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Section 2 item 5

CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUIDE - HPLC

Introduction

1 Appareillage
1.1 Rservoir de PM
1.2 Pompe
1.3 Dispositif dinjection
1.4 Les colonnes
1.5 La phase stationnaire
1.6 Les dtecteurs
1/Spectrophotomtrique +++
2/Fluorimtrique
3/Rfractometre
4/Condutimtre
5/Electrochimique
6/SM

2 Diffrents types de chromatographie liquide


2.1 Chromatographie dadsorption (S/L)
2.2 Chromatographie de partage (L/L) +++
En phase normale
En phase inverse
2.3 Chromatographie par changes dion
2.4 Chromatographie par appariements dions ou paire dions
2.5 Chromatographie dexclusion-diffusion
2.6 Chromatographie daffinit

3 Choix dune mthode chromatographique

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1 Appareillage
2 grands type dappareillage :
o La chromatographie Classique :
Granulomtrie > 10m
Appareillage simple :Tube en verre avec plaque en verre fritt la base ou
tampon de coton
substances descendent le long de la colonne selon affinit
recueil de lluat par petites fractions
Mais :
peu sensible
long
peu danalyse de trace ou dosage

o La chromatographie haute performance (HPLC)


Granulomtrie entre 2-10 m
Meilleure efficacit et rsolution
Trs utilis +++

Structure gnrale dun HPLC :

A : rservoir de PM
B : Vanne lectro
magntique
de mlange des PM
C : Pompe
D : Egaliseur de pression
E : Chambre de mlange
F : Injecteur
G : colonne
H : Unit HPLC
I : Dtecteur
J : Interface PC

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1.1 Rservoir de PM
Flacon tanche (1 2L)
Parfois fois munis dun syst de dgazage (vite bulles dair)

Diffrents modes :
o mode isocratique = PM de compo cte au cours lextraction
(analyse possible avec 1 seul rservoir)
o mode programmation de solvant (+ cplxe)
=gradient de polarit (ncessite pls rservoirs)

NB : les appareils pouvant travailler en prog peuvent travailler


en isocratique mais ce nest pas rciproque

1.2 Pompe
Fonctionne / piston alternatif (svt pls pistons) Assure un dbit cst
Appareil gradient de polarit :
o syst de vannes EM proportionnelles qui permet les mlanges des solvants en amont
dune pompe unique (ces vannes souvrent en tps proportionnel)

Qualits :
-pas de pulsation
-rsiste la corrosion
-dbit constant

Schma Huguette gradient de PM

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1.3 Dispositif dinjection


Injection manuelle ou automatique avec un passeur dech
P leve en tte de colonne dc impossible dinjecter la seringue comme en CPG
Syst dinjection particulier Injecteur boucle :
o vanne boucle dchantillonnage ,command manuellement
o Vol : 1 100l
o Assure des injections trs rptables
o Ces boucles ont des volumes variables
o La boucle peut tre mise en communication par des vannes avec le rservoir de m et la
colonne

Remplissage de la boucle P atm


Le trop plein est rejet vers lext
Pdt cette tape , la m circule en permanence sur la colonne.
Puis injection du contenu de la boucle en tournant la vanne dinjection ,la m est mise en
communication avec la boucle et la colonne

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1.4 Les colonnes

Tubes droits en acier inoxydable


5 30 cm de long
3 4.6 mm de interne (auj ,en a de 2 mm)
qlq fois , on place en amont une colonne de garde =petite colonne courte (1 2 cm ) remplit avec
la mme s que la colonne analytique

1.5 La phase stationnaire (voir type de chromato correspondante)


Situe dans la colonne
2 types de PS :
o PS imprgnes :
Phase solide de silice retenant sa surface les composs
Surtt utilis en chromato dadsorption (S/L)

o PS greffes +++
Formes par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et
des molcules organiques de nature varies
Le plus courant = dimthylchlorosilane
Les carac de la PS greffe sont dtermines par la nature du gt grffs
Mais 50 des silanols ne seront pas greffes (encombrement strique) Pics
dyssymtrique
Bonne efficacit, mais utilisable quentre ph2 et 8

Constitue de grains de 3 10m de de nature poreuse


Cette s dpd des sparation raliser
-silice
-silice greffe de gpmts polaires ou apolaires ,changeur dion ou gel
-zirconium (moins bonne efficacit mais utilisable entre pH1 et 12)
Cette s est retenue ds colonne par des disques poreux (fritts ) aux 2 extrmits de la colonne

1.6 Les dtecteurs

Doit fournir une rponse qui reflte en continu les variations de compo de lluat la sortie
Choix en fct des composs analyser

Qualits requises :
o linaire = rponses proportionnelles la conc chaque instant
o sensible
o rponse rapide, reproductible, et stable ds le tps
o peu de bruit de fond (variation alatoire de la ligne de base)
o limite de dtection faible compatible vec les rsultats attendus
o Volume mort le plus rduit possible

a- spectrophotomtrie +++

Le + courant pour les composs qui absorbent ds UV-visible (doubles liaisons)


o soit directement (si gpt chromophore)
o soit aprs drivation
soit pr colonne
soit post colonne
on mesure labsorbance 1 ou pls
La m ne doit pas absorber cette
Ces dtecteurs peuvent tre ut en gradient dlution
Rgi par la loi de Beer-Lambert :
A=LC

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NB : 2 substances des conc tes peuvent donner une mme auteur de pic (dpd )

a-1. dtecteur monochromatique (spectrophotomtrie)

source UV-visible syst monochromateur ( max) L=trajet optique de la cuve (c*


circulation)=m dtecteur (photomultiplicateur ou photodiode)
permet analyse quantitative chromatogramme choisie
ne permet pas de trac spectre instantanment ,trac point point :1Aire 1 ,2aire 2...
le spectre enregistr est celui ds la l
cd identique celui pris en dissolvant lech ds m

a-2. dtection polychromatique (dtecteur barrette de diodes)

permet enregistrer les signaux ttes les instantanment


source polychromatique traverse c* de mesure en permanence
absorbe +/- en fct des proprits
la sortie , rseau (polychromatique ) qui disperse les
l intensit chaque est enregistre sur une barrette de diode
chaque diode enregistre ds un petit domaine de
info en 3D

A en fct du tps et en fct de


A=f(T)spectre du compos au tps T (qualitative)
A=f(t) donne chromatogramme

info qualitative (spectre) et quantitative (calcul des aires)

b- spectrofluorimtrie

substances fluorescentes (directement ou aprs transformation chimique)


=m* planes ,rigides doubles liaisons conjugues
me
I=Kc analyse quantitative (cf. fluorimtrie 2 anne)

Source UV excitation slectionne / filtre ou monochromateur c* la sortie de la colonne


dmission (filtre) photomultiplicateur

Avantages :
-trs sensible
-trs slectif

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peu ut ds analyse pharma ,


srtt en analyse bio
et en analyse environnementale
aprs transformation en gnral (seulement 5% des substances sont fluorescentes)

c- dtecteur rfractomtrique

bas sur mesure en continue de lindice de rfraction de lluant


rponse base sur la ce dindice de rfraction vs luant (n) et m (no)
dtecteur universel :rpond ts les composs )
peu sensible
non utilisable en gradient dlution (variation de lIr (indice de rfraction) de la m
trs sensible aux variations de T (fluctuation de la rponse
assez peu ut (srtt substance qui nabsorbent pas ds UV )
analyse des sucres

d- dtecteur conductimtrique

bas sur la conductivit des ions


proportionnelle leur conc
analyse des ions

e- dtecteur lectrochimique

bas sur la prop dun compos tre oxyd ou rduit par une lectrode porte un potentiel donn
trs dlicat employer
ut pour analyse des catcholamines : absorbent peu ds UV
facilement oxydables llectrode

f- spectromtrie de masse

permet didentifier compos par leur spectres de masse ,coteux mais trs sensibles
ut en pharmacocintique pour identifier mtabolites
ut ds centres de recherche pour identifier les impurets

g- Autres

-IR
-Radioactivit
-Polarimtrie
-chimioluminescence

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2 Diffrents types de chromatographie


2.1 Chromatographie dadsorption

Ce mode de chromatographie met en jeu un mcanisme d'adsorption du solut sur la phase


stationnaire solide et un mcanisme d'lution (dsorption) par la phase mobile (luant).
Adsorption = Solide liquide
PS = silice (alumine + rarement) =a bsorbant (solide)
SiO2caractre acide trs polaire
Ut pour trait compos caractre basique
Gel de silice ,rseau 3D

3 types de sites :
o silanols (OH) libres
o silanols lis /LH
o ponts siloxanes
o silanols libres hydrats
o gel de silice fortement hydrats
les sites actifs qui ragissent sont les silanols libres et silanols libres faiblement hydrats et lis
/LH
selon ltat dhydratation de la silice ,les sites sont bloqus
la surf , compet vs m* de solut et m* de solvant de la m
ce sont les soluts polaires qui vont se fixer

solut solvant

site

SA
Surf de silice

a- Mca dadsorption (compet sur SA)

ou partage vs eau fixe sur site et m


chroma de partage
la fixation se fait avec nergie dadsorption forte des composs polaires sur les sites actifs silanols
libres (- forte sur silanols lis ,libres avec une m* dH2O)
cest leau qui contrle lactivit de ces SA

b- Rtention et rgle dlution

Rtention fct :
o du solut :
nrj dadsorption des gpmts fonctionnels
encombrement strique

o de ladsorbant :
surf spcifique
granulomtrie
porosit
teneur en eau (activit)

o du solvant :
forme luante :solvants classs daprs leur force dlution vis vis de la s
elle suit la polarit pour la chromato dadsorption

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solvant faible :dplacement difficile du solut fix sur SA

solvant fort : dplacement facile

srie luotrope : solvant classs du moins polaire au + polaire ,mme ordre pour silice et alumine

ther de ptrole (le = faible)


hexane
THF force luante croissante sur silice et alumine
Ethanol
Mthanol
Eau (le + fort)
F

Chromato dadsorption PM peu ou moyennement polaire = mlange de solvants miscibles +


acide ou base (silice 2<pH m<8.5)

Ex :
-R COOH ajout acide pour obtenir forme m* non ionis
-R NH2 + base ou alcalode

rgle dlution :
-silice = polaire substances polaires les + retenues
caractre polaire de m (ex :ajout H2O) rtention

c- Optimisation de la slectivit de la PM

Optimiser la force luante o


o la capacit de la PM changer na rien voir avec force de lluant capacit vv PS
o des solvants ou mlange ayant mme force luante peuvent avoir 1 slectivit te
(interaction tes)

slectivit : fct de la nature des solvants qui rent par leur capacit
o accepteur de protons Xe
o donneur de protons Xd
o caractre dipolaire Xn

Classement des solvants en fct de leur polarit triangle de slectivit de Snyder :


o 8 groupes de solvants Ds 1 mme gpe les solvants ont mme caractre
o tt solvant un certain % Xe ,Xd ,Xn
o =100%

Schma snyder

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Ex :
o Chloroforme = gpe 8
o Et Acide tertiobutylique gpe 3
o Ont la mme force luante mais une slectivit te car ds gpes opposs ,interactions
polaires tes

Chloroforme 25% Xe 41% Xd 33% Xn


ac. Tertio butylique 56% Xe 20% Xd 24% Xn

P = polarit mlange solvant = (P solvant x fraction volumique solvant)


P ther hexane (52.48 ;v/v) =2.8 x 0.52 + 0 x 0.48 = 1.46
mlange chloroforme (P=4.1)-hexane(36.6 ;v/v)
mme P (1.4) mais
P mesure le pouvoir de solvatation dun solvant et se compose de 3 paramtres Xe ,Xd ,Xn

Dmarche ds optimisation :
o au dbut : solvant S polaire + solvant P ngligeable (type hexane) dont on fait varier le %
pour assurer une rtention des composs convenable
o on calcule P de cette m
o si insuffisant ,on remplace S par un autre solvant S de prop tes de S (loign de S ds
triangle) en gardant le mme P

NB : important : la valeur de P utilise ici nest valable que pour la chromato dadsorption
Elle varie si s nest pas polaire

Pb avec silice :
-sparation peu reproductible si teneur en eau non contrle
-inutilisable en gradient de polarit
-ut limite en CLHP sur colonne

2.2 Chromatographie de partage


Partage = liq-liq
Mcanisme de partage entre solvants que constituent respectivement par la PS et la PM.
La PS peut tre constitue par un film liquide (non miscible avec la phase mobile bien sr)
imprgn sur un support rigide (silice) ou fix par liaison covalente (phases greffes++).

PS = silice dont la surf a t modifie par greffage covalent (prsence de silanols rsiduels )
fig 17 18
CH3 CH3
SiOH = Cl-Si-R Si O Si R
CH3 CH3

o R polaire : fct diols ,phnyle ,amine ,nitrile


o R apolaire : chane alkyle C8 ,en C18 , phnyle
+ chane apolaire longue + silice greffe a caractre apolaire

greffage nest jamais une raction totale silanols non grffs


phno dadsorption srtt pour compos basique
pour lim trane de pics , ractif pour cacher ces sylanols rsidu endcapping =recouvrement
les silices greffes ne sont ut en gnral qu pH 2.5 et 8 :
o pH acide : hydrolyse de la chane
o pH alcalin ,la silice se dissout
o actuellement des silices qui peuvent rsister des pH acide

v Si R polaire et m polaire que s chromato de partage en normale (NP)


v Si R apolaire et m + polaire chromato de partage polarit de invers (RP =reverse )

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Rtention en chromato de partage fct :


o Du solut
o De la s (polarit)
o Du solvant (polarit

Une bonne phase mobile doit avoir 2 proprits :


o Une force luante telle que le facteurs de capacit des soluts soit compris entre 2 et 5
pour un mlange simple, 0,5 et 20 pour un mlange complexe
o Une bonne slectivit pour le couple le plus difficile sparer.

2.2.1 En phase normale

a) rtention et rgle dlution

substance P les + retenues (idem chromato dadsorption sur silice P)


PS = polaire
PM :
o solvant apolaire (Hexane ,heptane ,cyclohexane ,isoctane)
o + solvant peu polaire ou polaire (= modificateur polaire = chloroforme ,dichloromthane
,THF ,thanol ,ACN ) pour rgler force luante la teneur en solvant polaire augmente
en mme temps que la force luante de la PM

rgle dlution #silice : de caractre polaire de m rtention


Plus un compos sera polaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard.
eau = solvant le + fort
Force luante = Eau > MeOH > ACN > THF

b) mcanisme de partage

on suppose que sur silice greffes aminopropyles que le solvant le + polaire de la m solvate les
greffons polaires aminopropyles
qd injecte solut ,il se partage vs greffon solvat/m =partage liq/liq du solut S :greffon
solvat/m

c) Optimisation de la slectivit de la PM

idem chromato dadsorption


dmarche : mel solvant polaire avec solvant dpourvu de force luante (polarit ngligeable)

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2.2.2 Polarit de phase inverse

a) rtention et rgle dlution

les substances les + apolaires sont mieux retenues


PS = apolaire ou peu polaire (greffon R = polaire)
PM = moyennement polaire ou polaire (+ polaire que s)
o Mlange dun solvant polaire auquel on ajoute un solvant polaire qui rgle llution (on
lappelle modificateur organique)
o mlange ACN (actonitrile) et/ou MeOH (THF qlq fois ut) + eau ou tampon

Valeurs de P redfinies :
o THF P=4.5
o ACN P=3.2
o Mthanol P=2.6
o Eau P=0

Plus un compos sera apolaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard.
Force luante = THF > ACN > MeOH > eau

b) mcanisme de partage L-L

2 thories proposes sur silice greffe alkyle :


o partage du solut le polaire de la PM avec le greffon solvat /m
o adsorption du solvant le polaire sur le greffon assimile un liq par effet hydrophobe
partage des soluts entre la PM et la phase liquide adsorbe

solvant le polaire de la m
silice greffon C18

solut
greffon C18

c) Optimisation de la slectivit de la PM

Triangle de Snyder 4 solvants peuvent tre ut :


o eau
o mthanol
o ACN
o THF

Solvant slectifs par chromato dadsorption (+ au centre du triangle)

Dmarche ds optimisation :
o Au dbut ,par ex : MeOH + eau (ou tampon) dont on fait varier le % pour assurer une
rtention des composs convenable
o Calcul de P
o Si slectivit insuffisante ,on remplace MeOH /ACN (prop te du MeOH ,en gardant le
mme P4

rle important du pH de la PM (tampon) pour composs ionisables :


o + compos ionis + lution rapide
o si pH auquel recul dionisation rtention

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2.3 Chromatographie par changes dion

chromatographi des substances ionises(minraux) ou ionisables en fct du pH (mocules


organiques).
PS = rsine changeuse dion
PM = tampon ionique = acide ou base forte
dtecteur = dtecteur conductimtrique
Mca : equilibre dchange dions

PS :
support + gpmt fctnel + contres ions

SO2- H+ mobile changeur de cations

Silice ou polystyrne

N OH- mobile changeur danions

Contre ions mobiles peuvent tre ech avec ions de mme signe de la solution

Echangeur : fort ,faible (taux dionisation varie en fct du pH)

Capacit dchange : (meq/g ou eq/g)


o =nbre dions qui peuvent tre ch / unit de poids de rsine sche
o Caractristiques dun changeur
o Varie en fct :
du nbre de gpmts fixs
de la force des gpmts
du pH (pour les changeurs faibles)
o elle affecte la rtention des soluts (+ capacit grande + rtention )

a) nature et structure des echangeurs dions (PS) :

Gpmts fonctionnels :
o changeur de cation :
fort = sulfonique nRSO3- H+
faible = carboxylique nRCO2- H+

o changeur danions :
fort = ammonium IV : nR N+(CH3)3 OH-
faible = amine I : nR NH3+ OH-

o changeurs plurifonctionnel :pls types de gpmts

Support :
o rsine de structure gel :
grains trs fins de co-polymre styrne-divinylbenzne DVB
+ greffs gpmts fctnels rseau Mm*
degr de rticulation avec % DVB (tx de pontage X)
+ maille du rseau petites m* volumineuse bloques
rsistance mca mdiocre : avec X
cintique dech lente (pics larges)ut granulomtrie assez fine (m)
capacit dech lev chromato prparative sep fraction pure
2<pH<13=avantage

o microparticules de silice :
greffes de gpmts Vb + greffe gpmts fctnels

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trs bonne rsistance mcaut en HPLC


capacit dech leve chroma prparativ
trs gde surf de contact do eq rapides (pics troits)
2<pH<8.5

o changeur pelliculaire :
billes de verre (30 50m )
+ pellicules de rsine (1 2m) portant les gpmts changeurs
bonne rsistance mca (HPLC) ,dc poss davoir des taux de pontage faibles ,dc
mailles de rseau assez grosses analyse espces volumineuses
faible capacit dech
pas de chromato prparative ,slmt analytique
cintique dech rapide do bonne effi
2<pH<13

b) Mca de sparation

Mcanisme principal = echange dions :


o 1/ solvatation des gpmts fonctionnels /H2O : gonflement en prsence deau de la m
o 2/ ionisation des gpmts fonctionnels (dpd du pH de la m pour changeurs faibles types
carboxylique)

si degr de rticulation lev , peu dech deau

Les mcanimes :
o principalech ions changeurs /ions de la sol m irrversible/lavage de la rsine
o II partage (effet Donnan) ; rversible par lavage de la rsine
que m* soient charges ou non

changeur de cations :

SO3- H+ M^n+
SO3- H+ M^n+
2- - - -
ordre dcroissant daffinit : Citrate > SO4 > oxalate > NO3-> Cl > formiate > actate > OH > F

changeur danions :

N+ OH- A^n-

N+ OH- A^n- solution

4+
Ordre dcroissant daffinit : Ba+ > Pb+ > Ca+ > Cu2+ > Mg+ > K+ > NH >Na+ > H+ > Li+

n R N+ (CH3)3 OH- + A^n- 1/K n R-N+(CH3)3 + n OH-

Equilibre rgit par une cste dech K


change charge charge ,respectant llectroneutralit
soit A lion fix sur R
et B lion apport par lech ds m

K
Ar + Bs As + Br

K(A/B) = As x Br / Ar x Bs

Br/Bs=Pb=coeffts ??????

Pa coefficient de partage ionique r/s

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K(A/B)=PB / PA
PB>PA B a + daffinit por la rsine que A

Mcanisme II = Partage (Effet Donnan) :


o Partage des m* quelles soient charges ou non
o solut non charg pntre ds rsine jusqu eq
o solut charg pntre ds rsine ,quil soit changeable ou non
o degr de pntration = fct de nature de la rsine et de lionisation du solut

ex : sur rsine sulfonique R OS3H+

H+ Cl-
SO3- Cl-
H+

H2SO4 et CH3COOH

SO3- SO4-
CH3COO-
H+

Signal

SO4- CH3COO-

Tps

c) Rgles de lchange

Affinit de lion pour la rsine dpd de :


o charge de lion affinit avec charge
o taille de lion solvat affinit qd taille

Ba+ > Pb+ > Ca+ Mg+ > K+ > NH4+ >Na+ > H+ > Li+
(sels de K+ + luant que Na+)

Dplacement des equilibre en :


o conc de A ds m
o modifiant PB et PA en modifiant m (pH ,force ionique ,addition agent complexant)

d) Choix des cdt opratoires et optimisation

Choix de lchangeur :
o nature
o granulomtrie 75 150 m
o CLHP <20m

Choix de la m :
o tampon aqueux maintient du pH (tampon citrate, phosphate/acide et ammoniaq/basiq)
o nature de lion dveloppeur
o pH (slectivit) gnralement proche des pK des soluts
o force ionique

Choix du procd de sparation :


o sparation prparative :
gdes qtit de prod sep / rsine

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analyse par dplacement des ions fixs sur R /ions de la m qui ont + daffinit
pour R que les ions sep

ex : sparation Na+ (NaCl) et K+ (KCl) sur RSO3H :


o m CaCl2
o Ca+>K+>Na+ : ech rapide car bcp daffinit
o Espces conc la sortie ,sortent ssf de bandes

chromato analytique :espce sparer


en petite qtit par rapport qtit de rsine de s
-analyse par lution (fig 21) :ions de lech fixs sur R lus par des ions de la m qui ont une affinit
moins importante pour R
-sparation Na+ (NaCl) et K+ (KCl) sur RSO3H ,m HCL
K+>Na+ >H+
-change lent car peu daffinit
espces dilues la sortie ,sortent ssf de pics

NB : si T augmente efficacit augmente (max 50-80C)

d- application de la chromato par ech dions ,ionique

Purification de leau :

eau purifie pharmacope =eau dionise


eau mixte :cation fort (forme H+ ) et anion fort (forme OH-

SO3- H+ Ca+
SO3- H+ Ca+

N+ OH- Cl-
N+ OH- Cl-

Leau ctt par ex :CaCl2 ,MgCl2 ,NaCl


Ca+ ech vs 2H+
2Cl- ech vs 2OH- H2O

passage sur charbon actif

leau distille aprs passge sur rsine est trs charge en composs organique

Sparation daa (impossible par CPG)

aa= substance amphotre ,3 formes possibles en fct du pH

R-CH-COOH R-CH-COO- R-CH-COO-


NH3+ NH3+ NH2
Zwitterion=forme neutre
A B C pH

Echangeur de cation + gradient de pH m

dpart :fixation de ts les aa pH acide ,forme A


puis lentement pH lution des aa ssf de zwitterion
ordre dlution suit pKa les + acides (pKa les + fble) sortent en 1ers

En ralit , modif de lordre dlution cause de leffet Doman


prendre ech danion et commencer pH alcalin

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Conc des ions

intrt : eaux radioactives conc en ions


des ions faible conc peuvent tre luer avec un faible volume de Fm

Prparation dchantillon en vue de leur dosage

analyse Ca+ en prsence de PO4^ 3- difficile


CaPO4=compos rfractaire
On fixe PO43- sur changeur danion et recueil Ca+ ds lluant
On peut fixer Ca+ sur changeur de cation et lim PO4^3-
Puis lution Ca+ / acide nitrique par ex

Chromato ionique

colonne dech dions


analyse avec dtection conductimtrique (srtt anions)
ions minraux en hydrologie
ions organiques (acide organiques ds vins)
pour analyse des cations (Ca+ )spectro atomique
Na+ ,K+ srtt PF

2.4 Chromatographie par appariements dions ou paires dion


Sparation des substances ionises ou ionisables en fct du pH
Appareillage classique (cf. HPLC)
PS = silice greffe alkyle (C8 ou C18)
PM = ACN ou MeOH ,eau ou tampon + contre ions () longue chane

Contre ions les + ut :


o Dosage cations :
3-
composs anioniques CH3-(CH2)n-SO H+

o Dosage anions :
hydroxyde de terbutyl ou tetrapropyl ammonium
+ - + -
(C4H9)4-N OH / (C3H7)4-N OH
travail tjrs avec PM dont le pH assure lionisation du compos analyser

a) Mcanisme
A la fois change dions et partage :

ech dions C-
E- S+

+
Partage C-
S+

lech dions , le contre ion se fixe sur partie apolaire sur alkyle de la m et fonctionne comme ech
dion

Partage :la paire dion hydrophobe prform ds m fixe greffon sur partie apolaire partage vs
greffon et m (liq-liq)

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b) rgles dlution

Rtention suit rgles de chromato polarit de invers :


o avec du % en solvant organique de m
o avec le % en eau de la m

Rtention dpd pH de la m :
o si pH o solut est fortement ionis ,paire dions favorise et rtention te

Rtention avec :
o conc en contre ion ds m
o caractre hydrophobe de la chane du contre ion

2.5 Chromatographie dexclusion sur gel


m* separe par taille et non par phno daffinit car indpdt de la nature du solvants (seulement
vhicule )
=filtration de gel qd support hydrophile (sep P*)
=permation de gel qd support caractre hydrophobe (organique)

PS = gel ,struct~tamis criblage /taille


PM = solvants induit le gonflement de la PS et dissout lech.
o Eau pour les gels hydrophiles
o Solvant organiques (chloroforme, DMF) si gel hydrophobe

PS = gel = milieu daspect homogne form :


o dune solide disperse :
constitue de petite particule calibre = grains poreux
chaque grain rsulte de liaison de Macrom* assemble pour former un rseau
caractris /sa porosit
+ rseau dense + pores petits

o dune aqueuse dispersante :


eau ou sel minraux (gel hydrophile )sep peptide ,P*
ou de nature organique (chloroforme ou THF)
si gel caractre lipophile ut pour sep polymre ou fraction lipidique

a) Principe

Classement des m* en fct de leur taille :


er
o Grosses M* exclu des pores sorte en 1
o petits m* lue en dernier (les plus ralenti car passe dans les pores)
o moyenne classs selon taille

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Section 2 item 5

b) Thorie

Vr = Ve + K*Vp

Vr = Volume de rtention (ou dlution)


Ve = vol extra particulaire (ou interstitiel) Ve = volume de PM
Vp = vol de porosit intraparticulaire Vp = volume des pores
Kd = coefficient de diffusion ds pores = conc m* ds pores /conc m* lext = Cp/Ce
o Kd=0exclusion totale
o 0<Kd<1exclusion diffusion
o Kd=1diffusion totale

Si m* trop grosse pour pntrer ds pores ,elles sont exclues et passent ds vol extraparticulaire Ve
Les m* intermdiaires diffusent ds pores selon leur taille fct de K

c) caractristiques des gels

Porosit :
o fct du d de rticulation
o + gel rticul + pores faibles (qlq 10aines qlq milliers dA)
o le vol de porosit Vp (cm3/g) avec porosit
o il a une influence sur la capacit de gonflement du gel

Grains :
o de 40 300 m P atm
o 10 80m en HPLC (hte P)

Gel inertes vis--vis :


o des solvants
o des composs sparer

Caractriss par leur consistance :


o gel mou P <2 bar (2 x Patm)
dextran
aggarose
polyacrylamide

o gel semi rigide P70 bar


polystyrne

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o gel rigide P>70 bar


arogels

d) types de gel

Gel de dextrane = sephadex (P*)


o hydrates de carbone polymris caractre polaire Hle
o ut pour sep P*

Gel daggarose = sephadex ou gelarose :


o prep partir dAgar-Agar
o polysaccharides solubles chaud et donnant gel par refroidissement
o struct due la cration de LH ds polysaccharides

Gel de polyacrylamide :
o amide acrylique polymris (polaire)
o insoluble ds H2Ogonflet gel
o ut pour sep Mm* bio telles que P* ou polysaccharides

Gel de polystyrne divinylbenzne


o sep m* lipophile (lipides ou polymres de $)

Arogels :
o perles de silice ou de verre ou poudre de verre surf poreuse
o ut en suspension en HPLC

e) Choix du gel (PS)

En fct m* sep :
o nature du gel hydrophile ou hydrophobe
o porosit trac courbe dtalonnage log MM =f(Vlution) avec des talons de MM
connues de nature similaire lech

MM de forme varies pelote ,filiforme


Ex pour P* nature globulaire
Pour gamme talon ,il faut
1 composant exclu totalement
1 composant pntrant ds les pores partiellement

logMM
A

B
C

Vlution

Zone linaire :pente faible (le compo B le plus gd volume dlution)


10^3<MM<10^4

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f) Application

Dsalage des P* (ut gel trs rticul)

P*
Sel minraux

Vol lution

Sep de m* de taille trs te, de cellule (lymphocytes) ou de particules (virus)


Fractionnement dun mlange de macromolcules.
Dtermination des constantes dquilibre
Dtermination de MM sep des masses de 200 10^7
o Polymres naturels ou de $ :peptides ,hormones ,enzymes
o Pour m* de taille peu te ut colonne + longue :
recyclage (recueille luant la sortie et remet dedans

g) Caractristiques de la chromato/gel

ttes les m* sont lues


tps de sparation prvisible car correspond au vol dlution tot
vol dlution ou tps est fct de la taille des m* do dtermination MM
2 m* peuvent tre sep si au moins 10% de ce vs MM
les pics ne slargissent pas en fct du tps de rtention
leffi, cd nbre de plateau thorique, est en gnral < la chromato liq habituelle

2.6 Chromatographie daffinit

Utilise une PS constitue d'un support (silice, polymre) sur lequel on a greff une molcule
organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains constituants d'un mlange
dont on cherche les isoler.
eux-ci vont tre slectivement adsorbs ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les
autres composants sont trs rapidement lus.
Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un comptiteur) permet ensuite
d'luer les substances intressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre 1000.
C'est le type de chromatographie le plus slectif, une protine pouvant tre purifie d'un facteur
103 104 en une seule fois.

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9 - LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINIT :
Principe :
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromolculaire
chimiquement inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique pour un
solut de l'chantillon analyser.
Trois types d'affinits sont utilises :
affinit enzyme-substrat
affinit ligand-rcepteur
affinit antigne-anticorps
Trs souvent, la molcule fixe sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de
purifier l'enzyme, le rcepteur ou l'antigne, respectivement.

Figure 1 : Les trois tapes d'une chromatographie d'affinit.

1 - Etape de FIXATION : Le mlange de molcules contenant le compos purifi est charg sur la
colonne d'affinit. Seule la molcule prsentant une affinit pour la colonne sera retenue par
l'effecteur greff sur la phase stationnaire.
2 - Etape de PURIFICATION : En continuant faire passer du tampon dans la colonne, toutes les
molcules
contaminantes sont limines et lues.
3 - Etape d'ELUTION : La molcule purifie est dccroche de la colonne et est recueillie dans l'luat.
Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protine (P), l'autre sera qualifi
de ligand (L)de cette protine :P + L <=> PL
L'association de P et de L forme le complexe PL. La constante dfinissant cet quilibre est :
Ka = (P).(L) / (PL)

NB : C'est une constante d'association l'quilibre, qui s'crit donc avec un "K" majuscule.

La phase stationnaire (le gel d'affinit) : elle est constitue d'un effecteur fix par covalence un
support (carboxymthylcellulose, Sphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermdiaire d'un bras de
fixation ("spacer" en anglais).
Exemples de drivs de la carboxymthylcellulose ou CM-cellulose :
La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long)
La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court)
La CM- aminohexylique (ou aminododcylique) succinyle : permet la fixation d'un effecteur
fonction
-NH2 ractive.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long)
La longueur du bras est choisie de manire limiter les contraintes striques.

Effecteurs :
Affinit enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs rversibles, effecteurs allostriques,
coenzymes.
Affinit ligand-rcepteur : haptnes, antignes, anticorps.
Affinit antigne-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques.

Elution : elle peut tre ralise de diffrentes faons :


Tampon de pH diffrent de celui ayant permis la charge : changement de l'tat d'ionisation d la
protine : dsorption
Tampon de force ionique diffrente de celle ayant permis la charge : changement de conformation
de la protine.
Comptition avec un ligand libre

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3 Choix dune mthode de chromatographie

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Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs
sparer :

1 - chromatographie d'adsorption
2 - chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
3 - chromatographie d'change d'ions (+ chromatographie ionique)
4 - chromatographie de paires d'ions
5 - chromatographie d'exclusion (sparation selon la taille)
6 - chromatographie d'affinit
7 - chromatographie adapte la sparation d'nantiomres

schma p294 moniteur

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