Chromatographie liquide à haute 

performance (CLHP ou HPLC ) 

Partie 1
(du début au titre A. les colonnes page 15/43) 

1. Principe :  
➔ il ne faut pas qu'il y ait d’affinité entre PM et PS sinon la PM va être retenue et ne pourra pas se 
déplacer  
 

K= Cs/Cm​  
Le prof a expliqué pourquoi en disant que puisque la substance se trouve dans la PM initialement (on va voir 
comment) donc le rapport serait :  
Concentration dans l'extrait/ concentration dans le raffinat  
Et a dit que l'extrait est la PS et le raffinat c'est la PM. 
Mais ce que je comprends pas toujours : est ce que la loi de K du cours de la séparation à contre courant étais une faute 
ou bien c'est juste parce que c'était l'inverse de celle là.  

● C'est quoi la différence entre un pic chromatographique et un spectre ? 

Un pic chromatographique​ = nous donne une seule donnée sur la substance à analyser

Un spectre chromatographique​ = (balayage de plusieurs pics) nous donne plusieurs données sur la substance à analyser
et c’est pour ça on préfère le spectre

Un pic chromatographique se caractérise par sa surface qui dépend de la quantité à analyser, ce qui a permis de passer 
de l'identification à la quantification par les méthodes chromatographique​ ; 

Mi=Ki×Ai​  
Mi :​quantité de la substance 
Ai (ou Si)​: surface du pic donné par cette substance 
-->Cette relation est linéaire  

Par exemple :​on a un échantillon dont on veut déterminer la quantité : 

➔ On fait un étalon et on enregistre les 2 pics  
On a​ M(éch.)= K.(éch.) × A(éch.)​et M ​ (étalon.)= K(étalon.) × A(étalon) 
➔ On fait le rapport entre les 2 relations --> ​M.éch/M.étalon = A.éch/A.étalon (​la constante Ki se simplifie vu que 
c'est la même substance )  
➔ on connaît M.étalon, A.éch et A.étalon --> on calcule M.éch 

2. Classification des méthodes chromatographique : 

● Place de la chromatographie phase liquide:  
On a dit dans le cours passé que c'est une classification selon la PM car c'est elle qui peut être gaz supercritique 
(intermédiaire entre gaz et liquide.) , ou liquide  
● La chromatographie Sur papier :  
On a un papier filtre , on fixe au niveau de ses pores une PS , quand on filtre la PM, la substance traverse les 
pores; les solutés qui ont plus d'affinité pour la PS restent sur le papier et les autres passent avec la PM --> séparation  
Les types d'interactions sont déjà vus dans l'introduction  
   
 Explication du tableau :  
● Partage  en  phase  normale  =  PS  polaire  (PM  ● Échange  d'ions  :  si  on  a  une  PS  de  groupement 
peu/moyennement polaire)  (+),  la  PM  doit  avoir  la  même  charge  (+)  ,  et 
● Partage  à  polarité  inversée  =  PS  apolaire  (PM  l'échantillon  charge  (-)  -->  séparation  en  fonction 
polaire)  de l'affinité ionique 
● Appariement  d'ion=paire  d'ion  :  pour  toute  sub 
ionisée ou ionisable par variation du pH. 
 
❏ La différence entre appariement d'ion et échange d'ions:  
c'est le même principe sauf que dans l'échange d'ions la PM doit être ionique et la PS aussi doit avoir des 
groupement ioniques. Mais dans l'appariement d'ions, pas forcément que ça soit PM ionique mais PM tamponnée 
(ou tamponne j'ai pas bien compris ce qu'il a dit)  
c’est à dire : on aura besoin d'un tampon pour fixer le pH de la PM, et ce n'est que pour les substances qui 
s'ionisent en fonction du pH. 
Les types les plus utilisés sont: adsorption, partage, et appariement d'ions 
La relation de V ​ an Deemter​nous renseigne sur le mécanisme de séparation à l'intérieur de la colonne) 

3. HPLC :  
❏ Conception générale d'un appareil CLHP:  
● Nous avons la PM​ (​ par exemple: Acetonitrile, H​2​O, méthanol)​: les 3 les plus utilisés en chromatographie 
liquide) 
● La pompe aspire les proportions de chaque solvant en fonction du réglage (exp. Pour 100 ml prélever 70% 
H​2​O, 25% méthanol, 5% acétonitrile)  
● À la sortie de la pompe y aura mélange des 3 solvants. Dans l'injecteur on injecte l'échantillon par une seringue 
(manuellement ou automatiquement) 
● Le four est utilisé pour garder la température à 37 C et garder la substance telle qu'elle est dans l'organisme 
(pour avoir les mêmes caractéristiques physico-chimiques)  
● Ce qui est en​ v​ ert​c​ 'est le détecteur : la détection par réfractométrie (qui mis en jeu l'indice de réfraction) c'est 
pour les sucres, qui ne peuvent pas être analyser par UV (n'absorbent pas)  
● Le dégazeur est utilisé pour éliminer les bulles d'air qui influent la pression (la pression en HPLC est un 
paramètre très important où on ne peut pas aller au-delà de 420 (le débit aussi))  
● Ce qui est en b ​ leu​c'est un tuyau en acier inoxydable au sein duquel se fait le dégazage  
❏ Système d'injection :  
Pour qu'on puisse simplifier les Ki dans la relation des surfaces et la quantité de l’échantillon, il faut que : 
➔ le volume injecté de l'éch. = volume de l'étalon injecté (ce qui pose problème car tout ce qui est manuel 
ne peut pas être réalisé à 100%)  
➔ 2ème chose c'est la pression → Et donc il nous faut un système rassurant par rapport aux volumes en 
échantillon et en témoin injectés et par rapport à la maîtrise de la pression  
Ce système est L ​ A VANNE D'INJECTION​: il y a des vannes de 10, 20, 50, et 100 (les plus utilisés sont à 20 et 50)  
● Position load (repos) :  
La  vanne  est  à  6  trous.  L'échantillon  est injecté du trou mentionné et suit le chemin qui mène à la sortie (pour remplir 
la  boucle)  si  par  exemple  la  vanne  est  à  20  µl  et  qu'on  injecte  30,  les  10µl  qui  sont  en  excès  vont  être  éliminés  par  la 
sortie (en r​ ouge​) --> problème des volumes réglé. 
La PM traverse la vanne en allant vers la colonne sans passer par l'échantillon (vous voyez son chemin)  
● Position inject :  
On active la position “inject” de façon à ce que la PM passe par l'échantillon qui se trouve dans la boucle pour aller 
vers la colonne  
Ce système résiste à la pression et injecte la substance dans la colonne (Pour mieux comprendre je vous ai mis le lien 
d'une petite vidéo à la fin) ​lien vers la video 
 ● Les colonnes :  
❏ Les supports solides : 
Quand on dit que la PS est à l'intérieur de la colonne ça ne veut pas dire que toute la quantité c'est la PS , la 
poudre blanche qu'on a vu au tp c'est pas 100% PS, mais aussi un solide inerte qui fixe la PS -->c'est le support solide 
(on l'a vu en CCM c'était le liant). 
Généralement la PS est de 6 à 12% seulement par rapport au support 

Partie 2
● Phase stationnaire utilisée : 
❏ Le gel de silice est préparé s/f de : 
A. Microparticules sphériques :​d ​ans l'équation de ​Van Deemter​on a vu que le paramètre qui dépend de la 
taille des particules c'est le terme A qui nous renseigne sur le phénomène du remplissage (colonne bien remplie 
et avec une faible taille de particules --> A tend vers 0)  
➢ Mais on ne peut pas aller au-delà de 3µm car il y aura une forte pression et la pression en HPLC n'est pas bonne (ne 
dépasse pas 400 bar) sinon le système sera être détruit  
➢ Y'avait un travail sur un système qui peut aller plus loin et qui résiste à la pression : c'est UHPLC (Ultra-HPLC) 
avec une taille < 2µm qui peut aller jusqu'à 1,5µm et la pression 1600 bar. 
➢ C'est la technologie des méthodes chromatographiques liquide qui est à la base une HPLC 
➢ Donc la différence est :  

● HPLC: particules ≥ 3 μ m et pression entre  ● UPLC: particules < 2 μ m et pression jusqu'à 

300-350  1200-1600 bar 
 
➢ C'est à travers les pores que se font les échanges en terme de liaisons chimiques avec l'échantillon . C'est là où il est 
retenu par les groupement. et passe à travers car le solide (en rose) n'a aucune affinités. 
➢ les pores sont soit sur toute la particule soit en surface avec un noyau poreux …. comme le montre le s 
➢ Cette notion de porosité conditionne la vitesse de passage de PM (son écoulement), → c’est à dire : le choix de la 
colonne à tel ou tel type de particules (particules aux pores sur toute la particule ou pore sur la surface) dépend de 
ce qu'on cherche : le choix de la bonne colonne fait partie du développement analytique (choix de la PS)  

B. Monolithes poreux : P ​ S ⇒ une seule pièce sous forme de gel poreux (pas de particules)  
Le nombre et le diamètre des pores conditionne le passage de la PM, la pression, le débit....  

❏ Le gel de silice greffée :  

➢ À la base le gel de silice est solide ; quand on fait le greffage il devient presque un liquide immobilisé. → C’est à dire 
: en chromatographie Liquide -->​ la PM doit être liquide  
➢ Et la PS peut être soit solide (phase normale sans greffage) soit liquide quand on fait le greffage (pas totalement 
liquide mais son comportement est comme celui d'un liquide)  
➢ Après le greffage on a le coefficient de partage et pas de coefficient d'adsorption (si vous remarquez dans le t​ ableau 
p8/43​: dans l'adsorption la PM est solide et dans le partage que se soit phase normale ou inversée la PM est 
liquide) c’est à dire avec le gel de silice greffé y aura phénomène de partage au lieu d'adsorption  
   
Méthode de greffage​: 
Silanisation : m​ ême en CPG. c'est la chromatographie dérivée, on fixe un groupement sur un autre pour 
masquer quelque chose (ici on masque la polarité).  
En bleu:​c'est le gel de silice avec ses groupements silanols avec lesquels on fait réagir une organosilane à 
fonction réactive X (en ​rouge​)  
X = Cl, OCH3(méthoxy) , ou OC2H5 (éthoxy)   Le R c'est des chaînes de carbone (CH3, 
  C2H5,C3H8...) --> masquer le caractère acide et 
  polaire de la PS  
 
Selon le radical R on a:  
➡P ​ S POLAIRE ​: on a masquer le OH mais le R est un groupement qui reste polaire ,on a donné cette notion de 
liquide à la PS et en même temps joué sur la polarité. Probablement le gel était de polarité =20 après greffage --> = 15 
ou 12 et peut diminuer jusqu'à 3 .tout dépend de la substance.  
● On ↘ la polarité soit en changeant le H par les radicaux.. comme on peut jouer sur le nombre des OH  
● Quand on fait le greffage il est impossible d'avoir un rendement de 100% .par exp. J'ai 1000 grpmt OH on 
masque 500 (50%)..si on ↗ un peu le rendement on masque 700 OH et la colonne devient plus chère  
● Donc le nombre de OH masqué conditionne la polarité et le prix de la colonne  
● --> c'est la chromatographie liquide de partage en phase normale  

➡​PS APOLAIRE :​greffage de groupements alkyl (aliphatiques) ou phényle (cyclique) --> chromatographie liquide 
de partage en phase inverse. 
Explication du Tableau :  
Les 2 chaines de C qui assurent une stabilité de PS, un bon rendement de greffage, une inertie chimique, avec une 
polarité maîtrisée c'est C8H17 et C18H37 (octyle et octadecyl)  

NB:​ ​à chaque fois qu'on commence le développement analytique ,après chaque analyse on doit 
reconditionner la colonne en faisant passer une PM simple (généralement eau ou eau+méthanol) 
pour éliminer les impuretés ou les sub. qui ont formulées la PM en terme de phase tampon​née  

END CAPPING :  

Après la silanisation au moins 50% des silanols sont libres (c’est à dire : pas de greffage = adsorption qui est un 
phénomène chrom. supplémentaire) , on les élimine par un trt au TMCS ​ --> c'est le ​end capping  

● Phase mobile : 
Pour choisir la PM adéquate on voit la polarité de la molécule à analyser .. si le pic prend du temps pour apparaître on 
doit travailler sur comment l'accélérer par:  
● ↗ de polarité de la PM si le composé est polaire  
● ↘ la polarité de la PM si le composé est faiblement polaire (Pour l'éluer plus rapidement)  
Schéma p26/43 :​i​l montre seulement qu'en phase normale (NPC) la PS est polaire (on voit les OH ) la PM est 
donc apolaire. Et en phase inverse (RPLC ) la PS est apolaire (on voit les radicaux C8/C18/phényle ) la PM est donc 
polaire  
❏ Utilisation d'un mélange binaire :​(en HPLC on n'utilise pas 1 seul solvant mais un mélange) 
● Solvant A :​ c'est le solvant qui sert bcp plus pour l'écoulement (pas responsable des échanges)  
Solvant B: c​ elui qui conditionne l'affinité de la sub. par rapport à la PM  
● Si en NCP on utilise l’hexane comme solvant A ,le B est plus polaire que l'hexane (dichlorométhane)  
● Et en phase inverse le solvant B (acetonitrile, methanol, THF)est plus polaire que le solvant A (l'eau ou la 
phase aqueuse tamponnée ) 
   
 Exp.​phase inversée: 95% H2O avec 5% d'acétonitrile ou 80% H2O avec 20% methanol 
phase normale : 80% hexane et 20% dichloromethane  
Exp.​P28/43 :​chromatogramme analysé par une colonne amine (phase amine = PS polaire = PM apolaire à base 
d'hexane)  

➢ Propriétés des solvants utilisés en HPLC : 

Polarité des solvants:  
Snyder est une classification des solvants polaires par rapport à l'hexane (qui est apolaire)  
● Ɛ0: ​quand on fait le greffage (masquage) on n'aura plus la notion d'adsorption mais c'est le phénomène de partage. 

● Par contre quand il y a adsorption c'est beaucoup plus la notion d'Ɛ0 pas de polarité P' qui est mise en jeu)  
● Chaque solvant en chromatographie est classé par son pouvoir d'élution .ce pouvoir dépend d'Ɛ0 dans le 
phénomène d'adsorption ou la polarité P' dans cas du phénomène de partage  

● Polarité P' :​(ses paramètres sont à savoir pas à retenir)  

-2 ≤ indice de polarité < 10,2  
La viscosité : i​l faut contrôler ces paramètres de façon à ne pas dépasser les 350 Bar (perte de charge convenable)  
Compatibilité avec les syst. de détection :​il faut pas que les solvants de la PM absorbent à la longueur d'onde de 
travail  

➢ Les mode de travail :  

Mode isocratique ​:​durant toute l'analyse la PM choisie ne change pas  
Mode à gradient d'élution :​​c'est le changement au cours de l'analyse des proportions de la PM pour bien séparer les 
pics : par exemple on a 65% H2O 35% acetonitrile ..après la séparation du 1er composé on change les proportions avec 
60% H2O et 40% acetonitrile pour séparer le 2ème composé etc..  
Exp. P37/43  
Isocratique ​:​75 min pour séparer le mélange avec beaucoup de confusion (1,2)  
Gradient d'élution : en changeant le gradient les pics sont bien résolus et on gagne du temps (30 min au lieu de 75) (on 
gagne aussi du solvant bien sûr )  

● Les détecteurs:  
Universels​= pour la plupart des substance 
Spécifique :​spectro UV-VIS est le plus utilisé (si on a une sub. qui n'absorbe pas dans l'uv ..pour la détecter on utilise 
une PM qui absorbe, et on programme le spectrophotomètre de façon à donner un signal quand il y a un composé qui 
n'absorbe pas. C'est comme en CCM : si la PS est fluorescente --> tâches noires sur fond lumineux et inversement )  

4. Applications pharmaceutiques : 
L'HPLC est rarement utilisée pour l'identification, c'est généralement en association pour renforcer 
l'identification des méthodes spectrales  

● Essais : 
Monographie d'une pharmacopée de l'analyse des substances apparentées : ALLOPURINOL​ (p 42/43)​vous voyez 
les indications L de la colonne 0,25m (25cm) diamètre 4,6 mm  
PS : dp=5um (c'est une phase inversée type de radical : C18 (octadecyl)  
Détection débit etc..  
Pour l'enregistrement : pour qu'on soit sûr qu'il reste aucune impureté qui n'a pas été détectée on analyse sur un 
temps 2× le temps d'analyse de mon PA qui existe dans les solutions témoins càd si par exp mon pic de la solution à 
examiner sort à 7min ..on arrête l'analyse à 14 min  

● Dosage​: 
Mêmes indications de l'essai des substances apparentées (pour la même substance) avec modification pour l'injection  
SCR (stéréo-chimie de référence) : c'est le témoin pur à 100%  
‫ﺑﺎﻟﺘﻮﻓﯿﻖ ﻟﻠﺠﻤﯿﻊ و ﺗﻘﺒﻞ اﷲ ﺻﯿﺎﻣﻜﻢ‬