)3-NH-(CH2)2-NH2
- fonctions diol : R = -(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2-OH
- fonctions nitrile : R = -(CH2)n-CN

V.2.2. Phases apolaires ou polarit inverse (phases inverses)


- groupes alkyle ou aryle : R = -(CH2)7-CH3

RP-8 (dimthyloctylsilane)

R = -(CH2)17-CH3 RP-18 (dimthyloctadcylsilane)


R = -(CH2)n-Ph

V.3. Phase mobile

Chromatographie normale :

Chromatographie inverse :

Les composs les plus polaires

Les composs les plus polaires

sont davantage retenus

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VI. Chromatographie par change dions


Phase stationnaire = rsine (polymre organique, ex styrne-DVB) changeuse dions
Rsine anionique (changeuse de cations) :
Rsine-G- / H+ + cation+ <=> Rsine-G- / cation+ + H+
forts : acide sulfonique (G- = SO3-)
faibles : acide carboxylique (G- = COO-)

Rsine cationique (changeuse danions) :


Rsine-G+ / OH- + anion- <=> Rsine-G+ / anion- + OHforts : ammonium (G+ = N(CH3)3+)
faibles : amines II ou III

Applications :
- deionisation deau (adoucisseurs)
- sparation
- dosage dions