TP 

2: Extraction et séparation des pigments

chlorophylliens par chromatographie sur
couche mince

Réalisée par :

Hourra fatima zahra

El amrani nourelhouda
 Rappels théoriques
 Les végétaux sont des organismes autotrophes pour le carbone. Ils sont capables
d’effectuer la photosynthèse ; un processus biologique et physiologique se
déroulant dans les chloroplastes et produisant l’oxygène et la matière organique à
partir de matières minérales (CO2 et H2O) et de la lumière.
 Les végétaux sont ainsi capables de convertir l’énergie lumineuse en énergie
chimique (matière organique comme les sucres).

Glucose
Pigments photosynthétiques
6CO2 + 6H2O C6H12O6 + 6O2

Pigments
photosynthétiques 

Les Chlorophylles Les caroténoïdes

La chlorophylle a La chlorophylle b Les Carotènes  Les xanthophylles

(α, β)

A. Les objectifs du TP 

 Extraire les pigments photosynthétiques foliaires
 Séparer les pigments photosynthétiques par chromatographie
sur papier.

B. Principe de la séparation par chromatographie

ascendante sur papier 
Un solvant (phase mobile) migre par capillarité sur un papier filtre (phase
stationnaire) et y traine les composants de l’extrait brut à différentes vitesses. La vitesse
de migration de chaque composant dépend de leur solubilité dans le solvant et de leur
affinité pour le support de chromatographie (phase stationnaire). Plus la solubilité
d’une substance dans la phase mobile est grande, plus il migre rapidement et plus loin
sur le papier. On peut ainsi séparer divers constituants d’un mélange selon leur degré de
solubilité pour le solvant. Cette séparation est une analyse qualitative et les pigments
séparés peuvent servir à l’étude de leur spectre d’absorption (solubilisation dans le
méthanol par exemple)
Pour chaque substance il est possible de calculer son rapport frontal (Rf)
caractéristique. Le Rf est égal au rapport entre la distance parcourue par la substance et
la distance parcourue par la phase mobile sur le papier.

C. Méthode
1- Extraction des pigments
 Découper quelques feuilles bien vertes (Les épinards) dans un mortier.
 Ajouter une pincée de sable, puis commencer à broyer à l’aide du pilon.
 Continuer à broyer jusqu’à obtention d’une solution vert foncé.
 Filtrer sur papier filtre et récupérer le filtrat dans un tube à essai bouché, il constitue
l’extrait brut de pigments.

2-Préparation du solvant de développement

Préparer le solvant de développement en mélangeant dans une éprouvette graduée :

- 10 ml de l’éluant
- 8.5 ml d’Ether de pétrole
- 1 ml d’Acétone
- 0.5 ml de Cyclohexane
3- Préparation de la cuve à chromatographie

Verser le solvant de développement dans la

cuve, la refermer et attendre 10mn afin de
saturer l’atmosphère de la cuve en vapeurs

4- Préparation du papier chromatogramme

 Découper une bande papier mesurant 2cm le large et 24cm de long
 Tracer une traite fine à 2 cm du fond de la bande, ceci est le repère pour placer la
tâ che de chlorophylle
 À l’aide d’une pipette pasteur, déposer une goutte de chlorophylle extraite sur la ligne
de dépô t attendre qu’elle sèche et recommencer plusieurs fois l’opération (environ
10fois) pour obtenir une tache très colorée et la plus petite possible.
 Laisser sécher complètement la tache avant d’introduire le papier dans la cuve.
5-Développement de la chromatographie
 Introduire délicatement le papier dans la l’éprouvette, de façon à ce que son bord
inférieur baigne dans le solvant de développement.
 Placer la cuve à l’abri de la lumière
 Pendant le développement, qui dure environ 30mn, le solvant monte par capillarité sur le
papier en entrainant les composants de l’extrait.
 Arrêter la chromatographie quand les pigments forment des taches distinctes sur le
papier et que le front de solvant est à moins de 2cm du bord supérieur du papier.
 Retirer et sécher le chromatogramme.

6- Calculer les Rf de chaque pigment de l’extrait :

On a le rapport frontal : Rf = h/H

h : hauteur de la ligne de base à la tâ che en cm.

H : hauteur de la ligne de base au front du solvant en cm.

 Sur le chromatogramme qu’on a réalisé :

H : 24 cm h1 =6.1 cm h2 = 9.5 cm h3= 18 cm h4= 23.5 cm

Donc : Rf1= 6.1/24 = 0.25 Rf2= 9.5/24 = 0.39

Rf3= 18/24 = 0.75 Rf4= 23.5/24 =0.94

0.75