Cours de Chromatographie

Historique
 1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, sépare des pigments
végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de
calcium pulvérulent, les pigments sont entraînés avec de l'éther
de pétrole

 1940 : Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la

chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952

 1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse

(CPG)

 1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute

Performance CLHP ou HPLC en anglais

 1979 : première séparation chirale par HPLC

le succès de la chromatographie comme technique analytique
tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés
une méthode séparative rapide et performante et des détecteurs
sensibles et variés permettant non seulement, une
quantification des espèces séparées, mais aussi, pour certains
d'entre eux, une identification des espèces.

De ce fait, la chromatographie se prête bien à l’analyse de

mélanges complexes tels ceux que l’on peut rencontrer dans
des domaines aussi différents que:
- les produits pétroliers,
- les polymères
- les fluides biologiques
- l’analyse de traces dans des milieux aussi variés que
l’étude de l’environnement ou le contrôle de la pureté optique
de molécules thérapeutiques.
- ect…
 Qu’est-ce que la chromatographie?
éluant

Bande initiale avec les

composés A et B

PS tassée dans la
colonne + PM

disque poreux

B A
éluat
 Chromatographie - définition -

Méthode de séparation des constituants d’un mélange reposant

sur les équilibres de concentration qui apparaissent lorsqu’un
composé est mis en présence de deux phases non miscibles
 - La phase mobile tend à entraîner les espèces
à séparer dans son mouvement,
- La phase stationnaire tend à les retarder,
d’autant plus fortement que les interactions mises
en jeu sont plus intenses, nombreuses et plus
énergétiques.

Il en résulte que les analytes ont, pour la plupart, des

vitesses de déplacement différentes et inférieures à celle
de la phase mobile, d’où la notion de rétention et la
possibilité de séparations.
• Phase stationnaire (PS) : immobilisée dans une
colonne ou fixée sur un support plan(CCM)

• Phase mobile (PM) : se déplaçant au contact de la

première, sa vitesse dans la colonne est exprimée :

 en débit,D : volume de solvant traversant la colonne

par unité de temps (mL/min)

 en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la

colonne par unité de temps (cm/min)

• Elution : processus par lequel un composé est entraîné

par le mouvement de la phase mobile à travers la phase
stationnaire
 Chromatographie – classification -
 Selon le phénomène physique responsable des échanges entre PS
et PM :
 adsorption
 partage
 échange d’ions
 exclusion
 affinité
 Selon la nature physique de la phase mobile :
 liquide
 gaz
 Selon l’objectif visé :
 chromatographie analytique
 chromatographie préparative
 Selon le support de la PS
 Chromatographie sur colonne
 Chromatographie su couche mince
 Chromatographie planaire

Les méthodes de chromatographie planaire comprennent:

-la Chromatographie sur Couche Mince: CCM,
-la Chromatographie sur Papier CP et
-l'electrochromatographie planaire.

Une fine couche de phase stationnaire (100 à 250  ) à base de gel de

silice est déposée sur une plaque de verre, de plastique ou d'aluminium.
La nature des phases mobile et stationnaire ainsi que la théorie sont les
mêmes qu'en chromatographie sur colonne.
 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

• La chromatographie sur couche mince (CCM) repose

principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase
mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui
progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque
de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou
d’aluminium.

• Les principaux éléments d’une séparation chromatographique

sur couche mince sont :
- la cuve chromatographique
- la phase stationnaire
- l’échantillon
- l’éluant
 Principe de la CCM

• Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est

placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase
stationnaire, essentiellement par capillarité.

• Chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre

vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une
part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la
plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la
phase mobile.

• Les composés se déplacent donc alternativement de la phase

stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase
stationnaire étant principalement contrôlée par des
phénomènes d’adsorption.

• Généralement, en chromatographie sur couche mince, les

substances de faible polarité migrent plus rapidement que les
composants polaires.
 Principales étapes d’une CCM
1.Choix de l'éluant :

Les éluants : 
Les hydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène.
Les solvants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions
variables avec du benzène ou de l'éther diéthylique forment un éluant
de polarité moyenne.
Les composés polaires : éthanoate d'éthyle, propanone ou méthanol.
2. Dépôt de l'échantillon.

• L'échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas
forcément le même que l'éluant. La solution est déposée en un point de la plaque
situé à environ 1 cm de la partie inférieure.

• Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible.
Il est toujours préférable  d'effectuer plusieurs dépôts au même point, en séchant
rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un
grand volume d'échantillon qui produirait une tache plus large.

• L'échantillon est déposé à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire.

• On vérifie l'identité des composants présumés d'un échantillon, en procédant à un

dépôt séparé d'une solution de chacun d'eux puis à celui de leur mélange. Ces
solutions témoins permettent de comparer la migration de chaque composé avec
celle de l'échantillon à analyser.
3. Développement de la plaque.

• la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant

qui en recouvre le fond monte par capillarité.

• Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve;

on place souvent du papier filtre contre les parois de la cuve pour
saturer plus rapidement la cuve en vapeurs d'éluant et éviter les effets
de bords. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit
demeurer fermée et ne pas être déplacée.

• Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de

l'extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau
atténué par le solvant (front du solvant) est marqué avant le séchage
de la plaque.
Le rapport frontal (B/A) d’un produit donné dépend de nombreux
paramètres :
-nature du revêtement de la plaque CCM (silice ou alumine),
-concentration de l’échantillon,
-nature des solvants d’élution.
 La CCM est utilisée pour séparer des composants dans
un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification
(CCM préparative).
Exemple d’une CCM
 On trace un trait horizontal (la ligne de base) à environ
1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques D, B
et M représentent respectivement le produit de Départ,
le Brut réactionnel et le point Mixte (un mélange de D
et B). Le point mixte permet de mieux visualiser les
taches lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'étape
d'élution est imparfaite.
Détection

● Détection directe pour les composes colorés.

● Une méthode de détection consiste à vaporiser un "réactif", par

ex. une solution d'acide sulfurique ou d'iode, qui réagit avec les
composes organiques pour former des produits colorés.
Des réactifs spécifiques peuvent être utilisés: ex: la ninhydrine en
solution alcoolique pour les acides aminés.

● Les composés qui donnent des taches invisibles doivent être

"révélés". Dans ce cas, la phase stationnaire contient un sel de zinc
qui émet une fluorescence verte quand la plaque est éclairée par une
lampe a valeur de mercure ( = 254 nm).
Tout compose qui absorbe a cette , apparait sous forme d'une
tache sombre sur un fond illuminé en vert.
 Analyse des résultats de la CCM
Revelation aux UV
Pour visualiser les différentes taches, on commence par placer la
plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert
fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme
de taches sombres. On utilise cette méthode de détection en priorité car
elle n'endommage pas la plaque.
Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore
du produit de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a
moins qu'en début de réaction.
On observe la formation d'au moins trois nouveaux produits (1, 2 et
5) : 1 et 2 sont moins polaires que le produit de départ, et 5 est plus
polaire.
 Il semble que le produit 5 est majoritaire dans le brut réactionnel
(le produit 2 est beaucoup moins visible) mais tous les produits ne
révèlent pas avec la même intensité aux UV.
 Revelations par réaction chimique
On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il
existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à
ce que des taches colorées apparaissent.
Ici on observe un autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV.

La tache 1 est à peine visible ; elle l'était beaucoup plus sous
lampe UV.
La surprise vient de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible
en UV mais elle révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort
possible que ce soit le produit majoritaire de la réaction et non le
produit 5 comme le laissait supposer la détection UV.
 Applications et avantages de la CCM
• Elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté
d’un composé organique.

• Elle peut être employée pour suivre la progression

d’une réaction.

• La CCM présent les avantages ci-après :

- la rapidité d'exécution (1 à 2 heures),
- la simplicité d'exécution,
- un coût modeste,
- la sensibilité de l'ordre des microgrammes (ug).
 Phases stationnaires (adsorbants)
• Des oxydes inorganiques comme le gel de silice et l'alumine
sont utilisés
• pour la PS. Les propriétés chromatographiques de ces oxydes
dépendent de la taille des particules, de leur surface
spécifique, du volume spécifique des pores et de leur diamètre.
• Il existe des silices greffées par des groupements attachés par
liaisons covalentes aux fonctions silanols de la surface:
● des greffons polaires: nitrile, amine, alcool.
● des greffons alkyle apolaires utilises en mode inverse: RP8,
RP18, (reversed phase octyl and octadecyl groups).
● des silices C18 greffées imprégnées d'un sélecteur chiral.
● des supports à base de poudre de cellulose utilisés pour la
séparation de composés polaires: acides carboxyliques, acides
amines, phosphates..
Par ordre d’importance décroissante, les adsorbants employés en CCM
sont : le gel de silice, l’alumine et la cellulose.
- Insolubilité totale dans les solvants et éluants utilisés;
- Inertie chimique vis à vis des solvants et des substances à
chromatographier.

La silice SiO2
Son pouvoir adsorbant est dû à son caractère acide, polaire et à la
possibilité de former des liaisons hydrogène ce qui explique son
emploi courant surtout dans le cas de la chromatographie des
composés polaires.

Du fait de son caractère acide, la silice retient fortement les

composés à caractère basique et pour éviter cela, les sites acides
sont masqués soit par une base (soude ou potasse ) soit en ajoutant
aux éluants de petites quantités d’amines ou d’ammoniaque.
Surface du gel de silice sec et hydraté
L’alumine (AL2O3)

• Elle est obtenue par précipitation des sels d’aluminium par

les bases fortes ; elle est donc à caractère plutôt basique.

• Elle s’hydrate facilement au contact de l’air (très

hydrophile) ce qui nécessite une température assez élevée
(environ 200°).
 CCM Bidimmentionnelle
Deux élutions successives sont effectuées dans deux directions avec
deux éluants différents. Apres développement avec un solvant, la plaque
est retiree, séchée, tournée de 90 degrés puis développée avec un autre
solvant.
 Description d'une expérience de CC

Le composé jaune interagit peu avec la phase fixe, il est donc peu
retenu; il sort le premier, entraîné par le débit de la phase mobile.
 éluant

Bande initiale avec les

composés A et B

PS tassée dans la
colonne + PM

disque poreux

B A
éluat
 Chromatogramme
signall

Temps (min)
Si , en bout de colonne, on place un détecteur qui répond à la
concentration du soluté,on obtient un graphique d’une fonction de la
concentration en soluté en fonction du temps.c’est le chromatogramme
En considérant la nature de la phase stationnaire et son interaction
avec les molécules de soluté, les séparations chromatographiques
sont classées en 5 principaux types:

1. Chromatographie de partage en phase normale ou inversée

2. Chromatographie d'adsorption
3. Chromatographie d'exclusion stérique
4. Chromatographie sur échangeur d'ions
5. Chromatographie d'affinité
6. Electrochromatographie

Rem. L'efficacité d'une colonne augmente quand la taille des

particules de support diminue et donc que la hauteur équivalente a
un plateau théorique diminue.
 Chromatographie en phase liquide

type phase stationnaire

adsorption solide poreux

solide à la surface duquel se trouvent des sites
ioniques
échange d'ions qui permettent à l'aide d'un solvant approprié
l'échange
liquide/solide d'ions présents dans la phase mobile
d'exclusion
(filtration sur solide dont la dimension des pores permet la
gel, séparation
perméation de des espèces selon leur taille
gel)

partage solide poreux inerte enrobé de liquide

phase normale (de moins en moins utilisée)
liquide/liquide
partage solide poreux sur lequel sont greffées
phase inversée des chaînes hydrocarbonées non-polaires
 1.Chromatographie de partage
Le mécanisme de séparation est le partage entre la PM
et la PS.

La PS peut être un film liquide imprègné sur un

support (silice) mais il a tendance a être emporté avec la
PM ("lessivage", "bleeding"), ou une phase organique
fixée par liaison covalente sur un support (gel de silice)
(phase greffée).

On distingue deux types de chromatographie de

partage selon les polarités relatives des phases mobile
et stationnaire:
Chromatographie à polarité de phase normale
(mode normal ou direct):

La phase stationnaire est polaire, de nature hydrophile,

avec des groupements: amine: NH2 , nitrile: CN,
dialcool ou diol: (CHOH)CH2OH, greffés sur la silice.

La phase mobile est un solvant apolaire, de nature lipophile

: l'hexane ou l‘éther isopropylique

Le soluté le moins polaire est élué en premier.

Rem:
- alkyles: C8: (CH2)7CH3 et C18:(CH2)17CH3 , apolaires;
- phenyle: (CH2)nC6H5 apolaire
Chromatographie à polarité de phase inversée
(reversed phase, mode inverse)

C'est la phase stationnaire, constituée souvent d'un hydrocarbure

qui est apolaire, de nature lipophile, avec des chaines alkyles de
C4 à C30 , des groupements propyle, phényle, diphényle.

La phase mobile est un solvant polaire, tel l'eau, le méthanol, ou le

cyanure de méthyle (acétonitrile).

Les colonnes C18 sont remplies de silice greffée en phase inverse

C18 , ou "gel de silice C18" : SiOSi(CH3)2(CH2)17CH3 ;

les colonnes C4 sont utilisées pour séparer les peptides et les

protéines, les C30 pour les caroténoides et les flavanoides.
 La chromatographie de partage est basée sur la
différence de solubilité des substances à séparer dans
deux fluides non miscibles. Le facteur principal qui
intervient est le coefficient de partage entre chaque
phase. On ne peut séparer que des solutés dont les
coefficients de partage entre les deux phases sont
différents.
Le gel de silice
● C'est un solide amorphe, un polymère inorganique de formule
SiO2(H2O)n avec n proche de 0, la silice naturelle cristalline étant
de formule: SiO2.. La structure est de type tétraédrique avec
groupements silanol: SiOH

● Il est très polaire. Avec un éluant apolaire, les solutés polaires

sont retenus dans la colonne, contrairement aux solutés apolaires qui
sortent en premier.

● Le mécanisme d'action du gel de silice repose sur l'adsorption.

● Avec les particules de faible diametre, d ~ 2 μm, la surface de

contact , la HEPT et l'efficacite de la colonne .
Des molecules d'eau
peuvent se fixer par liaison
hydrogene pour former un
gel + ou - hydraté
OH-----OH2
Si-OH : fonction silanol

(CH3)2Si O : groupement diméthylsiloxane (de

silicium, oxygène et alcane)

Si - O - Si : pont ou liaison siloxane

SiH4 : silane (cf. CH4 méthane)

• L'intérieur de chaque grain de silice est composé
d'atomes de silicium reliés entre eux par des atomes
d'oxygène (un silicate).

• En surface, des groupes silanol (Si–OH) subsistent et

sont responsables de la très forte polarité du gel de
silice. En présence d'eau, cette surface s'hydrate ce
qui provoque une diminution de la polarité.

• Les grains de gel de silice sont poreux et la taille des

grains et des pores sont responsables de la surface
spécifique du gel.
 Le gel de silice comporte des pores de différentes dimensions

a) Les particules sont homogènes; b) Le xerogel

la porosité : 50%
le diamètre des pores :10nm;
la surface de contact (surface
spécifique):150 m2/g.
(porosité=Volume vide/ Vtotal)
Sa porosite : 70%;
sa surface de contact : 300 m2/g
Diamètre des pores : 10nm.
Les phases stationnaires greffées

Le gel de silice est hydrophile. Ses caractéristiques évoluent dans

le temps, ce qui conduit a un manque de reproductibilité.

Pour diminuer sa polarité, il est rendu hydrophobe par fixation

par liaison chimique de molécules organiques sur les fonctions
silanol. Le gel de silice devient alors un support de la phase
stationnaire.

L'oxyde de zirconium ZrO2 , l'oxyde de titane TiO2 ou l'alumine

Al2O3 peuvent remplacer le gel de silice en qualité de support.
La séparation met alors en jeu des coefficients de partage et non
des coefficients d'adsorption.
Ces phases greffées dont la polarité est ajustable, sont utilisées
dans la : chromatographie liquide phase greffée .
La plupart des supports à phase greffée sont constitués de
siloxanes:

SiOH + Cl-SiR(CH3)2 Si-O-SiR(CH3)2 + HCl

réaction de silanisation

● Si R = groupement alkyle ou greffon alkyle en C8 (noctyle):–

(CH2)7CH3ou en C18 (noctadecyle): – (CH2)17CH3:
la phase greffée est apolaire.
Plus la chaine est longue, plus le soluté est retenu et plus Tr ↑. La
PM (solvant) est polaire: méthanol, eau. Les solutés polaires sont
élués en 1er.

● D'autres types de greffons peuvent être greffes sur du gel de

silice: des porteurs de fonctions aminopropyle, cyanopropyle...
ou des greffons dipolaires.
La polarité de la phase greffée augmente.
Fig. Groupements fonctionnels R des organosiloxanes greffés.
 Chromatographie d'adsorption ou liquide-
solide

l'adsorption est un phénomène d'interface : lorsqu'à la

surface du gel de silice on greffe une monocouche
d'hydrocarbure, les molécules, qui présentent une partie
lipophile et l'autre hydrophile, s'orientent à l'interface.

Les séparations sont basées sur le principe de polarité

c'est à dire l'existence de dipôles.
● Il existe un mécanisme d'adsorption du soluté par la phase
stationnaire solide et un mécanisme d‘élution (désorption) par la phase
mobile liquide ou gazeuse.

● Dans le processus d'adsorption sur une surface, les liaisons sont de

faible énergie: liaisons hydrogène, dipôle-dipôle ou de van der Waals.

● La PS solide, appelée adsorbant est trés finement divisée.

● La capacité d'adsorption des adsorbants peut être:

faible (carbonate de calcium) ou forte ( silice, alumine, charbon).

● La polarite des adsorbants peut être:

faible (charbon) ou forte ( silice SiO2; silice sous forme hydratee: gel
de silice avec fonctions silanol SiOH; alumine Al2O3, nH2O).

● La PM est constituée d'un mélange de solvants de polarité voisine de

celle des solutés (2 à 4 solvants peuvent être utilisés).
Les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc... jouent
un rôle dans l’affinité qu’ont les molécules pour l’une ou l’autre
phase.
Fig. Pouvoir éluotropique (0) de solvants en chromatographie liq-sol sur alumine
 Les solvants
Le tableau précédent donne des valeurs de pouvoir éluotropique
de solvants quand l'alumine est l'adsorbant. Avec un autre
adsorbant, par exemple la silice, l'ordre des pouvoirs éluotropiques
reste le même, mais les valeurs sont différentes.

Le solvant ne doit pas réagir chimiquement avec l'adsorbant ni le

soluté. Il est rare qu'un même solvant puisse permettre l'adsorption
et l‘élution. Des solvants différents sont choisis en fonction des
solutés a séparer.

Quand l'adsorbant est polaire, le solvant doit être le moins polaire

possible. L‘élution est commencée avec des solvants peu polaires
puis continuée avec des solvants de polarité croissante.
 Interactions entre le composé à analyser et les deux
phases:
• Lorsque les solutés sont neutres, l'ordre d'adsorption
sur un adsorbant polaire comme le gel de silice ou
l'alumine est le même que celui présenté pour les
solvants. Les solutés apolaires  (ex: alcanes) sont peu
adsorbés alors que les solutés polaires (ex: méthanol)
le sont fortement.

• Par contre, on utilisera de préférence l'alumine pour

séparer des solutés basiques comme les amines et le
gel de silice pour les phénols et les acides car les
solutés acides sont fortement adsorbés par l'alumine
alors que les solutés basiques le sont par la silice
.
• On parle de chromatographie liquide/solide (LSC)
lorsque l’éluant est un liquide et de chromatographie
gaz/solide (GSC) lorsque l’éluant est un gaz vecteur.
 3. Chromatographie d'exclusion stérique ou tamisage
moléculaire

- filtration sur gel, quand la PS est hydrophile (la PM est

une solution aqueuse)
- perméation de gel quand la PS est hydrophobe (la PM un
solvant organique).

Cette technique qui a débuté en 1959, permet de séparer des

macromolecules selon la taille et donc le poids moléculaire
(100 à 10 000 000 daltons).
 pores

particules poreuses du gel réticulé de la

PS (polymère réticule en 3 dimensions)
dp = 4 à 300 μm

La PM entraine l'ensemble des molécules. Les molécules de

soluté de petite taille se repartissent dans les pores et a
l'extérieur des pores.
● Les molécules de taille supérieure à celle des pores des
particules ne pénètrent pas. Elles sont "exclues" et éluées
en premier.

● Les molécules de taille < à celle des pores pénètrent.

Leur temps de séjour dans les pores dépend de la
dimension des molécules

● La séparation est optimale quand la distribution en

taille des pores correspond à celle des macromolécules à
analyser.

● Le solvant pénètre dans tous les pores des particules et

dans le volume interstitiel entre les particules
Le mécanisme d'exclusion stérique est fondé sur l’équilibre
thermodynamique entre deux phases :
- le solvant interstitiel dans le volume mort V0
- le solvant contenu dans le volume poreux Vp.

le volume d’élution Ve d’une macromolécule est défini par :

K=f(taille des particules, taille des pores)

K varie de zéro, pour les grosses molécules exclues du gel (aucun
accès aux pores du gel), à l’unité, pour les molécules en
perméation totale (accès total au volume poreux).

Les plus grosses sont éluées en premier à V0.

les plus petites sont éluées en dernier à V0 + Vp.
• Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de Sephadex sont
totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le volume extérieur aux billes,
c'est-à-dire dans la phase mobile (éluant). Elles sortent les premières, à un volume
d'élution Vo appelé volume mort de la colonne.
-Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de Sephadex peuvent
pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans l'ensemble des liquides de la
colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes ou phase stationnaire + volume de
liquide à l'extérieur des billes ou phase mobile). Elles sortent donc les dernières, à un
volume d'élution Vt ou volume total des liquides de la colonne.
-Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en fonction de
leur taille et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles sont plus grosses, et
elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires décroissantes
• 1 : Les molécules de masse molaire faible sortent toutes à V t.
3 : Les molécules de masse molaire élevée sortent toutes à V o.
2 : Les molécules de masse molaire intermédiaire sortent à des V e intermédiaires et
sont effectivement séparées.

Applications de la chromatographie d'exclusion :

-Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou de petites
molécules dans les solutions protéiques : DESSALAGE

-Cette technique est également appliquée au FRACTIONNEMENT de MELANGES de

MACROMOLECULES et à la DETERMINATION (approximative) de la MASSE
MOLAIRE des protéines. Dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des
protéines de masse molaire connue, tracer la courbe V e = f(logM), puis effectuer une
détermination graphique.
Le tracé du logarithme de la masse molaire moyenne de divers
polymères en fonction du volume de rétention (calculé à partir
du temps de rétention expérimental et du débit choisi) permet
d'établir la courbe d'étalonnage
un dalton = 1/12 m(C) = 1 u u=unite de masse atomique;
●un acide aminé de protéine ≃110 Da
●une base d'ADN avec ribose et phosphate ≃330Da
4. La chromatographie ionique ou par échange d'ions

C'est une technique de séparation des ions a l'aide de

résines échangeuses d'ions.

● La PS est constituée d'un support insoluble dans l'eau sur

lequel sont greffes des groupements fonctionnels ionisés.
La PS échange des ions avec la phase mobile.
Il se crée des interactions dipolaires avec les molécules de
solutés.

● Plus la charge portée par un soluté est grande, plus le

soluté est retenu par la phase stationnaire.

● La séparation repose sur les coefficients de distribution

ionique entre les deux phases.
● Les échangeurs de cations ont une PS constituée d'un polymère
organique greffé avec des groupements acide sulfonique SO3H (acide
fort, fort échangeur de cations) ou acide carboxylique COOH(acide
faible, faible échangeur de cations): La colonne est appelée
cationique.

RSO3- H + (s) + M+ (aq) RSO3- M+ (s) + H+ (aq)

● Les échangeurs d'anions ont une PS greffée avec des groupements

ammonium: amine tertiaire N(CH3)3+ OH- ou amine primaire
NH3+ OH- : colonne anionique.

RN(CH3)3+OH-(s) + A-(aq) RN(CH3)3+ A-(s) + OH-

(aq)
 Résine cationique : qui échange réversiblement des cations. Une
résine cationique est chargée négativement.

Résine-G- / X+   +   cation+   <=>   Résine-G- / cation+   +   X+

Résines anioniques : qui échange réversiblement des anions. Une
résine anionique est chargée positivement.

Résine-G+ / Y-   +   anion-   <=>   Résine-G+ / anion-   +   Y-

  ► Résines cationiques fortes

Résine sous forme acide : Résine sous forme sodique :

Résine-SO3- / H+ Résine-SO3- / Na+
(contre-ion : H+) (contre-ion : Na+)

► Résines cationiques intermédiaire

Résine-H2PO4- / H+ Résine-H2PO4- / Na+

► Résines cationiques faibles

Résine-COO- / H+ Résine-COO- / Na+

 ►Résines anioniques fortes

- résines à groupements aminés quaternaires.

- résines à groupements aminés tertiaires.

►Résines anioniques faibles

-résines à groupements aminés secondaires et primaires.

 Exemple de résine échangeuse d'ions :
Les résines polyosidiques chargées de type Sephadex :

Ces échangeurs sont utilisés pour la séparation de macromolécules

ionisées : protéines, acides nucléiques...

Echangeurs anioniques Sephadex :

• Echangeurs cationiques Sephadex :
Capacité de rétention d'un échangeur d'ions

C'est le nombre de millimoles (mmol) d'ions que la

résine peut échanger par unité de masse. On l'exprime
par gramme de résine sèche (ou moins souvent par
unité de volume : par ml de résine humide).

Élution

L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de

densité de charge et de concentration plus élevée on
utilise de petits ions fortement chargés : Cl-, HO-,
Na+, H+...
• L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs
facteurs:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même

dépend :
- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution

• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:

- de la charge de cet ion c'est-à-dire :
- de la nature de l'ion (pKa, pHi)
- du pH de la solution
- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il
est chargé, ou/et qu'il est petit)

• de la concentration des ions

• de l'accessibilité des groupements fonctionnels (porosité et

granulométrie)
 Séparation d'anions sur une colonne échangeuse d'anions

Fig. Chromatographie ionique: chromatogramme et instrumentation

 L'instrumentation en HPLC
L'instrumentation de la CLHP comprend:
• un réservoirs : système d'introduction du solvant,
• vanne mélangeuse de solvants,
• pompe, amortisseur de pulsations, contrôleur de débit
• une vanne d'injection dans la colonne qui permet d'introduire la phase
mobile en haut de la colonne de manière continue sans pulsations et avec un
débit volumétrique et une pression connues.

L'instrumentation doit permettre l'utilisation de colonnes de différentes

dimensions et fonctionnant dans des conditions variables.

Du côté des basses pressions se trouve un détecteur qui doit montrer une
grande sensibilité et une réponse rapide

Le fonctionnement optimal de tous les appareils est obtenu a l'aide d'un

contrôle informatique
 sparger=barboteur,

Clapet de sortie Amortisseur de pulsations

Vanne doseuse

Régulateur de pression
Vanne d'injection

Fig. Appareil de Chromatographie Liquide a Haute Performa

Fig: CHROMATOGRAPHE HPLC
Réservoirs

• Un appareil de CLHP comprend un ou plusieurs

réservoirs, en verre ou en acier inoxydable résistants a la
corrosion et contenant les solvants.
• Des gaz ambiants comme l'oxygène, peuvent être dissous
dans les solvants, former des bulles dans la colonne et
créer des perturbations dans la détection.
• De même des poussières en suspension peuvent perturber
les séparations et gêner le bon fonctionnement des
pompes et des détecteurs.
Il est donc souhaitable de dégazer et de filtrer les solvants.
L’oxygène est souvent nuisible à l’analyse chromatographique :

• il augmente le risque de dégradation des échantillons et abrège la

durée de vie des colonnes car les phases stationnaires sont
facilement oxydables.

• il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le

détecteur ce qui conduit à un bruit de font important et rend
l’analyse impossible.

• il diminue le seuil de détection lors d’une analyse par

spectroscopie d’absorption à faible longueur d’onde, par
fluorimétrie ou par électrochimie.

• il contribue à la corrosion des pièces en contact avec la phase

mobiles. La corrosion augmentant avec la pression, les pistons et
les joints des pompes sont souvent en saphir, agate, Téflon ou en
alliages spéciaux.
Dégazage des solvants HPLC
Un des systèmes de dégazage est basés sur un barbotage de gaz inerte
dans la phase mobile (de moins en moins utilisé) Après dégazage, le
réservoir à solvant doit rester fermé et saturé en gaz inerte pour éviter :

- toute évaporation de solvant pouvant entraîner une modification de

constitution de la phase mobile dans le cas de mélange de solvant

- la dissolution dans la phase mobile de vapeur d'eau et de CO2

L'emploi d'hélium comme gaz inerte est le plus courant.

Actuellement, la tendance par les constructeurs d'HPLC est

l'utilisation d'un dégazeur en ligne sous-vide.
Le dégazage de la phase mobile est une opération obligatoire en chromatographie
phase liquide. Il se fait par barbotage d’Hélium dans la phase mobile.
Pompes

Le système de pompage doit:

● Atteindre des pressions élevées: ~200 bars (20 000kPa) ou plus
● Etre exempt d'impulsions
● Imposer des débits reproductibles de 0,1 a 10 ml/min
● Résister à la corrosion et aux solvants.
● Permettre de délivrer un éluant de composition fixe en mode
isocratique ou de composition variable pour travailler en gradient
d‘élution. L‘élution effectuée avec un seul solvant de composition
fixe, constante, est appelée "isocratique". La séparation est
améliorée par une élution avec programmation de solvants ou
"gradient d‘élution". Deux ou plusieurs solvants de polarité
différente sont utilises. Les fractions volumiques des solvants sont
modifiées selon un programme préetabli.
Injecteurs d'échantillon

● Injecteur à dépôt direct

• L'injection du soluté se fait a l'aide d'une seringue a travers
un septum ( cloison séparant 2 cavités). La reproductibilité
de cette technique est 2 à 3%.

● Vanne à boucle
• Très utilisée. Des pressions de 600 bars peuvent être
atteintes. Des boucles interchangeables permettent d'injecter
des volumes entre 10 et 100 L. Certaines vannes
d'injection ont des volumes de boucle de 0,5 à 5 L et
descendent même à 40 nL.
La reproductibilité est bonne si la boucle a été complétement remplie.
 L’injecteur à boucle
- permet des injections répétées qui donnent des résultats très
reproductibles et donc adaptés aux analyses;
- peut supporter des pressions élevées

Injecteur à boucle. À gauche, le remplissage de la boucle. À droite, l’injection dans la

colonne.
Colonnes
• Elles sont le plus souvent en acier inoxydable ou en verre quand les
pressions sont < 40 bars.
• Le diamètre intérieur des colonnes conventionnelles varie de ~ 4 à
10 mm, la longueur de ~5 à 30 cm.
• Une colonne trés utilisée a les caractéristiques suivantes :
L = 25 cm, d(intérieur) = 4,5 m, d(granulométrie) = 5 m.
nombre de plateaux théoriques: N= 40 000 à 60 000/ mètre

• Il existe des microcolonnes à haute performance et à grande vitesse :

L= ~ 3 à 7,5 cm ; d(intérieur) = ~1 à 4,5 m,; et d(particules) = ~3
à 5 m. Elles possèdent jusqu‘à 100 000 plateaux par mètre.

avantages:
- une colonne courte permet de faire des séparations plus rapidement;
- une colonne étroite permet une économie de la phase mobile.
● Colonne de garde (guard column)
Une précolonne courte (0,4 a 1 cm) précède la colonne.
Elle est remplie avec la même phase stationnaire et la
même densité de remplissage et elle sert a retenir des
impuretés en provenance de l‘échantillon, de la pompe ou
de la vanne d'injection. La durée de vie de la colonne
principale est ainsi allongée.

● Colonne thermostatée
Les variations de température ont une influence sur les
temps de rétention.
Les appareils de chromatographie sont alors équipes avec
des dispositifs de régulation qui contrôlent la température
Détecteurs
• Il n'existe pas de détecteur universel comme en chromatographie
en phase gaz: détecteurs à ionisation de flamme et à conductivité
thermique.
En CLHP,
• les détecteurs sont spécifiques à chaque application.
• Le volume de détecteur CLHP doit être le plus faible possible afin
de diminuer l‘élargissement des bandes.
• Il existe des détecteurs de propriétés de la phase mobile qui
dépendent de la présence d'un soluté: indice de réfraction,
constante diélectrique, densité.
• Et des détecteurs de propriétés du soluté, que ne possédent pas la
phase mobile: absorbance dans l'ultraviolet, fluorescence ou
courant de diffusion,…
• Détecteurs d'absorption dans UV-Vis
• Détecteurs d'absorption dans l'infrarouge
les larges bandes d'absorption de l'eau et des alcools empêchent
l'utilisation de ce détecteur infrarouge
dans de nombreuses cas.
• Détecteurs de fluorescence
• Détecteurs réfractométriques
Ils mesurent la différence d'indice de réfraction entre la phase mobile
et la phase mobile avec l‘échantillon. Ils nécessitent une température
régulée a 0,01°C, car les indices de réfraction varient avec la
température.
• Détecteurs électrochimiques
Leur fonctionnement est base sur l'ampéromètrie, la polarographie, la
coulomètrie et la mesure de conductivité.
• Détecteurs par spectrométrie de masse
Techniques de multidétection
La détection est souvent multiple avec couplage:
• spectroscopie UV / réfractométrie;
• réfractométrie/diffusion de la lumière;
• réfractométrie/viscosimétrie;
• diffusion de la lumière multiangles / viscosimétrie
La chromatographie en phase liquide sur colonnes est devenue un outil analytique
performant utilisé dans des domaines variés allant de l'analyse de fluides biologiques à
celui des produits pétroliers lourds.

Ce développement est dû à la fois à une meilleure compréhension des mécanismes

d'interaction aux grandes efficacités obtenues avec des phases stationnaires de plus en
plus fines (3 mm) et enfin aux progrès importants effectués dans le domaine de
l'appareillage, en particulier pour la détection.

La CPL se présente ainsi comme une méthode de séparation complémentaire de la

chromatographie en phase gazeuse (CPG) pour l'analyse de solutés peu volatils ou
thermodégradables (cas de la majorité des molécules thérapeutiques). Elle se distingue
de la CPG par la variété des phases stationnaires et partant des interactions mises en jeu
et par une température moins élevée, ce qui accroît la force de ces interactions et
augmente la sélectivité.

En revanche, la CPL est une méthode de mise en œuvre plus délicate que la CPG ; de
plus, malgré les progrès récents, elle souffre encore de l'absence de détecteurs aussi
sensibles et universels que la détection à ionisation de flamme de la CPG.
 Les grandeurs de rétention
Temps de rétention
C’est le temps que met le soluté à sortir de la colonne c’est à dire le temps
écoulé entre l’injection et le maximum du pic du composé élué. C'est la
principale grandeur de rétention.
Il est noté tR (en minutes)
Il varie en fonction du débit, de la température d'élution, de la composition de
la phase mobile et du vieillissement de la colonne.

Temps mort
Il est noté tM ou t0 (en minutes)
C'est le  temps que met un soluté non retenu à sortir de la colonne.
En HPLC, c'est également le temps mis par la phase mobile (l'éluant)  pour
traverser la colonne.

Temps de rétention réduit

On ne prend plus comme origine l’injection mais le pic du temps mort.
Il est noté t'R et est égal à t'R = tR-tM
 Le volume de rétention
Le volume de rétention Vr correspond au volume de phase mobile
nécessaire pour éluer le produit S. Si D est le débit de la phase
mobile (D supposé constant) :

 Vr = tr * D.   
Le  volume  mort.
On appelle volume mort Vm le volume de phase mobile qui
passe à travers la colonne pour aller d'une extrémité à l'autre de
la colonne (pendant le temps tm). Autrement dit, Vm est le
volume occupé par la phase mobile dans une colonne.
           Vm  = tm * D.    

Volume et temps de rétention réduits

On appelle volume de rétention réduit V'r, la différence entre les
termes Vr et Vm.
            V'r = Vr - Vm      
Le facteur de rétention (ou de capacité).
Le facteur de rétention k' pour un produit donné est défini comme
suit :
ou également 
 
Ce qui donne : Vr  = Vm(1 + k’)    et  tr  = tm(1 + k’)

c'est le rapport du temps passé par le soluté dans la phase stationnaire

sur le temps passé par ce même soluté dans la phase mobil
Le facteur de sélectivité 

Ce facteur de sélectivité ou de séparation, sans dimension, est égal

au rapport des facteurs de capacité de deux solutés dont on veut
réaliser la séparation. Il s’exprime comme ceci :
La résolution R
La résolution est une mesure de la qualité d’une séparation.
Deux caractéristiques déterminent le degré de recouvrement des pics:
a) la distance séparant les sommets de deux pics mesurée par tr2 -
tr1;
b) la largeur des pics à la base l.

25,00
25,00

20,00
20,00

15,00
15,00

10,00
10,00

5,00
5,00

0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bonne résolution R>1 Mauvaise résolution R<1

Le nombre de plateaux théoriques N
C’est un paramètre qui sert à mesurer la performance d’une
colonne à distillation fractionnée

l = largeur du pic à la base w = largeur du pic à mi-hauteur

La hauteur équivalente à un plateau théorique h est :

où LC = longueur de la colonne
et N = nombre de plateaux théoriques

Pour des colonnes de même longueur, celles où les équilibres se réalisent le plus
rapidement sont celles où le nombre de plateaux théoriques est le plus élevé ou sont
celles dont les HEPT sont les plus basses.
 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

-La phase stationnaire est un liquide à haut point d'ébullition uniformément réparti
sous forme d'une pellicule mince sur un solide inerte de grande surface spécifique.

-La phase mobile est un gaz inerte (N2, He, Ar,...)

-Les solutés à analyser sont injectés à l'état pur ou en solution.

-Les quantités de produit injectées sont de l'ordre de quelques µl (2 à 3 µl).

Schéma de principe d'un appareil chromatographie en phase gazeuse
Description d'un chromatographe.
 Principe du phénomène de migration dans une colonne de
chromatographie en phase gazeuse

Constitution d'une colonne

C'est généralement un tube d'acier inox rempli de grains fins (granulométrie bien définie
pour obtenir un remplissage homogène de la colonne) constitués d'un support inerte (terres
de diatomées, billes de verre,...) recouvert d'un film liquide, à haut point d'ébullition, appelé
phase stationnaire. Dans le cas d'une colonne capillaire, la phase stationnaire est directement
déposée sur la paroi interne de la colonne.

La colonne est balayée en continu par un courant de gaz vecteur à débit constant
(pression constante).
Comportement d'un soluté A entrant dans la colonne (capillaire)

Un soluté A pénétrant dans la colonne à l'état vapeur et arrivant au contact de la

phase stationnaire va se partager entre les deux phases. A l'équilibre on peut écrire :

K = [A]s / [A]v

K étant une constante sa valeur dépend de la température de la colonne et de la

nature de la phase stationnaire.
 Sous l'action du gaz vecteur le soluté A à l'état vapeur va migrer dans la colonne
ce qui va détruire l'équilibre précédent et impliquer le passage d'une partie du
soluté A de la phase dissoute vers la phase vapeur.

Ce processus se développant tout au long de la colonne le soluté fera des sauts

de puce jusqu'à l'extrémité de la colonne c'est-à-dire le détecteur.

processus de séparation d'un mélange de deux solutés A et B

 L'injecteur

Cette opération est faite

- à l’aide d’une micro seringue - pour les liquides et les solutions
- à l’aide d’une vanne à boucles - pour les mélanges gazeux
- La température de l'injecteur sera toujours supérieure d'environ 20°C à la
température d'ébullition du composé le moins volatil du mélange à étudier.

- L'injection de la solution étudiée se fera à l'aide d'une micro seringue (quelques

µl ) elle sera franche et rapide pour éviter les phénomènes de traînées (1 µl dans
le cas de colonnes capillaires). On pique au travers du septum, afin que
l’extrémité de l’aiguille arrive au-dessous du niveau de l’arrivée du gaz porteur,
puis on pousse le piston pour réaliser l’injection
 Détecteurs en CPG
-Catharomètre
• Le détecteur le plus utilisé en CPG est celui à conductibilité thermique appelé
catharomètre. Sa température est généralement la même que celle de l'injecteur. Il
est à réponse universelle, mais relativement peu sensible.
• Il est fondé sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emporté par
le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emporté par le gaz vecteur chargé des
molécules de soluté.
• la conductibilité thermique du gaz vecteur (qui traverse le détecteur) varie
chaque fois qu’un constituant X traverse le détecteur.

Caractéristiques:
- moyennement sensible;
- non destructif;
- économique et d'entretien facile;
- sensible aux changements de
température et de débit
- Détecteur à ionisation de flamme (FID)

C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais moins

universel, car il ne donne de réponse qu’aux composés organiques

Il a aussi l’inconvénient, contrairement au catharomètre, de détruire le

soluté qui le traverse, car son principe est de brûler, dans une flamme
d’hydrogène, l’effluent apporté par de l’azote (gaz vecteur).

Sous l’effet d’un champ électrostatique, il se forme des ions carbone de charge positive qui sont
précipités sur une électrode où ils créent un courant d’ionisation que l’on amplifie grâce à un
électromètre amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient par conséquent un signal
proportionnel au débit-masse du soluté dans le détecteur
Caractéristiques du FID:
- très sensible;
- montre une réponse linéaire en fonction de la masse de soluté;
- sensible aux changements de température et de débit;
- non sélectif - universel;
- destructif - les substances sont brûlées.
 -Détecteur à capture d’électrons
Une source telle que le tritium (3H) ou le (63Ni) envoie des électrons libres dans le détecteur.
Quand ce détecteur est traversé par des substances ayant une affinité pour les électrons
libres, il se produit des ions qui, comme pour le détecteur à ionisation de flamme, dans le
champ électrostatique existant, sont recueillis par une électrode et forment un courant
d’ionisation à amplifier convenablement.

-Détection par spectroscopie infrarouge

-Détection par spectrométrie de masse
Le couplage du chromatographe et du spectromètre de masse est simplifié du fait de la
nature de la phase mobile qui est gazeuse. Le problème réside dans les différences de
pression qui existent entre les deux appareils ; le chromatographe fonctionnant à
pression atmosphérique et le spectromètre de masse sous un vide très poussé. Pour
maintenir ce vide dans les cas où le débit est relativement grand et pour éviter que le
vide se fasse dans la colonne, on intercale un séparateur à jet moléculaire
Performances des détecteurs
Colonne
• C'est l'organe principal. Elle est constituée d'un tube généralement métallique
de diamètre intérieur de l'ordre du millimètre.

• Ce tube contient la phase stationnaire constituée par un liquide adsorbant fixé

sur un solide inerte

• On distingue les colonnes à remplissage proprement dit, constituées d’une

tubulure en verre, acier ou autre métal (les plus fréquentes sont en acier
inoxydables), dont les dimensions varient de 2 à 6 mm pour le diamètre
intérieur et de 1 à 10 m pour la longueur.

• Le support remplissant la colonne est constitué de grains dont les dimensions

varient de 60 à 70 μm; ils sont à base soit de matériau réfractaire soit de silice
• On utilise aussi des adsorbants organiques à haut poids moléculaire. Ce sont
des copolymères (du type styrène + divinylbenzène). Ils ont l’avantage de
permettre toutes sortes d’analyses
Colonne capillaire
Les colonnes capillaires sont des colonnes de diamètre interne inférieur à 1
mm dont la phase stationaire est déposée sur la paroi interne. Leur longueur est
de plusieurs dizaines de mètres.

Les colonnes sont droites mais très flexibles, d'où un conditionnement facile
pour les installer dans un four de chromatographie. Le diamètre intérieur des
colonnes commercialisées varie de 0,10 mm à 0,53 mm. Leur longueur peut
être de 10 m, 25 m ou 50 m.
Les avantages principaux des colonnes capillaires sur les colonnes remplies sont :
-très grande efficacité,
-analyses plus rapides,
-perte de phase stationnaire ("bleeding") moins important,
-meilleure limite de détection.
Cependant, si les avantages sont importants, il y a aussi quelques inconvénients :
-très faible capacité d'échantillonage (volume introduit 10 fois plus faible,
proche de 0,1 microlitre) d'où...
-nécessité de détecteurs très sensibles
-techniques d'injection spéciales
 Les techniques colonnes remplies et colonnes capillaires sont complémentaires : les
colonnes remplies sont moins coûteuses et sont mieux adaptées à l'analyse en ligne. Les
colonnes capillaires permettent des séparations impossibles avec des colonnes remplies
et permettent aussi des analyses rapides.
Colonne remplie Colonne capillaire
Caractéristiques des colonnes remplies:
- diamètre interne : 1/8" (3,2 mm) ou 1/4" (6,4 mm)
- longueur : 0,5 à 3 mètres
- tube :
acier inoxydable - assez inerte et bon conducteur de chaleur
verre - inerte mais mauvais conducteur de chaleur

Garnissage pour chromatographie gaz-solide

granulé polymérique de gel de silice traitée à très haute température ou par un procédé
hydrothermique par lequel il est possible d'obtenir des pores de dimensions voulues. La surface
de ce matériel poreux peut atteindre 500 m2/g.
polymère organique du type éthylvinylbenzène-divinylbenzène qui possèdent des pores dont
le diamètre varie de 0,0075 a 0,8 mm.

Garnissage pour chromatographie gaz-liquide

support solide poreux et inerte imprégné d'un liquide non volatil appelé phase stationnaire qui
peut être de nature diverse .
nature du support - surtout gel de silice
- peut être actif s'il possède beaucoup de groupements -Si-OH libres
- peut être désactivé par réaction avec le dichlorodiméthylsilane ou le diméthylsilazane.
- lavé à l'acide pour enlever les oxydes métalliques, en particulier les oxydes de fer
- lavé par une base pour permettre la chromatographie de substances basiques.
L’efficacité des colonnes remplies est limitée par:
- la dispersion des molécules du soluté dans les diverses trajectoires à travers les grains;
- la différence de rétention provenant de la non uniformité de la répartition de la couche
stationnaire sur les grains

L’efficacité des colonnes capillaires ne dépend que de la vitesse de passage

dans la phase stationnaire.