LA CHROMATOGRAPHIE I) Quest-ce que la chromatographie ?

Cest une mthode danalyse qualitative et quantitative permettant de sparer les diffrents constituants dun mlange liquide ou gazeux. Qualitativement, cela permet didentifier les constituants dun mlange. Quantitativement, cela permet de donner la composition dun mlange. Il existe plusieurs techniques chromatographiques :

CHROMATOGRAPHIE

PHASE GAZEUSE CPG

PHASE LIQUIDE SUR COLONNE DE SURFACE CCM PAPIER

AUTRES

ECHANGE DIONS RESINE

II)

Chromatographie sur papier :

1) Principe : Elle permet danalyser un mlange liquide et didentifier chaque constituant par comparaison. Elle est base sur la diffrence de solubilit dun constituant par rapport deux phases non miscibles. Une phase stationnaire constitue par le papier (fibres de cellulose disposes paralllement imbibe deau). Une phase mobile appele ELUANT qui se dplace par capillarit en entranant les constituants du mlange sur la phase stationnaire. Plus le constituant est soluble dans lluant, plus elle migrera loin sur la phase stationnaire ? Choix de lluant : Le solvant utilis ne doit pas ragir avec les constituants du mlange. Il est donc choisi en fonction de son aptitude dissoudre les constituants sparer.

Quand la migration est termine, on dtermine pour chaque constituant la vitesse de dplacement not Rf Calcul de Rf :

Distance parcourue par le constituant Rf = Distance parcourue par le solvant

2) Manipulation : Les colorants alimentaires sont des additifs alimentaires qui ont un numro de code CEE de 100 199 prcd de la lettre E. On dispose tout dabord dun lot de trois colorants alimentaires : colorant jaune E 102, tartrazine colorant rouge E 122 ,azorubine colorant vert : mlange de tartrazine (jaune E 102) et de bleu parent V (bleu E 131). Dautre part, on dispose de bonbons M et Ms contenant des colorants.

a) Dcouper une bande de papier Whatman n1 de hauteur telle quelle tienne dans la cuve chromatographie (viter de mettre les doigts sur le papier). b) A 2 cm du bord infrieur du papier, placer 1 cm lune de lautre un chantillon de chaque colorant. c) Gratter lgrement la surface du bonbon pour extraire les colorants. Il ne faut pas gratter le chocolat. Dposer les ensuite sur le papier ct des autres colorants. d) Scher la bande avec un sche cheveux puis placer la dans la cuve chromatographie o vous aurez vers auparavant lluant (solution de chlorure de sodium 0,1 % en masse) e) Observer la migration pendant 10 20 minutes. Le solvant doit arriver 2 cm du haut du papier Whatman environ. f) Noter rapidement au crayon le front du solvant et la place de chaque tache. g) Scher rapidement la feuille avec le sche cheveux. 3) Exploitations : a) Mesurer les vitesses de dplacement des diffrents colorants.

b) Ces vitesses sont elles les mmes si le colorant est seul ou mlang.

c) Identifier les colorants prsents dans les bonbons.

d) Dire si lenrobage du bonbon est un seul colorant ou un mlange.

II)

Chromatographie sur couche mince CCM :

Elle fut dcouverte en 1850 par le chimiste allemand RUNGE qui russit sparer des colorants organiques. 1) Principe : Elle repose principalement sur des phnomnes de surface. La phase stationnaire est ladsorbant type alumine ou silicagel. Il est fix sur des plaques de diffrentes natures (verre ; aluminium). La phase mobile est un mlange de solvants dont la composition fixe la polarit. Cette phase progresse le long de la phase stationnaire. Aprs que lchantillon ait t dpos sur la phase stationnaire, les substances migrent une vitesse qui dpend de leur nature et de celle du solvant (ELUTION). La sparation des divers constituants au cours de llution sappelle le DEVELOPPEMENT. Les diffrents produits ne sont, en gnral, pas immdiatement visibles. Il faut les rvler. De la mme faon quen chromatographie sur papier, on dfinit pour chaque constituant, la vitesse de dplacement note Rf. 2) Applications de la CCM : Elle permet un contrle facile et rapide de la puret dun compos organique. Elle est utilise pour rechercher le meilleur solvant, avant dentreprendre une sparation par chromatographie sur colonne. Mthode pour trouver lluant le plus appropri : On prpare des solutions de lchantillon dans diffrents solvants, en concentration denviron 2 5 % en volume. On dpose une goutte de chaque solution sur une plaque. Le meilleur luant est celui qui, lorsquil a termin sa migration, a entran le solut une distance denviron la moiti de celle quil a parcourue. 3) Schma :

Film sur la CCM : 10 min III) Chromatographie sur colonne :

Elle fut dcouverte par le botaniste Tswett en 1906 qui russit sparer des colorants vgtaux 1) Principe : Il sagit dune chromatographie dadsorption dont la technique de sparation des composs est base sur la diffrence daffinits entre la phase mobile et la phase stationnaire.

Dans la colonne, on a un support solide (bille, silice) appel PHASE STATIONNAIRE. La phase mobile est constitue de solvants. Elle sappelle ELUTION. On verse la solution tudier puis lluant utilis. Ce mlange va descendre mais les diffrents composs de la solution tudier vont rester diffrents niveaux de la colonne en fonction de leur affinit. On rcupre, la sortie de la colonne, les diffrents constituants appels ELUAT. On dfinit, un coefficient de partage, qui dfinit laffinit pour la colonne par rapport la phase mobile. 2) Schma :

Film sur la chromatographie sur colonne : 17 min

3) Manipulation : Chromatographie sur colonne :

Prparation de la colonne :

La ralisation dune colonne impose de respecter certaines rgles qui permettront une sparation efficace. On place tout dabord un morceau de coton au fond de la colonne que lon recouvre dluant, afin dliminer lair emprisonn dans le coton. On rajoute un demi-centimtre de sable environ au dessus du coton, afin que la phase stationnaire ne puisse pas schapper de la colonne. On considre ici que le sable na pas de proprits adsorbantes. Enfin, on remplit la colonne avec la phase stationnaire en ralisant une bouillie dalumine dans un bcher (oxyde daluminium+ eau). La bouillie forme est introduite dans la colonne grce un entonnoir. On rince avec de leau et on laisse scouler. Une fois la colonne remplie, on rajoute un demi-centimtre de sable en tte de colonne au dessus de la bouillie, aprs stre assur que cette dernire tait plane. Cette couche permet de raliser des dpts et dajouter lluant sans perturber la surface de lalumine, ce qui empcherait une bonne sparation. On sassure rgulirement de ne pas asscher la phase stationnaire, en vrifiant quil reste toujours de lluant au niveau du sable. Ralisation de lexprience : On amne le niveau de lluant au niveau de la surface du sable. On peut donc dposer dlicatement le mlange : sulfate de cuivre 5% et permanganate de potassium 5% en haut de la colonne. On ouvre le robinet pour que le mlange arrive au niveau de lalumine. On rajoute quelques millilitres dluant et on ouvre de nouveau le robinet afin de sassurer que tout le mlange se trouve en tte de colonne. On peut alors ajouter lluant: leau qui permet llution du permanganate de potassium. Quand on a rcupr tout le permanganate de potassium, on lue avec de lammoniac NH3 pour rcuprer le sulfate de cuivre. Pour ceux qui font la chromatographie de lextrait de menthe, les deux luants utiliss sont : eau sale et thanol Conclusion :

IV)

Chromatographie phase gazeuse CPG :

Cest, en 1941, que Martin et Synge mirent lide que le liquide mobile pouvait tre remplac par un gaz mais les premiers rsultats sont prsents en 1952. 1) Principe : Cette chromatographie est un moyen danalyse qualitative et quantitative des gaz et liquides volatils. Elle est applicable pour des petites quantits et des constituants de mlange complexe. Lchantillon (vapeur ou gaz) est adsorb slectivement par une phase stationnaire et il est entran dbit constant par une phase mobile. La sparation des diffrents constituants est due aux diffrences daffinit des divers constituants pour la phase stationnaire a) La phase stationnaire : Cest un liquide proprits adsorbantes et trs peu volatils (temprature dbullition bien suprieure la temprature de lexprience). Ce liquide est imprgne en faible quantit sur un support solide poreux(lit continu et homogne de granuls).Cette phase stationnaire se trouve dans la colonne.

b) La phase mobile : Cest un gaz inerte appel gaz vecteur (hlium, argon, hydrogne, azote) obtenu partir de bouteilles dont on peut rgler le dbit. Son rle est dentraner de faon uniforme les vapeurs de lchantillon.

2) Principales parties de lappareil et leur rle : a) Schma de principe :

b) Elments constitutifs dun chromatographe : Chambre dinjection : VAPORISATION : On introduit lchantillon grce une seringue par perage dune pastille en lastomre. Linjection doit tre rapide pour obtenir des rsultats rguliers. Le volume inject est de lordre de quelques L pour les liquides et quelques mL pour les gaz. La temprature est rgule de faon maintenir tous les composants de lchantillon ltat gazeux. Dans cette chambre thermostate, se trouve aussi le gaz vecteur appel PHASE MOBILE. Le choix du gaz vecteur est fonction du produit analyser et agit aussi sur lefficacit de la sparation des diffrents composs. Colonne : Elle est place dans un four thermostat. Elle est constitue dune tubulure en acier inoxydable (parfois en verre). Le diamtre intrieur est de lordre de 2 6 mm et la longueur varie de 1 10m. Elle est enroule en spirale pour rduire lencombrement. Elle est remplie de la PHASE STATIONNAIRE. Il existe 2 types de phase stationnaire : 1) Phase stationnaire apolaire : Squalanes : C30H62 sur de la silice hydrophobe : peuvent retenir les hydrocarbures jusqu 150C Apolane : C37H176 : peuvent monter jusqu 260C 2) Phase stationnaire polaire : Carbovax : Polythylne glycol PEG : peut sparer les aldhydes, les ctones et les alccols entre 60C et 220C. Diffrence entre une phase stationnaire polaire et apolaire : On veut sparer un mlange de 4 constituants : heptane :Teb=98C dodcane : Teb=200C thanol : Teb=78C propanol : Teb=97C Les composs dont la temprature dbullition est la plus faible sortent en premier. Ordre de sortie pour une phase stationnaire polaire :

Ordre de sortie pour une phase stationnaire apolaire :

 Dtecteurs : Ce sont des dtecteurs diffrentiels sensibles aux variations de concentration des constituants. Coupl un enregistreur, un dtecteur donne un trac en forme de courbes de Gauss qui forment des pics. Chaque pic correspond au passage dans le dtecteur dun compos de lchantillon analys. Catharomtre :dtecteur conductibilit thermique : Le gaz passe dans un pont de Wheastone. Il faut donc que la diffrence de conductibilit soit la plus grande possible entre le compos et le gaz vecteur. Cest pour cela que lon utilise souvent lhydrogne car sa conductibilit est 10 fois plus grande que celle de tous les autres gaz. Inconvnient : On ne peut pas dtecter la prsence dhydrogne. Ionisation de flamme : Lchantillon est entran par de lazote dans une flamme dhydrogne. On rcupre un certain nombre dions. On impose une d.d.p entre 2 lectrodes, on rcupre alors une tension qui est lie la concentration contenue dans la flamme.

3) Analyse qualitative et quantitative : a) Qualitatif : On peut identifier chaque constituant dun mlange en fonction de temps pour lequel on obtient le pic. Un constituant donn a un TEMPS DE RETENTION not TR donn pour une colonne donne et un dbit de gaz donn..

air

injection

temps temps de rtention TR Cest le temps entre t=0 (injection) et le maximum du pic. Pour obtenir une bonne rsolution, il faut que les 2 pics soient assez loigns (sinon on peut nen voir quun).

Mauvaise rsolution

Bonne rsolution

b) Quantitatif : On peut donner la concentration des diffrents constituants dun mlange en fonction de la hauteur des pics. Analyse dun pic :

4) Manipulation : a) Mthode de dosage : On utilise la mthode de ltalon interne : On impose le passage dune quantit connue dun produit. On connat donc la surface correspondante cette quantit ajoute. On compare individuellement chacun des pics valuer au pic de la substance talon, introduite en proportion connue dans le mlange analyser. Il faut que ltalon ait un pic de valeur de rtention proche de celle du pic mesurer. Intgration sur le dtecteur :

% de X = A(X) X 100 A
4

b) Prparation : Prparer une srie de mlanges contenant, pour 10 mL de solution des pourcentages en volume dthanol variant de 3% 21% dans des tubes essai. A chaque mlange, ajouter toujours le mme volume de propan-1-ol (1 mL).
% thanol Ethanol (mL) Eau dminralise (mL) Propan-1-o l (mL)

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Prparer un tube contenant 10 mL de vin et 1 mL de propan-1-ol. On donne les tempratures dbullition : Ethanol : 78,3C Propan-1-ol : 97C Le chromatographe est mis sous tension : Rglage : Temprature initiale : 150C Temprature finale : 150C Temprature du dtecteur et de linjecteur : 200C I= 70mA Avant toute injection : vrifier le zro (ligne de base) en tournant lgrement le bouton FINE. Rincer la seringue lactone pure (10 fois) Rincer ensuite la seringue avec lchantillon (10 fois) Injection : Injecter 2 L de chaque solution laide de la seringue dans la colonne 2 (attention cest trs fragile). Appuyer sur le bouton START (voie 1) en mme temps que linjection. Aprs injection : Attendre que tous les pics soient sortis (environ 9 min) Quand on est de nouveau sur la ligne de base, appuyer sur STOP (voie1) pour terminer le traitement. Une analyse sur chaque pic est donne et des % de chaque concentration est indique. c) Analyse des chromatogrammes : Quelle mthode pouvez-vous utiliser pour identifier chaque compos partir des temps de rtention obtenu ? Pourquoi certains pics ne sont pas visibles sur le chromatogramme alors que dautres le sont ? Que faut-il modifier pour pouvoir les visualiser tous ? Tracer la courbe aire du pic thanol/aire du pic propan-1-ol en fonction du % en thanol ? En dduire le % en thanol du vin. Pour un % donn, tracer, sur une feuille de papier millimtr, les 2 pics qui nous intressent et mesurer : La largeur du pic W La largeur mi-hauteur Wh Et en dduire : La dviation standard