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CHROMATOGRAPHIE
EN PHASE LIQUIDE - HPLC
Introduction
1 Appareillage
1.1 Rservoir de PM
1.2 Pompe
1.3 Dispositif dinjection
1.4 Les colonnes
1.5 La phase stationnaire
1.6 Les dtecteurs
1/Spectrophotomtrique +++
2/Fluorimtrique
3/Rfractometre
4/Condutimtre
5/Electrochimique
6/SM
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Section 2 item 5
Pharmaetudes
Section 2 item 5
1 Appareillage
2 grands type dappareillage :
o La chromatographie Classique :
Granulomtrie > 10m
Appareillage simple :Tube en verre avec plaque en verre fritt la base ou
tampon de coton
substances descendent le long de la colonne selon affinit
recueil de lluat par petites fractions
Mais :
peu sensible
long
peu danalyse de trace ou dosage
A : rservoir de PM
B : Vanne lectro
magntique
de mlange des PM
C : Pompe
D : Egaliseur de pression
E : Chambre de mlange
F : Injecteur
G : colonne
H : Unit HPLC
I : Dtecteur
J : Interface PC
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1.1 Rservoir de PM
Flacon tanche (1 2L)
Parfois fois munis dun syst de dgazage (vite bulles dair)
Diffrents modes :
o mode isocratique = PM de compo cte au cours lextraction
(analyse possible avec 1 seul rservoir)
o mode programmation de solvant (+ cplxe)
=gradient de polarit (ncessite pls rservoirs)
1.2 Pompe
Fonctionne / piston alternatif (svt pls pistons) Assure un dbit cst
Appareil gradient de polarit :
o syst de vannes EM proportionnelles qui permet les mlanges des solvants en amont
dune pompe unique (ces vannes souvrent en tps proportionnel)
Qualits :
-pas de pulsation
-rsiste la corrosion
-dbit constant
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Section 2 item 5
o PS greffes +++
Formes par formation de liaisons covalentes entre les gpt silanols de la silice et
des molcules organiques de nature varies
Le plus courant = dimthylchlorosilane
Les carac de la PS greffe sont dtermines par la nature du gt grffs
Mais 50 des silanols ne seront pas greffes (encombrement strique) Pics
dyssymtrique
Bonne efficacit, mais utilisable quentre ph2 et 8
Doit fournir une rponse qui reflte en continu les variations de compo de lluat la sortie
Choix en fct des composs analyser
Qualits requises :
o linaire = rponses proportionnelles la conc chaque instant
o sensible
o rponse rapide, reproductible, et stable ds le tps
o peu de bruit de fond (variation alatoire de la ligne de base)
o limite de dtection faible compatible vec les rsultats attendus
o Volume mort le plus rduit possible
a- spectrophotomtrie +++
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NB : 2 substances des conc tes peuvent donner une mme auteur de pic (dpd )
b- spectrofluorimtrie
Avantages :
-trs sensible
-trs slectif
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c- dtecteur rfractomtrique
d- dtecteur conductimtrique
e- dtecteur lectrochimique
bas sur la prop dun compos tre oxyd ou rduit par une lectrode porte un potentiel donn
trs dlicat employer
ut pour analyse des catcholamines : absorbent peu ds UV
facilement oxydables llectrode
f- spectromtrie de masse
permet didentifier compos par leur spectres de masse ,coteux mais trs sensibles
ut en pharmacocintique pour identifier mtabolites
ut ds centres de recherche pour identifier les impurets
g- Autres
-IR
-Radioactivit
-Polarimtrie
-chimioluminescence
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3 types de sites :
o silanols (OH) libres
o silanols lis /LH
o ponts siloxanes
o silanols libres hydrats
o gel de silice fortement hydrats
les sites actifs qui ragissent sont les silanols libres et silanols libres faiblement hydrats et lis
/LH
selon ltat dhydratation de la silice ,les sites sont bloqus
la surf , compet vs m* de solut et m* de solvant de la m
ce sont les soluts polaires qui vont se fixer
solut solvant
site
SA
Surf de silice
Rtention fct :
o du solut :
nrj dadsorption des gpmts fonctionnels
encombrement strique
o de ladsorbant :
surf spcifique
granulomtrie
porosit
teneur en eau (activit)
o du solvant :
forme luante :solvants classs daprs leur force dlution vis vis de la s
elle suit la polarit pour la chromato dadsorption
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srie luotrope : solvant classs du moins polaire au + polaire ,mme ordre pour silice et alumine
Ex :
-R COOH ajout acide pour obtenir forme m* non ionis
-R NH2 + base ou alcalode
rgle dlution :
-silice = polaire substances polaires les + retenues
caractre polaire de m (ex :ajout H2O) rtention
c- Optimisation de la slectivit de la PM
slectivit : fct de la nature des solvants qui rent par leur capacit
o accepteur de protons Xe
o donneur de protons Xd
o caractre dipolaire Xn
Schma snyder
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Ex :
o Chloroforme = gpe 8
o Et Acide tertiobutylique gpe 3
o Ont la mme force luante mais une slectivit te car ds gpes opposs ,interactions
polaires tes
Dmarche ds optimisation :
o au dbut : solvant S polaire + solvant P ngligeable (type hexane) dont on fait varier le %
pour assurer une rtention des composs convenable
o on calcule P de cette m
o si insuffisant ,on remplace S par un autre solvant S de prop tes de S (loign de S ds
triangle) en gardant le mme P
NB : important : la valeur de P utilise ici nest valable que pour la chromato dadsorption
Elle varie si s nest pas polaire
Pb avec silice :
-sparation peu reproductible si teneur en eau non contrle
-inutilisable en gradient de polarit
-ut limite en CLHP sur colonne
PS = silice dont la surf a t modifie par greffage covalent (prsence de silanols rsiduels )
fig 17 18
CH3 CH3
SiOH = Cl-Si-R Si O Si R
CH3 CH3
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b) mcanisme de partage
on suppose que sur silice greffes aminopropyles que le solvant le + polaire de la m solvate les
greffons polaires aminopropyles
qd injecte solut ,il se partage vs greffon solvat/m =partage liq/liq du solut S :greffon
solvat/m
c) Optimisation de la slectivit de la PM
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Valeurs de P redfinies :
o THF P=4.5
o ACN P=3.2
o Mthanol P=2.6
o Eau P=0
Plus un compos sera apolaire, plus il sera retenu, plus, il sortira tard.
Force luante = THF > ACN > MeOH > eau
solvant le polaire de la m
silice greffon C18
solut
greffon C18
c) Optimisation de la slectivit de la PM
Dmarche ds optimisation :
o Au dbut ,par ex : MeOH + eau (ou tampon) dont on fait varier le % pour assurer une
rtention des composs convenable
o Calcul de P
o Si slectivit insuffisante ,on remplace MeOH /ACN (prop te du MeOH ,en gardant le
mme P4
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PS :
support + gpmt fctnel + contres ions
Silice ou polystyrne
Contre ions mobiles peuvent tre ech avec ions de mme signe de la solution
Gpmts fonctionnels :
o changeur de cation :
fort = sulfonique nRSO3- H+
faible = carboxylique nRCO2- H+
o changeur danions :
fort = ammonium IV : nR N+(CH3)3 OH-
faible = amine I : nR NH3+ OH-
Support :
o rsine de structure gel :
grains trs fins de co-polymre styrne-divinylbenzne DVB
+ greffs gpmts fctnels rseau Mm*
degr de rticulation avec % DVB (tx de pontage X)
+ maille du rseau petites m* volumineuse bloques
rsistance mca mdiocre : avec X
cintique dech lente (pics larges)ut granulomtrie assez fine (m)
capacit dech lev chromato prparative sep fraction pure
2<pH<13=avantage
o microparticules de silice :
greffes de gpmts Vb + greffe gpmts fctnels
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o changeur pelliculaire :
billes de verre (30 50m )
+ pellicules de rsine (1 2m) portant les gpmts changeurs
bonne rsistance mca (HPLC) ,dc poss davoir des taux de pontage faibles ,dc
mailles de rseau assez grosses analyse espces volumineuses
faible capacit dech
pas de chromato prparative ,slmt analytique
cintique dech rapide do bonne effi
2<pH<13
b) Mca de sparation
Les mcanimes :
o principalech ions changeurs /ions de la sol m irrversible/lavage de la rsine
o II partage (effet Donnan) ; rversible par lavage de la rsine
que m* soient charges ou non
changeur de cations :
SO3- H+ M^n+
SO3- H+ M^n+
2- - - -
ordre dcroissant daffinit : Citrate > SO4 > oxalate > NO3-> Cl > formiate > actate > OH > F
changeur danions :
N+ OH- A^n-
4+
Ordre dcroissant daffinit : Ba+ > Pb+ > Ca+ > Cu2+ > Mg+ > K+ > NH >Na+ > H+ > Li+
K
Ar + Bs As + Br
K(A/B) = As x Br / Ar x Bs
Br/Bs=Pb=coeffts ??????
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K(A/B)=PB / PA
PB>PA B a + daffinit por la rsine que A
H+ Cl-
SO3- Cl-
H+
H2SO4 et CH3COOH
SO3- SO4-
CH3COO-
H+
Signal
SO4- CH3COO-
Tps
c) Rgles de lchange
Ba+ > Pb+ > Ca+ Mg+ > K+ > NH4+ >Na+ > H+ > Li+
(sels de K+ + luant que Na+)
Choix de lchangeur :
o nature
o granulomtrie 75 150 m
o CLHP <20m
Choix de la m :
o tampon aqueux maintient du pH (tampon citrate, phosphate/acide et ammoniaq/basiq)
o nature de lion dveloppeur
o pH (slectivit) gnralement proche des pK des soluts
o force ionique
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analyse par dplacement des ions fixs sur R /ions de la m qui ont + daffinit
pour R que les ions sep
Purification de leau :
SO3- H+ Ca+
SO3- H+ Ca+
N+ OH- Cl-
N+ OH- Cl-
leau distille aprs passge sur rsine est trs charge en composs organique
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Chromato ionique
o Dosage anions :
hydroxyde de terbutyl ou tetrapropyl ammonium
+ - + -
(C4H9)4-N OH / (C3H7)4-N OH
travail tjrs avec PM dont le pH assure lionisation du compos analyser
a) Mcanisme
A la fois change dions et partage :
ech dions C-
E- S+
+
Partage C-
S+
lech dions , le contre ion se fixe sur partie apolaire sur alkyle de la m et fonctionne comme ech
dion
Partage :la paire dion hydrophobe prform ds m fixe greffon sur partie apolaire partage vs
greffon et m (liq-liq)
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b) rgles dlution
Rtention dpd pH de la m :
o si pH o solut est fortement ionis ,paire dions favorise et rtention te
Rtention avec :
o conc en contre ion ds m
o caractre hydrophobe de la chane du contre ion
a) Principe
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b) Thorie
Vr = Ve + K*Vp
Si m* trop grosse pour pntrer ds pores ,elles sont exclues et passent ds vol extraparticulaire Ve
Les m* intermdiaires diffusent ds pores selon leur taille fct de K
Porosit :
o fct du d de rticulation
o + gel rticul + pores faibles (qlq 10aines qlq milliers dA)
o le vol de porosit Vp (cm3/g) avec porosit
o il a une influence sur la capacit de gonflement du gel
Grains :
o de 40 300 m P atm
o 10 80m en HPLC (hte P)
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d) types de gel
Gel de polyacrylamide :
o amide acrylique polymris (polaire)
o insoluble ds H2Ogonflet gel
o ut pour sep Mm* bio telles que P* ou polysaccharides
Arogels :
o perles de silice ou de verre ou poudre de verre surf poreuse
o ut en suspension en HPLC
En fct m* sep :
o nature du gel hydrophile ou hydrophobe
o porosit trac courbe dtalonnage log MM =f(Vlution) avec des talons de MM
connues de nature similaire lech
logMM
A
B
C
Vlution
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f) Application
P*
Sel minraux
Vol lution
g) Caractristiques de la chromato/gel
Utilise une PS constitue d'un support (silice, polymre) sur lequel on a greff une molcule
organique particulire qui prsente une affinit slective pour certains constituants d'un mlange
dont on cherche les isoler.
eux-ci vont tre slectivement adsorbs ou tout au moins retenus sur la colonne, tandis que les
autres composants sont trs rapidement lus.
Un changement de la phase mobile (pH, force ionique ou ajout d'un comptiteur) permet ensuite
d'luer les substances intressantes, avec un facteur de purification pouvant atteindre 1000.
C'est le type de chromatographie le plus slectif, une protine pouvant tre purifie d'un facteur
103 104 en une seule fois.
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9 - LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINIT :
Principe :
Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromolculaire
chimiquement inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique pour un
solut de l'chantillon analyser.
Trois types d'affinits sont utilises :
affinit enzyme-substrat
affinit ligand-rcepteur
affinit antigne-anticorps
Trs souvent, la molcule fixe sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de
purifier l'enzyme, le rcepteur ou l'antigne, respectivement.
1 - Etape de FIXATION : Le mlange de molcules contenant le compos purifi est charg sur la
colonne d'affinit. Seule la molcule prsentant une affinit pour la colonne sera retenue par
l'effecteur greff sur la phase stationnaire.
2 - Etape de PURIFICATION : En continuant faire passer du tampon dans la colonne, toutes les
molcules
contaminantes sont limines et lues.
3 - Etape d'ELUTION : La molcule purifie est dccroche de la colonne et est recueillie dans l'luat.
Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protine (P), l'autre sera qualifi
de ligand (L)de cette protine :P + L <=> PL
L'association de P et de L forme le complexe PL. La constante dfinissant cet quilibre est :
Ka = (P).(L) / (PL)
NB : C'est une constante d'association l'quilibre, qui s'crit donc avec un "K" majuscule.
La phase stationnaire (le gel d'affinit) : elle est constitue d'un effecteur fix par covalence un
support (carboxymthylcellulose, Sphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermdiaire d'un bras de
fixation ("spacer" en anglais).
Exemples de drivs de la carboxymthylcellulose ou CM-cellulose :
La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long)
La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur fonction carboxyle.
- O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court)
La CM- aminohexylique (ou aminododcylique) succinyle : permet la fixation d'un effecteur
fonction
-NH2 ractive.
- O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long)
La longueur du bras est choisie de manire limiter les contraintes striques.
Effecteurs :
Affinit enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs rversibles, effecteurs allostriques,
coenzymes.
Affinit ligand-rcepteur : haptnes, antignes, anticorps.
Affinit antigne-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques.
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Le choix de tel ou tel mode obit des rgles logiques directement lies la nature des composs
sparer :
1 - chromatographie d'adsorption
2 - chromatographie de partage (en phase directe (2A) ou inverse (2B))
3 - chromatographie d'change d'ions (+ chromatographie ionique)
4 - chromatographie de paires d'ions
5 - chromatographie d'exclusion (sparation selon la taille)
6 - chromatographie d'affinit
7 - chromatographie adapte la sparation d'nantiomres
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