Vous êtes sur la page 1sur 55

Anne 2011 - 2012

2me anne BTS de Biophysicien

Travaux pratiques de Techniques


dAnalyse Spectrale et Sparative
N2

C. SAUNIER & L. GODIN http://ligodin.free.fr

ligodin@free.fr

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.1/42

TP n2 : CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (H.P.L.C)


2.1 PRINCIPE
2.1.1. Gnralits sur la chromatographie liquide haute performance 2.1.1.1. Les supports 2.1.1.2. Les phases stationnaires 2.1.1.3. Les phases mobiles 2.1.1.4. Les Modes de travail Mode isocratique Mode gradient 2.1.1.5. L'appareillage Les pompes Les injecteurs Les colonnes Les dtecteurs Dtecteurs spectrophotomtriques

4
4 5 5 6 8 8 8 9 11 13 14 14 15

2.1.2. Grandeurs importantes en chromatographie 2.1.2.1. Loi de Darcy 2.1.2.2. Grandeurs chromatographiques et facteurs d'identification des soluts 2.1.2.2.1. Grandeurs de rtention 2.1.2.2.1.1. Temps de rtention et largeur du pic 2.1.2.2.1.2. Volumes de rtention 2.1.2.2.1.3. Facteur de rtention ou de capacit k' 2.1.2.2.1.4. Facteur de slectivit ou de sparation entre deux soluts 2.1.2.2.1.5. Facteur d'asymtrie des pics 2.1.2.2.2. Efficacit d'une colonne 2.1.2.2.2.1. Le nombre de plateaux thoriques N 2.1.2.2.2.2. La hauteur quivalente un plateaux thorique H ou H.E.P.T. 2.1.2.3. Sparation des soluts et rsolution 2.1.2.3.1. Facteur de rsolution RS entre deux pics 2.1.2.3.2. Optimisation de la rsolution RS 2.1.2.3.2.1. Augmentation du nombre de plateaux N 2.1.2.3.2.1. Modification des facteurs de rtention 2.1.2.3.2.1. Augmentation de la slectivit

17 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22 22 23

2.2. TRAVAUX PRATIQUES


2.2.1. But 2.2.2. Matriels et ractifs 2.2.2.1. Gnralits sur les parabnes 2.2.2.1.1. Prsentation 2.2.2.1.2. Utilisation 2.2.2.1.1. Toxicit 2.2.2.2. Les solvants de qualit HPLC 2.2.2.3. Les colonnes utilises 2.2.2.1. Liste du matriel

23
23 24 24 24 25 25 25 25 26

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.2/42

2.3. MODE OPERATOIRE


2.3.1. Procdure de mise en route de la chane HPLC

26
26

2.3.2. Importance du pourcentage de l'eau de la phase mobile dans la sparation d'un mlange de parabnes28 2.3.2.1. Phase mobile: 40/60 eau/MeOH raliser 28 2.3.2.2. Phase mobile: 50/50 eau/MeOH (rfrence) raliser 32 2.3.2.3. Phase mobile: 45/55 et 55/45 eau/MeOH : Analyse des rsultats 33 2.3.3. Nature du solvant organique utilis 2.3.3.1. Phase mobile: 50/50 eau/ACN raliser 2.3.3.2. Phase mobile: 50/50 eau/THF: Chromatogramme analyser 2.3.4. Greffage de la phase stationnaire 2.3.4.1. Utilisation d'une colonne phnyl-hexyl avec phase mobile: 50/50 eau/MeOH raliser 2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile: 50/50 eau/MeOH : Analyse des rsultats 2.3.5. Optimisation de sparation en mode isocratique : Analyse des rsultats 2.3.6. Utilisation d'un gradient d'lution 2.3.6.1. Gradient linaire eau/MeOH 55 65 raliser 2.3.6.2. Gradient linaire eau/MeOH 50 60 : Analyse des rsultats 2.3.6.3. Gradient exponentiel eau/MeOH(courbe -10 et courbe +10) : Analyse des rsultats 2.3.7. Extinction de la chane HPLC 34 34 35 36 36 37 38 38 38 40 40 40

2.4. CONCLUSION GENERALE

41

ANNEXE : PROPRIETES PHYSIQUES DE QUELQUES SOLVANTS

42

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.3/42

2.1 PRINCIPE
2.1.1. Gnralits sur la chromatographie liquide haute performance
La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC en anglais et CLHP en franais), initialement appele Chromatographie Liquide Haute Pression, est apparue en 1968. Il sagit, en ralit, dune amlioration des mthodes chromatographiques liquides sur colonne. En effet, les inconvnients majeurs de ces mthodes taient : la lenteur des sparations (environ 1 20 heures) ; labsence de dtection aise et rapide ; la quantit considrable dchantillon ; labsence dautomatisation. La CLHP comble donc ces lacunes. Son succs rside principalement dans la qualit granulomtrique de la phase stationnaire. En effet, la mise au point de phase stationnaire de granulomtrie plus fine et homogne a ainsi permis damliorer considrablement lefficacit de la chromatographie. De plus, la vitesse des analyses fut notablement acclre par la fabrication de colonnes de taille plus petite (5 minutes 1 heure au lieu de 1 20 heures)69. Enfin, la possibilit de coupler les rsultats danalyse avec des dtecteurs de type spectromtre UV/visible ou spectromtre de masse a favoris la qualit des tudes. Son atout majeur dagir de manire trs prcise sur la slectivit entre les composs par le choix de la colonne (qui contient la phase stationnaire) et de la composition de lluant (phase mobile) en exploitant donc les interactions solut/phase mobile/phase stationnaire, explique son utilisation massive. Ceci se schmatise selon le triangle suivant :
Solut

Affinit

Solubilit

Phase stationnaire

Compatibilit

Phase mobile

Figure 1 : reprsentation schmatique des interactions solut/phase mobile/phase stationnaire

Cette mthode permet de sparer des composs de masse molaire variables, de nature chimique diffrente et mme des isomres. La CLHP est devenue la premire technique analytique prsente dans les laboratoires de recherche et danalyses.
69

Lutilisation de colonnes de petite taille de granulomtrie trs fine entranant ainsi une augmentation du nombre de plateaux thoriques due laugmentation de la surface dchange. Notion qui vous sera dtaille dans la partie Grandeurs importantes en chromatographie .

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.4/42

Elle couvre tous les domaines dapplications. Voici quelques exemples : lagroalimentaire : dtermination de la teneur en acides carboxyliques dans le vin ; la pharmacie : recherche dimpurets dans les matires premires, analyse quantitative et identification de principe actif, etc ; la cosmtique et la pharmacie : dosage des parabnes dans les crmes, les mdicaments, etc ; la biopharmacie ou biologie : analyse de masses molaires de polypeptides, protines, etc.

2.1.1.1. Les supports


Les supports sont des solides trs finement diviss dont la principale proprit est dtre inerte vis--vis des phases stationnaire et mobile. Le support majoritairement utilis est le gel de silice form de grains de diamtre variant de 1,5 quelques dizaines de micromtres. Ces grains prsentent leur surface des pores de diamtres diffrents (80 300 m) au travers desquels la phase mobile circule. Selon lutilisation souhaite, la granulomtrie du support varie ; par exemple, en UPLC, les diamtres utiliss sont trs petits (de lordre de 1,5 m), en mthode analytique, on privilgie des diamtres de lordre de 5 m70 alors quen mthode semi-prparative ou prparative, les diamtres des grains atteignent des dimensions pouvant aller jusqu 50 m. Il faut prciser que depuis quelques annes, de nouveaux supports, diffrents du gel de silice sont apparus, comme des polymres synthtiques, la zircone ou loxyde de zirconium (Zr O2) qui prsentent alors une meilleure stabilit en milieu basique/acide.

2.1.1.2. Les phases stationnaires


Les phases stationnaires majoritaires sont des phases greffes c'est--dire des phases dans lesquelles de vritables liaisons chimiques existent entre la phase stationnaire et le support. Les plus utilises sont constitues de chanes aliphatiques greffes, de polarit ou de longueur variables. En chromatographie de partage, mthode la plus rencontre, on distingue deux types de phase stationnaire : 1. la phase stationnaire normale (phase minoritaire) : phase polaire qui ncessite alors lutilisation dune phase mobile peu polaire (hydrocarbures, par exemple) ; 2. la phase stationnaire inverse (la plus utilise) : phase non polaire, qui ncessite lutilisation dune phase mobile plutt polaire (mlanges eau/mthanol, eau/actonitrile, eau/ttrahydrofurane, tampon/solvants organiques). Voici par ailleurs quelques exemples de phases stationnaires classes selon la polarit de leurs groupements : polaires (ou hydrophiles) tels que les amines, les nitro et nitriles, les dialcools ; apolaires (ou hydrophobes) tels que les chanes alkyles de C4 C30 (les plus connus sont les chanes C8 et C18 de formule Si - (CH2)17 CH3 pour cette dernire), les phnyles. Ces phases stationnaires base de silice greffe prsentent de nombreux dsavantages tels que : une instabilit face aux pH acides et basiques ; un phnomne dadhrence des chanes alkyles sur le support dans les phases mobiles trs hydrophiles. Ces dfauts ont conduit ainsi la mise au point de nouvelles phases stationnaires. Citons quelques exemples :

70

Dans notre laboratoire, toutes nos colonnes ont une granulomtrie de lordre de 5 m.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.5/42

des phases alkyles incorporant des groupements polaires (amide, ther ou carbamate) ; de nouvelles polymrisations de la silice pour rsister aux pH ; des zircons greffs rsistants pH 13,0 ; des silices fluores plus hydrophiles que les phases alkyles.

2.1.1.3. Les phases mobiles


Elles doivent prsenter les proprits suivantes71 : possder un pouvoir solvant et une inertie chimique vis--vis des composs sparer ; possder galement une inertie chimique et une insolubilit vis--vis de la phase stationnaire. Le plus souvent, ces phases mobiles sont constitues de plusieurs solvants : mlanges deau ou de solutions tamponnes avec un solvant organique dont les proportions peuvent varier ou non au cours de lanalyse. Cest pourquoi le choix de la phase mobile dpend surtout de : la nature des composs analyser ; la polarit de la phase stationnaire utilise. On rappelle, en effet, que le couple phase stationnaire/phase mobile fonctionne en invers : phase stationnaire polaire phase mobile apolaire phase stationnaire apolaire phase mobile polaire Les solvants peuvent donc tre classs selon leurs proprits physiques. Il sagit principalement de : leur polarit ou coefficient de polarit ; cette grandeur, sans dimension, comprise entre 0 et 1, est spcifique dun solvant (par exemple, leau, solvant polaire prsente un coefficient de 1, celui du ttrahydrofurane, solvant moins polaire, est de 0,45 et celui du dichloromthane, compos apolaire est de 0,30) ; leur pouvoir dlution.

Voici quelques exemples de solvants organiques usuels et de leurs forces luantes selon ces deux proprits physiques.

71

Pour rappel, il faut se rfrer la reprsentation schmatique (figure 1) des interactions solut/phase stationnaire/phase mobile.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.6/42

Figure 2 : polarits de quelques familles de composs organiques ainsi que des principaux greffons des phases stationnaires actuelles

Sur phase polaire normale Solvant FAIBLE Hexane Tolune Dichloromthane Ttrahydrofurane Actonitrile Mthanol Eau

sur phase polarit inverse

FORT

FORT

FAIBLE

Figure 3 : force ou pouvoir dlution des solvants utiliss comme phases mobiles

Il est important de noter que selon les solvants utiliss et leur proportion dans le mlange, la viscosit et en consquence la pression en tte de colonne pourra fortement varier (cf. figure 4 et la loi de Darcy72)

Figure 4 : viscosit de mlanges eau/solvant

Toute la difficult de la mthode chromatographique est donc de faire le bon choix de phases en fonction des composs sparer tout en vitant un excs de pression. Enfin, lutilisation de solvants en CLHP entrane le respect de quelques rgles lmentaires telles que : lutilisation de solvants spcifiques CLHP ; lutilisation deau ultrapure exempte de tout compos ionis (leau ultrapure se contamine trs vite ; elle doit tre frache chaque matin : la rsistivit doit tre de 18,2 M.cm-1)73 ; la filtration obligatoire des solvants sur des filtres spciaux (type FHUP ou FHLC 47 mm 0,45/0,5 m74) ou le dgazage des solvants aprs filtration par ultrasons ou par la technique de bullage par lhlium, ou le dgazage dit en ligne.

72 73

Cette loi importante sera dtaille dans la partie Grandeurs importantes en chromatographie . De nombreux appareils mesurent galement le Carbone Organique Total (COT). 74 Il existe aussi des filtres 0,22 m utiliss surtout en UPLC ou pour viter les contaminations bactriennes.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.7/42

Si le solvant contient des tampons, il est fortement conseill de ne pas laisser la chane sous tampon au repos et de filtrer de nouveau le tampon avant sa prochaine utilisation.

2.1.1.4. Modes de travail


On peut fonctionner en CLHP de deux faons : 1. si on utilise un solvant pur ou un mlange de solvants de composition constante dans le temps, on travaille en mode ISOCRATIQUE ; 2. si on utilise un mlange de solvants de composition variable dans le temps, on parle de mode GRADIENT.

Mode isocratique
Ce mode de travail, trs frquemment utilis, demande un appareillage moins coteux, ainsi quun entretien, une maintenance et une qualification dappareil moins stricts que ceux requis par le mode gradient. Il est souvent suffisant pour sparer et analyser des mlanges de composs.

Mode gradient
Ce second mode de travail prsente de nombreux avantages. Son utilisation permet surtout de diminuer le temps danalyse tout en respectant priori une sparation correcte de mlanges complexes de composs. Exemple de son application : en phase inverse, nous savons que la colonne utilise contient une phase stationnaire apolaire, entranant lutilisation soit dun solvant (phase mobile) polaire moyennement polaire (eau associe du mthanol ou de lactonitrile). Ainsi, daprs la nature des composs sparer, il est alors possible et trs intressant de travailler selon diffrentes proportions des solvants de la phase mobile : on pourrait commencer, par exemple, la sparation avec un mlange 80/20 % eau/actonitrile pour terminer la composition de 40/60% ou bien selon le cas de figure appliqu lors de votre sance. Dans la pratique, il existe deux types de gradients, les gradients linaire et exponentiel. Les premiers utilisent 2 points de concentration de solvant. Les seconds appliquent un facteur de courbure sur le gradient linaire pralablement dfini par les soins de lutilisateur dont la valeur peut varier de -10 +10. Exemple de trois gradients exponentiels de facteurs : -10, 0 et 10 qui sont dfinies comme suit :

-10

+10
Figure 5 : reprsentation des diffrentes "courbes" d'un gradient exponentiel d'lution

La courbe -10 permet de changer la composition du mlange trs rapidement, prcisment ds le dbut du lancement du gradient, linverse du principe de fonctionnement du gradient avec une courbe +10, qui prsente

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.8/42

les mmes conditions de travail initiales pendant un long temps et un changement de composition plus tardif. Quant la courbe 0, elle permet le changement linaire des conditions de mlange dans la dure de lanalyse. Ces changements de pourcentages de solvants permettront donc dluer plus facilement et par consquent de diminuer favorablement le temps dtude. Cependant, ce mode de travail prsente des inconvnients : en raison de la longueur de tubulures et de celle de la colonne traverser, on constate quil existe un temps de latence entre linstant programm pour le changement de pente et le moment exact du changement de conditions de travail ; il faut donc obligatoirement songer inclure ce dlai dans la programmation de lappareil ; on constate des drives de la ligne de base lendroit o les conditions de travail varient, mme dans le cas dune programmation dune pente douce (effet de bosse) ; on note une perte de temps car la fin de lanalyse, un retour aux conditions initiales est obligatoire pour la colonne ; enfin, on constate quil est impossible de travailler en circuit ferm entranant alors dventuelles surconsommations de solvants.

2.1.1.5. Lappareillage
En raison des pressions leves qui doivent tre appliques pour assurer des dbits raisonnables75 lorsquon utilise des supports dont le diamtre particulaire est de lordre de 2 10 m, lappareillage requis pour cette mthode danalyse est ainsi ncessairement plus sophistiqu et plus coteux que celui utilis pour dautres mthodes chromatographiques. Cest pourquoi, on retrouvera dans tout appareil de CLHP les lments de base suivants : un ou plusieurs rservoirs (bouteilles) de phases mobiles (200 1000 mL) contenant soit des solvants purs, soit des mlanges de concentrations connues ; on y adjoint souvent des dispositifs permettant den liminer les poussires et les gaz dissous76 ; une ou plusieurs pompes pour les luants ; un systme dinjection comportant une boucle dchantillonnage calibre (de type vanne Rhodyne) ou un injecteur automatique ; une colonne remplie en acier inox (ou verre) de quelques cm de long ; un dtecteur permettant la fois de mettre en vidence la sortie des soluts de la colonne et de donner un signal proportionnel la quantit de chacun des composs du mlange analys ; un flacon qui tient le rle de poubelle de solvants vider rgulirement.

75 76

Cf. le descriptif de la loi de Darcy dans Grandeurs importantes en chromatographie . Il nest pas ncessaire que le systme de dgazage et les filtres fassent partie intgrante de lappareil. Il est parfois plus facile de traiter le solvant avant son introduction dans le rservoir en le filtrant sous vide laide dun filtre appropri Millipore.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.9/42

Rservoir de phase mobile

Filtre ou crpine

Pompe Manomtre Injecteur Pr-colonne Colonne Thermorgulateur Dtecteur Enregistreur Systme de donnes Collecteur ou poubelle

Figure 6 : schma simplifi du principe de base dun appareil HPLC

Figure 7 : schma dtaill d'un appareil de chromatographie liquide haute performance

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.10/42

Concrtement, chacun de ces lments est stock dans un module spcialis qui se prsente dans un botier distinct ou intgr dans un mme ensemble. Ces modules sont relis entre eux par des canalisations de trs faible diamtre interne, diffrent selon leur localisation, pour assurer la circulation de la phase mobile. Elles peuvent tre en acier inoxydable ou en PEEK (polyether-etherketone), polymre souple, ais dutilisation, color et rsistant aux solvants usuels mme sous de fortes pressions (maximum 350 bars).
Poubelle solvants Rservoirs solvants

Dtecteur Dgazeur en ligne Tubulures en PEEK

Colonne Contrleur Tubulures en inox

Pompe

Injecteur

Figure 8 : photo de l'ensemble de la chane HPLC utilise

Les pompes
Toute installation de chane HPLC comporte au moins 1 pompe, dont le but est de forcer le passage de la phase mobile travers la colonne. Son rle est double : 1. permettre le maintien dun dbit constant quelles que soient la pression et la variation de composition de la phase mobile ; 2. obtenir un dbit suffisant jusqu 10 mL/min sans perte dexactitude et de reproductibilit. Actuellement, on utilise presque exclusivement deux types de pompes : dite seringue : la phase mobile est alors pousse par une vis sans fin ; dite piston mouvement alternatif : deux pistons en srie fonctionnent en opposition et entre les deux pistons, avant linjecteur, se trouve un amortisseur de pulsations (enroulement de tubes aplatis se dilatant pour contrecarrer la variation de pression lors de la phase de pressurisation des pistons).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.11/42

Suivant les modles de chanes CLHP, on peut distinguer deux cas de figure : prsence dune pompe unique pour mlanger basse pression : dans ce cas-l, le dispositif comporte un systme dlectrovanne ou vanne de mlange, ddie chaque solvant. Linconvnient majeur de cet appareillage est un dgazage obligatoire, avec de lhlium, des filtres, ou un dgazeur en ligne, pour chacun des solvants ;

Figure 9 : principe de fonctionnement dune pompe basse pression

prsence de plusieurs pompes, chacune tant ddie un solvant, le mlange seffectuant par le dbit de chaque pompe sous haute pression. Les pompes sont alors appeles binaire, ternaire ou quaternaire suivant le nombre de solvants quelles peuvent mlanger.

Figure 10 : exemple de configuration pour gradient haute pression

Remarque : pour rsister aux pH acides et basiques des solvants, qui sont dautant plus corrosifs que la pression augmente, toutes les pices en contact avec la phase mobile doivent tre inertes ; on utilise en gnral du tflon ou parfois des alliages spciaux.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.12/42

Dans le cas de la pompe LC20AD de Shimadzu, une faible pulsation de dbit lente et une priode de pulsation rduite permettent une distribution prcise. En rduisant le volume d'envoi par course du piston au niveau du microvolume (10 l) et en appliquant un entranement haute vitesse, la pulsation du dbit et la priode de pulsation ont t rduites des niveaux significativement plus bas que ceux dfinis pour les autres appareils, il ny a donc plus besoin damortisseurs de pulsations ! Cette fonction permet d'utiliser des dtecteurs de haute sensibilit, y compris des dtecteurs d'indice de rfraction et des dtecteurs lectrochimiques, sensibles la pulsation de dbit. Elle permet galement la distribution du gradient avec un degr de prcision qui, en gnral, n'est pas possible mme avec des dbits micro-niveaux.

Les injecteurs
Ils sont de deux types. Mais, seul celui dit de vanne boucle externe permet dinjecter une quantit calibre (donc reproductible) ou un volume calibr (de 10 100 L) de composs analyser en un temps bref en tte de colonne. Il sagit dune vanne haute pression compose de plusieurs voies, manuelle ou motorise. La plus connue et la plus couramment utilise est la vanne dite Rhodyne.

Figure 11 : modle de vanne Rhodyne modle 7725 en acier inoxydable

Son mode de fonctionnement est en deux tapes : 1. dans la position de chargement ou de remplissage ( load ) : seules la pompe et la colonne tant relies, lchantillon analyser est introduit, pression atmosphrique, dans une boucle avec un volume trs suprieur (de lordre de 5 fois) au volume dinjection afin dassurer une constance dans le paramtre de volume inject ; par exemple, la boucle tant calibre sur 20 L, on va prlever et injecter 100 L dchantillon ; 2. dans la position injection : lchantillon est introduit dans le flux de phase mobile par rotation de 60 dun levier et ce, sans variation importante de la pression dans le circuit allant de la pompe vers lentre de la colonne ; la rotation de 60 permet dinverser le sens de circulation dans la boucle.

Figure 12 : schmas du fonctionnement d'une vanne Rhodyne

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.13/42

Les colonnes
Le diamtre intrieur varie de quelques mm (3,9 10 mm) quelques cm. Leur longueur moyenne est de lordre de 20 cm (variation de 5 30 cm). Leur remplissage est dlicat en raison de la trs fine granulomtrie77 qui les caractrise. Citons quelques chiffres : dans les laboratoires, en gnral, la colonne utilise possde une longueur de 15 cm, un diamtre intrieur de 4,6 mm et une granulomtrie de 5 m. Le nombre de plateaux thoriques78 (N) est compris entre 40 000 et 60 000 par mtre. Cependant, depuis quelques annes, on assiste lapparition de colonnes nouvelle gnration de plus faible diamtre qui permettent avant tout de raliser de fortes conomies de solvants.79 Enfin, la colonne est souvent prcde dun lment nomm prcolonne ou colonne de garde. Cest un petit dispositif court (de 0,4 1 cm), rempli de la mme phase stationnaire que la colonne avec lequel il est mont mais toutefois avec une granulomtrie ordinairement moins fine. Son rle est surtout dtre un protecteur de la colonne afin damliorer sa dure de vie, qui est sujet, bien videmment, lusure temporelle, tout en prservant ses qualits et performances : il protge contre dventuels coups de pression ; il limite les problmes de colmatage ; en cas de pH limite, il prserve la colonne en saturant la phase mobile en silice.

Pour conclure, il sera temps de changer de pr-colonne : quand la pression augmentera de 30 % ; quand lallure des pics sera en dehors des critres de conformit.

Figure 13 : exemples de colonnes de marque Alltech

77 78

Les phases stationnaires utilises et les supports sont dcrits dans le chapitre prcdent. La notion de nombre de plateaux thoriques est dtaille dans Grandeurs importantes en chromatographie . 79 Ces nouvelles colonnes de plus faible diamtre sont baptises narrow-bore et micro-bore .

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.14/42

Les dtecteurs
Ces systmes de dtection sont des lments indispensables au systme chromatographique CLHP. Ils permettent de suivre en continu la sparation et de mesurer la concentration instantane des diffrents soluts dun mlange analyser. Ils doivent donc prsenter les caractristiques suivantes : tre fidles, sensibles, stables et linaires ; prsenter un faible temps de rponse ; avoir un faible volume mort ; tre exploitable en mode gradient, si lanalyse le ncessite. Etant spcifique de chaque application, il est impratif de connatre exactement le type danalyses effectuer pour choisir le dtecteur adapt. Les modes de dtection les plus courants dpendent des proprits optiques des composs lus : absorption, fluorescence et indice de rfraction. Cependant, depuis quelques annes, de nouveaux modes de dtection sont apparus. Le plus couramment utilis est le couplage de la CLHP avec un spectromtre de masse constituant alors un dtecteur universel et un puissant moyen didentification.80 Voici rsum en quelques lignes un tableau comparatif de quelques dtecteurs :
Tableau comparatif des principaux dtecteurs

Type de dtecteurs Spectro UV/visible Spectrofluorimtrie Rfractomtrie Electrochimiques Conductimtrie Spectromtre de masse

Limite Optimale de Dtection (LOD) 1 pg 10 fg 10 ng 100 fg 500 pg 1 pg

Sensible la temprature T faible faible 10-4/C 1,5 %/C 2%/C -

Sensible au dbit Non Non Oui Oui Non -

Dtecteurs spectrophotomtriques
Ce sont les dtecteurs majoritairement utiliss. Leur domaine dapplication est lUV/visible. Les limites de ces appareils sont les absorptions propres des solvants et des soluts. Leur fonctionnement est rgi par la loi de Lambert Beer 81 : labsorbance de la phase mobile est mesure en sortie de colonne la longueur donde ou plusieurs longueurs donde ; la phase mobile ne doit pas ou trs peu absorbe ; lintensit de labsorption dpend du coefficient dextinction molaire du solut. Cette dtection correspond donc une dtection slective. Ils peuvent tre utiliss en mode gradient dlution. Dans les meilleurs cas, on peut dtecter, au minimum, des quantits de lordre du nanogramme.

80

On constate lapparition de lEvaporative Light Scattering Detector (ELSD) qui remplacerait le rfractomtre et le Corona. 81 La loi de Lambert Beer lie labsorbance dun solut, sa concentration et le coefficient dabsorption molaire une longueur donde donne selon la relation A = x b x C (mol.L-1).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.15/42

Il existe plusieurs types dappareils : longueur donde fixe : = 254 nm (raie la plus intense dune lampe vapeur de mercure) ; longueurs donde variable de 200 700 nm ; barrettes de diodes : ce dispositif donne la valeur simultane des intensits lumineuses sur tout le spectre assurant ainsi la dtermination de lidentit des composs spars ; le spectrochromatogramme obtenu est spectaculaire et sa reprsentation est souvent en trois dimensions.

Figure 14 : principe du dtecteur barrette de diodes

Figure 15 : reprsentation tridimensionnelle d'une sparation chromatographique

Le dtecteur Shimadzu SPD-20AV comprend la fois des lampes halognes au deutrium et au tungstne. La lampe D est utilise pour des applications dans lUV, alors que la lampe W tend les capacits d'analyse la zone visible. Il dispose de 3 modes de mesures - longueur d'onde unique, longueur d'onde double et balayage de longueur d'onde. Le mode longueur d'onde double excute simultanment la dtection de deux longueurs d'onde, et peut fournir des chromatogrammes des deux longueurs d'onde, ou un chromatogramme d'une longueur d'onde et un chromatogramme de ratio. Dans le mode de balayage de longueur d'onde, c'est le spectre d'absorbance qui est mesur. Le mode balayage de longueur d'onde est conu pour tre utilis pendant que le flux est arrt.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.16/42

2.1.2. Grandeurs importantes en chromatographie


2.1.2.1. La loi de Darcy
La Chromatographie Liquide Haute Performance faisant appel de nombreuses notions physico-chimiques, comme la pression, le diamtre des particules du support, il est important ici de rappeler la loi de Darcy qui relie tous ces lments entre eux selon lquation suivante : P =

32 xxLxV flux D 2 xd P
2

Avec P la diffrence de pression ou perte de charge dans la colonne, la viscosit de la phase mobile, L la longueur de la colonne, Vflux le dbit de la phase mobile, D le diamtre de la colonne et dP le diamtre des particules.

2.1.2.2. Grandeurs chromatographiques didentification des soluts

et

facteurs

La Chromatographie Liquide Haute Performance est une mthode danalyse physico-chimique trs utilise qui fait intervenir des mcanismes dchanges solut / phase mobile / phase stationnaire bass sur les coefficients dadsorption ou de partage K82 dfinis par la relation suivante : K =

cS cM

avec cS la concentration analytique du solut dans la phase stationnaire, et cM celle dans la phase mobile. Idalement, cS est toujours proportionnelle cM. On parle alors de chromatographie linaire83. Le rsultat obtenu aprs analyse se traduit alors par une courbe, type gaussien, appel chromatogramme.

Figure 16 : reprsentation d'un chromatogramme type

Celui-ci correspond la variation au cours du temps dun paramtre reli la concentration instantane du solut en sortie de colonne telle que : Intensit de signal = f(temps)
82

La notion de coefficient de partage K est relie la notion de facteur de rtention k telle que k = K x (VS/VM). Cette subtilit est rappele dans le chapitre sur le facteur de rtention k. 83 Cependant, ce principe nest pas respect dans tous les cas : par exemple, dans la chromatographie dadsorption, ceci nest pas vrifi.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.17/42

2.1.2.2.1. Grandeurs de rtention


Comme nous lavons dcrit dans le paragraphe prcdent, un pic idal sur un chromatogramme a le mme aspect que la reprsentation graphique de la loi Normale de distributions des erreurs alatoires : il suit une courbe de Gauss (cf. figure 17). Chaque pic de produit peut donc tre tudi et caractris par des grandeurs chromatographiques. Nous nous proposons maintenant de les dtailler.

Figure 17 : diffrentes grandeurs chromatographiques

2.1.2.2.1.1. Temps de rtention et largeur du pic


Un constituant est caractris par son temps de rtention tR, qui reprsente le temps coul entre linstant dinjection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui est li. Idalement, le temps de rtention tR est indpendant de la quantit injecte. Le temps t0 ou tM correspond au temps mort : temps de sortie dun compos non retenu sur la colonne (comme lactone ou la thioure en phase inverse). La largeur du pic est symbolise par w et on distingue notamment : la demi valeur du pic : largeur du pic mi-hauteur (w1/2) ; la largeur la base du pic (w) entre les tangentes.

2.1.2.2.1.2. Volumes de rtention


Les volumes de rtentions bruts VR sont les volumes de phase mobile utiliss pour luer les soluts leur concentration maximale depuis leur injection. Il est donn par la relation suivante : VR = D x tR avec D le dbit de la phase mobile Le volume mort V0 ou VM est le volume de phase mobile contenu dans la colonne. De mme que prcdemment, le volume mort est donn selon la relation suivante : V0 = D x t0 avec D le dbit de la phase mobile

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.18/42

Remarque : on peut galement calculer des temps de rtention rduits tR et des volumes de rtention rduits VR qui sont alors les grandeurs caractristiques dun solut pour une colonne donne (c'est--dire en fonction du volume mort de la colonne).

2.1.2.2.1.3. Facteur de rtention ou de capacit k


Ce facteur, encore appel facteur de capacit, est un paramtre important qui permet de dcrire la vitesse de progression des soluts dans la colonne. Il traduit le rapport des quantits de substances se trouvant entre les deux phases84. Il est indpendant du dbit de la phase mobile et de la longueur de la colonne. Il se dtermine tout simplement par la mesure des temps t0 et tR tel que : k =

t R t0 t0

Lanalyse de ce facteur montre deux lments importants : lorsque k est nul, alors le compos nest pas retenu par la phase stationnaire ; plus k est grand, plus le compos est retenu. En thorie, un bon facteur de rtention se situe entre 1 et 10. Cependant, dans les faits, on prfrera une limite de 2 en cas de risques dimpurets ou de salissures au temps mort. On constate galement que : des valeurs trop leves de k (c'est--dire suprieures 20 ou 30) entranent un largissement du pic, qui traduit une dgradation de la sensibilit et une augmentation du temps danalyse, provoquant alors des cots supplmentaires lis laugmentation du volume de solvants utiliss ; des valeurs trop faibles, linverse, entranent une lution trop rapide et donc une mauvaise sparation.

2.1.2.2.1.4. Facteur de slectivit ou de sparation entre deux soluts


Il sagit dune grandeur qui concerne deux soluts A et B. Elle est donne par la relation suivante : = ou encore : = avec B le compos le plus retenu. Remarque : cette grandeur, sans dimensions, est toujours suprieure 1.

t R B t0 t RA t 0

k 'B k'A

84

Il faut prciser que le support en CLHP ne joue aucun rle dans lquilibre.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.19/42

2.1.2.2.1.5. Facteur dasymtrie des pics


En thorie, les pics dlution chromatographiques ont lallure dun pic gaussien. chromatogrammes exprimentaux sont loin dtre idaux. La raison de cette diffrence est de deux ordres : En ralit, les

1. une irrgularit de concentration des constituants se produit en tte de colonne lors de linjection ; 2. la vitesse de la phase mobile est diffrente selon sa localisation dans la colonne : elle est nulle au niveau des parois et maximale au centre du tube. Toutes ces diffrences se traduisent par une asymtrie de pic caractrise par deux paramtres selon les pharmacopes : le facteur dasymtrie Fa qui doit tre compris entre 0,8 et 1,2 est dfini comme tant le rapport entre la largeur du pic au vingtime de sa hauteur et deux fois la distance entre la perpendiculaire abaisse du maximum du pic et le bord dentre au vingtime de sa hauteur (soit lquivalent de 5 %); le facteur de tranes Ft mesur 10 % de la hauteur du pic.

Figure 18 : reprsentation graphique explicative pour calculer le facteur d'asymtrie d'un pic

2.1.2.2.2. Efficacit dune colonne


On distingue deux types de grandeurs principales dfinies partir de la thorie des plateaux85.

2.1.2.2.2.1. Le nombre de plateaux thoriques N


Il sagit dune grandeur qui dfinit lefficacit thorique de la colonne. Plus cette valeur est grande, plus la colonne est dite efficace. Cette valeur peut varier de quelques centaines plusieurs centaines de milliers de plateaux. Il dpend la fois du solut et des conditions opratoires utilises.

85

Cette thorie trouve son origine dans les travaux de Martin et Synge, les pionniers de la mthode. Cette thorie explique avec succs la forme gaussienne des bandes ainsi que leur vitesse de progression travers la colonne. Cependant, elle a t remplace par une autre thorie (cintique) car elle ne permettait pas dexpliquer le phnomne dlargissement des pics que lon peut constater.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.20/42

Pour le calculer, il existe plusieurs formules de calculs. Nous choisirons dans notre cas la relation suivante :

&t # N = 16 x $ R ! %w"

2.1.2.2.2.2. La hauteur thorique H ou H.E.P.T.

quivalente

un

plateau

Cette valeur fait appel la notion de plateau thorique et dpend de la longueur de la colonne telle que la colonne serait divise en un certain nombre de petits disques fictifs (N), encore appels plateaux, de mme hauteur H. Pour chacun deux, la concentration du solut dans la phase mobile est en quilibre avec la concentration dans la phase stationnaire de ce solut. Plus cette grandeur H est petite, mieux cest ( longueur de colonne constante, bien entendu). On la dtermine donc par la relation suivante : H =

L N

avec L la longueur de la colonne (exprime le plus souvent en cm) Les valeurs habituelles de H sont comprises entre quelques diximes de cm et moins dun centime de millimtre. Remarque : ces deux grandeurs (H et N) sont trs souvent utilises par les fabricants pour dmontrer les performances des colonnes. Toutefois, pour que ces deux paramtres aient un sens lors de la comparaison entre colonnes, il est indispensable quils soient dtermins avec le mme compos.

2.1.2.3. Sparation des soluts et rsolution


Pour quune sparation soit russie, on doit obtenir autant de pics gaussiens quil y a de produits sparer. De plus, il faut que les pics obtenus soient suffisamment spars les uns des autres.

2.1.2.3.1. Facteur de rsolution RS entre deux pics


Cette valeur reprsente la mesure de la qualit effective de la sparation de deux pics voisins. Elle est calcule partir du chromatogramme laide des largeurs de pics w obtenues par les tangentes et se dfinit, en rgle gnrale, par la relation suivante86 : Rs = 2 x

t RB t RA w A + wB

avec B le compos le plus retenu On considre, en analyse quantitative, que la sparation est acceptable partir de Rs > 1,5 alors quen analyse qualitative, la valeur seuil suffisante est 1. Cependant, dans la pratique, il vaut mieux avoir une meilleure rsolution, surtout si les deux surfaces de pics sont identiques.87
86

Comme pour calculer le nombre de plateaux thoriques N, il existe plusieurs formules de calculs. Mais notre choix se portera sur celle-ci. 87 Lusure de la colonne influence galement ces valeurs seuil. Il faut en tenir compte durant ses apprciations.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.21/42

Toutefois, des valeurs trop suprieures ne seraient pas ncessaires car elles prolongeraient inutilement lanalyse. Lidal est donc dobtenir une rsolution suffisante et non maximale.

Figure 19 : exemples reprsentatifs de facteurs de rsolution

2.1.2.3.1. Optimisation de la rsolution RS


Pour optimiser une sparation, il est possible dagir sur les trois paramtres suivants : le nombre de plateaux thoriques N ; le facteur de rtention k ; le facteur de slectivit (ce dernier facteur tant de loin le plus puissant).

2.1.2.3.1.1. Augmentation du nombre de plateaux N


Cette grandeur caractrisant lefficacit de la colonne, laugmenter correspondrait diminuer la largeur du pic, c'est--dire rtrcir la largeur du pic afin dviter quil chevauche le pic voisin. Il existe donc deux faons daugmenter lefficacit thorique de la colonne : allonger la colonne tout en restant dans une limite raisonnable (si le produits restent plus longtemps dans la colonne, ils risquent dtre altrs et daugmenter la dure danalyse) ; diminuer la hauteur dun plateau thorique en modifiant : la taille des particules de phase stationnaire ; la vitesse de la phase mobile (donc le dbit).

La seconde solution tant dailleurs bien meilleure !

2.1.2.3.1.2. Modification des facteurs de rtention


Ce phnomne ne peut concerner que le compos le plus retenu (c'est--dire le compos B dans notre exemple). Dans la limite de kB < 10, laugmentation de ce facteur kB entranera lamlioration de la sparation entre les deux pics. De plus, selon la dfinition du facteur de rtention, si celuici saccrot, alors les volumes de rtention suivent le mme processus. Ainsi, un compos apolaire voit son affinit pour la phase stationnaire apolaire augmenter si la polarit de la phase mobile augmente et inversement avec les composs polaires.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.22/42

2.1.2.3.1.3. Augmentation de la slectivit


Ce facteur tant directement li aux coefficients de partage des soluts88, il sagit de la meilleure solution pour optimiser une sparation. Diffrentes mthodes soffrent nous : Avant tout, dans le choix de la colonne ; Dans loptimisation du solvant de la phase mobile ; Enfin, dans la dilution de lchantillon.

Le schma suivant rsume parfaitement les diffrents cas de figure rencontrs : slectivit

faible

leve

N grand

N faible

N grand

Sparation correcte

Sparation correcte mais pic large

Sparation correcte

2.2. TRAVAUX PRATIQUES


2.2.1. But
Il sagit dune sance dinitiation la technique chromatographique liquide haute performance. Le but est la prise en main dune chane CLHP dans une optique danalyse qualitative et quantitative dun mlange de parabnes. Afin de raliser cet objectif, vous vous appuierez sur ltude de plusieurs thmes : leffet du pourcentage deau de la phase mobile ; leffet du type de solvants organiques de la phase mobile ; linfluence du greffage de la phase stationnaire ; les consquences du mode de travail utilis (comparaison modes isocratique et gradient).

88

Cf. la partie dtaille sur le coefficient de partage K et le facteur de rtention k.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.23/42

2.2.2. Matriels et ractifs


2.2.2.1. Gnralits sur les parabnes
2.1.2.3.1. Prsentation
Le terme de parabnes dsigne un groupe de produits chimiques largement utilis comme conservateurs dans lindustrie cosmtique, pharmaceutique et alimentaire pour leurs proprits antibactriennes et antifongiques. On estime que plus de 80 % des produits de beaut en contiennent, notamment des shampoings, des crmes hydratantes, des mousses raser et des gels nettoyants. Ce sont des esters de lacide parahydroxybenzoque, rsultant de lestrification de lacide parahydroxybenzoque avec un alcool. La structure gnrale dun parabne est donne par la figure suivante :

Figure 20 : structure gnrale d'un parabne

Bien que lon parle souvent de parabne au singulier, en fait il existe diffrents composs dans cette famille qui diffrent par la nature du groupe alkyle R. Les plus couramment utiliss sont : le mthylparabne, ou 4-hydroxybenzoate de mthyle (E218), et son sel de sodium (E219) ; lthylparabne, ou 4-hydroxybenzoate dthyle (E214), et son sel de sodium (E215) ; le propylparabne, ou 4-hydroxybenzoate de propyle (E216), et son sel de sodium (E217) ; lisopropylparabne ; le butylparabne ; lisobutylparabne ; le benzylparabne.

Figure 21 : structure chimique du mthylparabne, de lethylparabne, du propylparabne, du butylparabne et du benzylparabne

Les parabnes se trouvent aussi ltat naturel dans certains aliments tels que la mre, lorge, la fraise, le cassis, la vanille, la carotte ou loignon. Le propylparabne, par exemple, existe dans de nombreuses plantes et chez quelques insectes. On les trouve aussi dans le corps humain comme prcurseur du coenzyme Q10 o ils sont rapidement absorbs, mtaboliss et excrts.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.24/42

2.1.2.3.2. Utilisation
Leur utilisation principale est donc lie leur activit effective antibactrienne et antimycosique. Les parabnes les plus rencontrs sont le mthylparabne et le propylparabne dont les proprits de grande solubilit et deffet synergique compensent une activit antimicrobienne moins importante que celle produite par les parabnes de plus longues chanes carbones. Par exemple, on rajoute du mthylparabne dans les anesthsiques locaux pour limiter la contamination89. A ltat pur, le mthylparabne est incolore, insensible au chaud et au froid. En solution, il est stable dans un milieu acide (pH entre 3 et 6) et hydrolys facilement dans un environnement alcalin. Le propylparabne prsente les mmes caractristiques. Enfin, le mthylparabne, ltat solide (sous forme de poudre) est aussi utilis comme plastifiant pour certains mdicaments cause des ses proprits semiconductrices.

2.1.2.3.3. Toxicit
Les parabnes sont des conservateurs trs controverss. Pourtant, lorigine, ils sont apparus pour remplacer dautres conservateurs, les formaldhydes, jugs alors dangereux et dont lusage dornavant est limit certains vernis ongles. Leur emploi dans les produits de beaut a soulev une vive polmique depuis quune tude britannique, parue en 2004, les a accuss de provoquer des cancers du sein. Dautres tudes les souponnent dtre nfastes la fertilit masculine. Cependant, des recherches sont toujours en cours pour dterminer un risque avr dans lutilisation mdicamenteuse des parabnes et des seuils de toxicit. Aucune disposition rglementaire nexiste donc lheure actuelle. En labsence de confirmations des risques, lAFSSAPS (Agence franaise de Scurit Sanitaire des Produits de Sant) a dclar le 29 septembre 2005, que la commission de cosmtologie sest prononce favorablement la poursuite de lutilisation, aux conditions prvues par la rglementation actuelle, de quatre cinq des cinq parabnes les plus couramment utiliss (mthyl, thyl, propy, et butyl parabnes) . Remarques : face linquitude des consommateurs, la mention sans parabne apparat sur les emballages et devient un vritable argument de vente. Lutilisation de ces produits est notamment interdite dans les cosmtiques biologiques o ils sont remplacs par des mthodes de conservation naturelles (les huiles essentielles, par exemple).

2.2.2.2. Les solvants de qualit HPLC


Du mthanol MeOH. De lactonitrile ou mthane nitrile ACN. Du ttrahydrofurane THF. De leau ultrapure ( prlever dans le laboratoire de mtrologie).

2.2.2.3. Les colonnes utilises


Au cours de cette sance, vous allez tre amens utiliser ou exploiter : 3 colonnes de la srie Novapak de la marque Phenomenex ; Chaque colonne utilise possde des caractristiques communes mais galement, et cest un des thmes abords au cours de votre sance daujourdhui, des phases stationnaires diffrentes90.
89

Ces conservateurs ne remplacent absolument pas les techniques de strilisation mais aident seulement diminuer la charge microbiologique. 90 Pour connatre les diffrentes phases stationnaires, se rfrer au chapitre sur lappareillage.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.25/42

Par exemple, les colonnes Novapak ont les caractristiques suivantes rsumes dans le tableau 91:
Tableau rcapitulatif des caractristiques des colonnes Novapak
Nom Longueur (mm) Diamtre interne (mm) 3,9 3,9 3,9 Taille des particules (m) 4 4 4 Taille des pores (m) Aire (m2/g) Taux de C (%) Stabilit en pH

Novapak C8 Novapak C18 Novapak phenylhexyl

150 150 150

0,1 0,1 0,1

400 400 400

13,5 17,8 17,5

1,5-10 1,5-10 1,5-10

2.2.2.4. Liste du matriel


une seringue Hamilton de 100 L ; une seringue damorage de 25 mL ; des bouteilles de solvants de 1000 mL pour leau ultrapure, le mthanol (spcial HPLC) et lactonitrile (spcial HPLC) ; des colonnes de la famille Novapak (de 15 cm) : C8, C18 et phenyl-hexyl ; une solution de 5 parabnes compose de mthyl, thyl, propyl, butyl et benzyl parabne une concentration de 2 mg.L-1 chacun dans un mlange eau/MeOH 50/50 (v/v) ; une chane HPLC de Shimadzu : pompe, contrleur, dgazeur en ligne, dtecteur spectrophotomtrique bi-longueur donde UV/visible, pilote via ethernet sous Windows XP quipe du logiciel LC Solution ;

2.3. MODE OPERATOIRE


La chane HPLC que vous allez utiliser aujourdhui peut tre pilote manuellement ou informatiquement grce un logiciel spcifique de la chane. Dans notre cas, il sagit du logiciel LC Solution de chez Shimadzu.

2.3.1. Procdure de mise en route de la chane HPLC


Lensemble chromatographique Shimadzu, chane gradient, que vous allez utiliser, se prsente sous la forme dun assemblage dappareils monts en colonne qui comprend, de haut en bas : Les bouteilles de solvants en communication avec lensemble pompe + injecteur + colonne et dgazeur ; La bouteille rserve la rcupration des solvants dont il faut rgulirement surveiller le niveau afin dviter un ventuel dbordement ;
91

Toutes les donnes qui vont suivre sont issues du catalogue du fabricant et commerant Phenomenex 2010/2011.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.26/42

le dtecteur spectrophotomtrique UV/Visible ; le dgazeur en ligne ; le contrleur de la chane, qui est interfac avec lordinateur ; lensemble pompe + injecteur reli la colonne, elle-mme relie aux diffrentes bouteilles de solvants. Cet appareillage est une chane de type gradient, c'est--dire quelle permet de travailler en mode gradient et prsente 4 voies possibles (de A D) organises telles que : la voie A est pour leau ultrapure ; la voie B, pour le mthanol ; la voie C, pour lactonitrile ; la voie D, pour le ttrahydrofurane.

Etape 1 : allumage des appareils (en principe dj ralis)


1. Allumer le dtecteur et laisser chauffer la lampe UV (lecture 254 nm) pendant au moins 15 minutes. 2. Allumer le contrleur puis le PC puis lcran.

Q Q

Quel est lutilit du dgazeur en ligne ? Quel est son principe de fonctionnement ? Quel autre systme peut-on utiliser pour effectuer le mme type dopration ?

Etape 2 : purge des voies A, B, C et D


1. Les groupes 2BIO du jeudi matin et vendredi aprs-midi iront chercher de leau ultrapure dans le laboratoire de Mtrologie. Vrifier que le niveau de leau distill soit bien au-dessus de la flche. Appuyer sur Operate/Stand by et attendre que la conductivit soit 0,054 mS.cm-1 25 C, ce qui correspond une rsistivit de 18,2 M.cm. Enlever le capuchon, et basculer sur Production afin deffectuer le prlvement deau. Prlever environ 20 mL que vous jeterez, puis remplisser le flacon dun litre (afin dviter les contaminants92). Lorsque vous avez termin, rebasculer sur Recirculation, puis Stand by ; noublier pas de remettre le capuchon sous lappareil. Retourner au laboratoire TASS... 2. Les groupes 2BIO du jeudi matin et vendredi aprs-midi plongeront la canalisation A dans leau ultrapure, la canalisation B dans le mthanol, la canalisation C dans lactonitrile et ils laisseront la canalisation D dans le solvant de repos. 3. Pour tous les groupes : vrifier le niveau des autres bouteilles de solvants que vous allez utiliser pendant la sance. Il faut un minimum de 0,5 litres par rservoir. Remplir si ncessaire. (bouteille commerciale de mthanol et dactonitrile sous la hotte).

92

Cf. supra chapitre sur les phases mobiles.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.27/42

4. Double cliquer sur licne du logiciel LC Solution :

puis cliquer sur Analysis 1 :

et enfin sur OK. Le logiciel se connecte la chane HPLC (un bip se fait entendre). LC Ready doit apparatre. 5. Cliquer sur Advanced , puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data TP TASS Procdures, choisir le fichier : Mthode-Purge-voiesA-B-C-D. Downloader la mthode vers la chane HPLC. Ouvrir le bouton de purge noir sur la face avant de la pompe (1/4 de tour maximum !), puis appuyer sur purge (bouton gris en face avant du Contrleur LC20AD). 6. La purge est termine lorsque lon nobserve plus de bulles travers les circuits des voies (3 minutes doivent suffire, si ce nest pas le cas, vider les 20 mL de la seringue damorage et repurger !). Fermer le bouton de purge noir et vider la seringue damorage de 25 mL dans la bouteille de rcupration de solvants.

2.3.2. Importance du pourcentage de leau de la phase mobile dans la sparation dun mlange de parabnes
UTILISATION DUNE COLONNE C18 Ce premier thme a pour but de dmontrer, en utilisant la mme colonne, limportance du rle du pourcentage deau dans un mlange eau/mthanol sur la qualit de la sparation dun mlange de cinq parabnes de faible concentration (chaque parabne ayant une concentration de 2 mg.L-1).

2.3.2.1. Phase mobile : 40/60 H2O/MeOH raliser


Etape 1 : mise en place de la colonne :
POUR LA PREMIRE MISE EN PLACE, APPELER LE PROFESSEUR POUR DMONSTRATION ET BON POSITIONNEMENT DE LA COLONNE !
Pour chaque colonne, vous devrez procder comme suit : 1. Sassurer que la pression soit proche de 0 (quelques psi). 2. Chaque colonne possde un sens pour son installation. Celui-ci est indiqu par une flche sur le corps de la colonne. Installer alors la colonne selon le sens logique.

Daprs vous, quelle est la position et quel est le sens logique de la colonne ?

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.28/42

3. Desserrer les deux vis (en PEEK ou en inox selon la colonne) qui sont localises soit aux extrmits dune colonne soit celles dune union93.

Dans le cas de vis en inox, il faut utiliser une pince multiprise. Remarque 4. Faire dpasser lgrement de quelques mm la canalisation en inox travers la vis et visser lensemble sur la colonne chaque extrmit. Faire de mme avec la canalisation en PEEK. Selon vous, quel critre peut vous permettre de suspecter une ventuelle fuite de la

phase mobile ?

Aprs chaque changement de colonne, vous devez procder, avant toute injection, une phase dquilibration dans les conditions de travail souhaites. Remarque

Q Q

Quel est le but de lquilibration ?

Selon la colonne utilise et les conditions de travail choisies, la pression dans la colonne peut tre diffrente. votre avis, si cette pression est instable, cest--dire quelle prsente des fluctuations, quels problmes cela traduit-il ?

Etape 2 : cration de la mthode : mode Isocratique phase mobile : 40/60 H2O/MeOH pendant 15 min
Procder comme suit : ? FILE / NEW METHOD FILE onglet Data Acquisition ? Dans la fentre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 15,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 60 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : dccher Cell Temperature, puis sassurer que la longueur donde de travail est de 254 nm
93

Quand une chane est au repos pendant au minimum 2 jours, il vaut mieux installer une union entre deux vis et stocker la colonne ferme ses 2 extrmits par des vis spciales voire du parafilm afin dviter toute contamination ou dgradation de la phase stationnaire de la colonne.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.29/42

? Sauvegarder la mthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la mthode dans la Chane HPLC, en cliquant sur Download (Sassurer que le titre de la fentre gnrale corresponde bien au nom de la mthode qui vient dtre cre). ? Cliquer sur SINGLE START dans la barre verticale dassistance :

une fentre apparat, la remplir comme suit : Sample Name : phB action eau 40-60 (Vrifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Method File : C:\LabSolutions\Data\TP TASS\numro du groupe BIO\titre mthode Data File : C:\LabSolutions\Data\TP TASS\numro du groupe BIO\phB.lcd Data Description : Mlange 5 phB 2 mg/L sur C18 Novapak 40/60 eau/MeOH. Injection volume : 20 L Other Handling : ccher Report, puis aller chercher la feuille de style de rapport selon le chemin informatique : Data Procedures Reports-ETSL, puis dcocher Report. Cliquer sur OK (permet de faire lquilibration)

Etape 3 : obtention du chromatogramme


? Il apparat une nouvelle fentre : Data Acquisition Start. ( traduire) Ne surtout pas cliquer sur START ! Si sur la fentre de contrle, la dtection nest pas zro : faire un autozro, en appuyant sur le bouton zro du dtecteur. Prrincer la seringue de 100 L. Attendre que lquilibration de la colonne soit effective PENDANT 20 MINUTES.

Connaissant les caractristiques gomtriques de la colonne, dterminer son volume

de phase mobile sachant que la phase stationnaire occupe environ 30 % du volume. Connaissant le dbit, faire une estimation du temps de remplissage de la colonne par la phase mobile. On estime quil faut multiplier par un facteur 25 cette dernire valeur pour obtenir la dure dquilibration (ce facteur prend en compte, le temps de passage de la phase mobile dans toutes les canalisations, de la bouteille de solvant jusqu celle de rcupration, ainsi que de la dure mise par les quilibres chimiques entre les deux phases). Dterm iner la dure dquilibration. Prlever 4 5 fois la valeur du volume de la boucle dinjection (cest indiqu dessus).

POUR LA PREMIRE INJECTION APPELER LE PROFESSEUR POUR DMONSTRATION ET BONNE UTILISATION DE LA SERINGUE !
Sassurer que linjecteur est bien sur LOAD (manette noire vers le haut), enfoncer laiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer dlicatement laiguille, et basculer linjecteur sur INJECT (manette noire vers le bas).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.30/42

A Vrifier que le chromatogramme apparaisse en temps rel sur lcran (courbe noire) ! Noter la pression indique. La courbe rouge indique la pression. On peut zoomer, en temps rel, sur lensemble du chromatogramme en cliquant sur ; pour dzoomer, il suffit de faire Initialize Zoom.

Remarque

Q Q Q Q Q Q

Quel est le facteur de conversion entre les bars et les psi ?

Selon vous, quels critres, peuvent vous permettre de suspecter une ventuelle fuite de la phase mobile ? La solution que vous avez injecte est un mlange de 5 parabnes. structure topologique dun parabne ? Quelle est la

Comment procderiez-vous pour prparer 100 mL de ce mlange de 5 parabnes 2 mg.L , partir de solutions individuelles concentres de 20 mg.L-1 ?
-1

Pourquoi doit-on prlever un volume 4 5 fois plus important que celui de la boucle dchantillonnage ? Daprs-vous, quel est lordre logique dlution des 5 parabnes ? rponse. Justifier votre

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression


? Cliquer sur licne Data Analysis dans la barre verticale dassistance :

Lapplication LC Data Analysis dmarre : le chromatogramme apparat (la fentre du haut correspond au chromatogramme gnral, et celle du bas permet de choisir les zones de zoom)

Si vous ouvrez le fichier, il faut alors cliquer sur :

Remarque

LC Data analysis

puis sur Analyse :

Cliquer (dans la barre verticale dassistance) sur licne Wizard :

une fentre apparat, cliquer alors sur licne Program,

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.31/42

une nouvelle fentre apparat. Retirer les pics parasites se trouvant gnralement dans la ligne de base, pour cela, cliquer sur licne Integration Off to On pour encadrer verticalement les zones pics parasites, puis cliquer sur Simulate, puis OK. Revener sur la fentre principale de Wizard en cliquant sur OK, puis cliquer sur Suivant, slectionner tous les pics puis cliquer trois fois sur suivant, et dans chaque cellule Name, indiquer le nom de chaque pic puis cliquer sur terminer. Cliquer sur Apply to Method (dans la barre verticale dassistance),

pour exporter dans le fichier mthode les modifications ralises et lenregistrer dans le dossier 2BIO de votre groupe. Cliquer sur Data Report (dans la barre verticale dassistance),

faire un aperu avant impression, puis imprimer le chromatogramme si celui-ci vous convient. ? Fermer toutes les fentres (cliquer sur les croix noires et rouges en haut et droite des fentres), pour ne plus voir apparatre que la fentre : LC Real Time Analysis.

On peut modifier la dure danalyse en cours danalyse, pour cela, slectionner Change Analysis Time dans le menu Data acquisition. Remarque

2.3.2.2. Phase mobile : 50/50 H2O/MeOH (Rfrence) raliser


Etape 1 : mise en place de la colonne : dj ralis ! Etape 2 : cration de la mthode : mode Isocratique phase mobile : 50/50 H2O/MeOH pendant 30 min
Procder comme prcdemment : ? FILE / NEW METHOD FILE onglet Data Acquisition ? Dans la fentre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 30,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : dccher Cell Temperature, puis sassurer que la longueur donde de travail est de 254 nm

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.32/42

? Sauvegarder la mthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la mthode dans la Chane HPLC, en cliquant sur Download (Sassurer que le titre de la fentre gnrale corresponde bien au nom de la mthode qui vient dtre cre). ? Cliquer sur licne SINGLE START (dans la barre verticale dassistance) : une fentre apparat, il suffit dactualiser : Sample Name : phB action eau 50-50 (Vrifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mlange 5 phB 2 mg/L sur C18 Novapak 50/50 eau/MeOH. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme


? Il apparat une nouvelle fentre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! Si sur la fentre de contrle, la dtection nest pas zro : faire un autozro, en appuyant sur le bouton zro du dtecteur. Attendre que lquilibration de la colonne soit effective. Prlever 4 fois la valeur du volume de la boucle dinjection (cest indiqu dessus). Sassurer que linjecteur est bien sur LOAD, enfoncer laiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer dlicatement laiguille, et basculer linjecteur sur INJECT. A Vrifier que le chromatogramme apparaisse en temps rel sur lcran (courbe noire) ! Noter la pression indique.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procdure en bas de page 31 et haut de page 32 !

2.3.2.3. Phase mobile : 45/55 et 55/45 H2O/MeOH : Analyse des rsultats


? Ces deux chromatogrammes ont t raliss une pression denviron 1950 psi et sont tlcharger et imprimer, ladresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

Rendre les 4 chromatogrammes de mlange. Remplir un tableau rcapitulatif des donnes chromatographiques. Rapport Quel est limpact du pourcentage deau dans la phase mobile sur les temps de rtention des composs du mlange ? tayer votre affirmation en traant sous Regressi le graphe tR = f(%eau).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.33/42

Conclure sur lordre dlution des parabnes, sur la sparation effective ou pas, et sur la dure de lanalyse. Rapport Quel est le chromatogramme fournissant le meilleur compromis ?

2.3.3. Nature du solvant organique utilis


UTILISATION DUNE COLONNE C18 Ce second thme a pour but de dmontrer, en utilisant la mme colonne, limportance de la nature du solvant organique utilis sur la qualit de la sparation du mlange de cinq parabnes de faible concentration (chaque parabne ayant une concentration de 2 mg.L-1). Cette tude est base sur les proprits physico-chimiques de trois solvants utiliss classiquement en CLHP.

2.3.3.1. Phase mobile : 50/50 H2O/ACN raliser


Etape 1 : mise en place de la colonne : dj ralis ! Etape 2 : cration de la mthode : mode Isocratique phase mobile : 50/50 H2O/ACN pendant 6 min
Procder comme prcdemment : ? FILE / NEW METHOD FILE onglet Data Acquisition ? Dans la fentre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 6,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent C conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : dccher Cell Temperature, puis sassurer que la longueur donde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la mthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la mthode dans la Chane HPLC, en cliquant sur Download (Sassurer que le titre de la fentre gnrale corresponde bien au nom de la mthode qui vient dtre cre). ? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale dassistance) : une fentre apparat, il suffit dactualiser : Sample Name : phB action Solvant Organique 50-50 (Vrifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mlange 5 phB 2 mg/L sur C18 Novapak 50/50 eau/ACN. Cliquer sur OK

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.34/42

Etape 3 : obtention du chromatogramme


? Il apparat une nouvelle fentre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! Si sur la fentre de contrle, la dtection nest pas zro : faire un autozro, en appuyant sur le bouton zro du dtecteur. Attendre que lquilibration de la colonne soit effective. Prlever 4 fois la valeur du volume de la boucle dinjection (cest indiqu dessus). Sassurer que linjecteur est bien sur LOAD, enfoncer laiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer dlicatement laiguille, et basculer linjecteur sur INJECT. A Vrifier que le chromatogramme apparasse en temps rel sur lcran (courbe noire) ! Noter la pression indique.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procdure en bas de page 31 et haut de page 32 !

Q Q

Dfinir la notion de viscosit. Quelle est lunit du systme international de la viscosit dynamique ? Quelle est celle communment employe en HPLC ? Quelle est la consquence dune augmentation de la viscosit de la phase mobile ?

2.3.3.2. Phase mobile : 50/50 H2O/THF : Analyse des rsultats


? Ce chromatogramme a t ralis en 4 minutes une pression denviron 2250 psi, et est tlcharger et imprimer, ladresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

Rendre les 2 chromatogrammes de mlange. Remplir un tableau rcapitulatif des donnes chromatographiques. Reprsenter sous forme dhistogramme, le temps de rtention de chaque compos du mlange en fonction de la phase organique utilise (MeOH, ACN, et THF). Est-ce que les temps de rtention des 5 parabnes suivent le mme ordre de sortie que lordre des coefficients de polarit des 3 solvants organiques tests ? Comparer la viscosit des solvants utiliss avec la pression releve en tte de colonne. Est-ce conforme avec la loi de variation de Darcy ? Conclure sur limportance de la polarit, de la viscosit des solvants. Conclure sur llution des parabnes (sparation effective ou pas, dure de lanalyse).

Rapport

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.35/42

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire


UTILISATION DUNE COLONNE C8 & Phenyl-hexyl Le but de cette tude est de dmontrer que la nature du greffage de la phase stationnaire contenue dans la colonne influence nettement la qualit de la sparation dun mlange de cinq parabnes.

2.3.4.1. Utilisation d'une colonne phnyl-hexyl avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH raliser
Etape 1 : mise en place de la colonne :
? Cliquer sur licne Instrument On/Off (dans la barre des menus) : pour couper la pompe, vrifier que la pression est proche de 0 (quelques psi). ? Enlever la colonne C18, et placer la colonne phnyl-hexyl dans le bon sens, en prenant toutes les prcautions qui simposent (cf bas de page 28 et haut de page 29), si vous ne voulez pas tre confront des problmes de fuites ! ? Cliquer sur licne Instrument On/Off pour remettre en fonctionnement la pompe.

Etape 2 : cration de la mthode : mode Isocratique phase mobile : 50/50 H2O/MeOH pendant 17 min
Procder comme prcdemment : ? FILE / NEW METHOD FILE onglet Data Acquisition ? Dans la fentre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 17,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 50 %, Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : dccher Cell Temperature, puis sassurer que la longueur donde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la mthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la mthode dans la Chane HPLC, en cliquant sur Download (Sassurer que le titre de la fentre gnrale corresponde bien au nom de la mthode qui vient dtre cre).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.36/42

? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale dassistance) : une fentre apparat, il suffit dactualiser : Sample Name : phB nature colonne phenyl-hexyl 50-50 (Vrifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mlange 5 phB 2 mg/L sur phenyl-hexyl Novapak 50/50 eau/MeOH. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme


? Il apparat une nouvelle fentre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! Si sur la fentre de contrle, la dtection nest pas zro : faire un autozro, en appuyant sur le bouton zro du dtecteur. Attendre que lquilibration de la colonne soit effective PENDANT 20 MINUTES (la dure dquilibrage est plus longue lors du changement de colonne.) Prlever 4 fois la valeur du volume de la boucle dinjection (cest indiqu dessus). Sassurer que linjecteur est bien sur LOAD, enfoncer laiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer dlicatement laiguille, et basculer linjecteur sur INJECT. A Vrifier que le chromatogramme apparaisse en temps rel sur lcran (courbe noire) ! Noter la pression indique.

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procdure en bas de page 31 et haut de page 32 !

2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des rsultats
? Ce chromatogramme a t ralis en 18 minutes une pression de 2177 psi, et est tlcharger et imprimer, ladresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

Q Q

Que signifie la dnomination hexyl-phnyl pour la colonne que vous avez utilise ? Quel est le rle du groupement hexyl ?

Rendre les 2 chromatogrammes de mlange. Remplir un tableau rcapitulatif des donnes chromatographiques. Tracer sous Regressi, la courbe tR = f(nombre de C de la colonne). Commenter la courbe. Rapport Que dire de la sparation des deux derniers parabnes : butylparabne et benzylparabne ? Conclure sur llution des parabnes (sparation effective ou pas, dure de lanalyse). E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS HPLC 2.37/42

2.3.5. Optimisation de sparation en mode isocratique : Analyse des rsultats


Q Q
Daprs vos conclusions, indiquez les conditions de travail et le type de colonne quil faudrait judicieusement choisir pour obtenir une sparation correcte de votre mlange ? Quels paramtres pensez-vous quil est utile de changer (un par un, bien entendu)

pour obtenir la meilleure sparation des cinq parabnes et ce dans un temps danalyse de 10 minutes maximum ?

2.3.6. Utilisation d'un gradient d'lution


UTILISATION DUNE COLONNE Phenyl-hexyl Nous allons maintenant aborder le dernier thme de notre sance : linfluence du mode de travail choisi pour raliser la sparation du mlange de cinq parabnes. Toutes les analyses prcdentes ont t obtenues dans des conditions dites isocratiques. Nous allons, puisque la chane le permet, travailler en mode gradient.

Q Q

Quels sont les avantages et les inconvnients du mode gradient par rapport au mode isocratique ? Comment procderiez-vous pour raliser cette comparaison entre les deux modes de travail utiliss ? Indiquez vos prvisions de programmation ?

2.3.6.1. Gradient linaire eau/MeOH 55 65 raliser


Etape 1 : mise en place de la colonne : dj ralise ! Etape 2 : cration de la mthode : mode gradient linaire phase mobile : 55 65 eau/MeOH pendant 10 min
Procder comme prcdemment : ? FILE / NEW METHOD FILE onglet Data Acquisition ? Dans la fentre Instrument Parameters View : cliquer sur Advanced onglet Data Acquisition : LC Stop Time : 10,00 min, puis cliquer sur Apply to All acquisition time, onglet Pump : Mode Low pressure gradient Total Pump A Flow : 1,0 mL/min, Solvent B conc : 55 %,

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.38/42

LC Time Prog. : remplir le tableau comme indiqu ci-dessous : 1 2 3 4 Time 0,01 4 15 15 Module Controller Pumps Pumps Controller Action Start B.Conc B.Conc Stop Value 55 65

Remarque : 1 : la ligne 4 est dj crite par dfaut. Remarque : 2 : Cliquer sur Draw curve pour observer la courbe de programmation de solvant. Pressure limits (Pump A), Max : 200 bar ; Detector A : dccher Cell Temperature, puis sassurer que la longueur donde de travail est de 254 nm ? Sauvegarder la mthode, FILE / SAVE / METHOD FILE SAVE AS, dans le dossier Data TP TASS, dans le dossier du nom de votre groupe 2BIO ? Charger la mthode dans la Chane HPLC, en cliquant sur Download (Sassurer que le titre de la fentre gnrale corresponde bien au nom de la mthode qui vient dtre cre). ? Cliquer sur SINGLE START (dans la barre verticale dassistance) : une fentre apparat, il suffit dactualiser : Sample Name : phB Gradient linaire Phenyl-Hexyl - phase mobile 55-65 eau/MeOH (Vrifier que le fichier Method File se trouve au bon endroit sur le disque dur) Data Description : Mlange 5 phB 2 mg/L sur Phenyl-Hexyl Novapak 55/65 en gradient linaire. Cliquer sur OK

Etape 3 : obtention du chromatogramme


? Il apparat une nouvelle fentre : Data Acquisition Start. Ne surtout pas cliquer sur START ! Si sur la fentre de contrle, la dtection nest pas zro : faire un autozro, en appuyant sur le bouton zro du dtecteur. Attendre que lquilibration de la colonne soit effective PENDANT 10 MINUTES. Prlever 4 fois la valeur du volume de la boucle dinjection (cest indiqu dessus). Sassurer que linjecteur est bien sur LOAD, enfoncer laiguille horizontalement, appuyer sur le piston, puis retirer dlicatement laiguille, et basculer linjecteur sur INJECT. A Vrifier que le chromatogramme apparaisse en temps rel sur lcran (courbe noire) ! Noter la pression indique en dbut et en fin danalyse. A Arrter 10 min, lanalyse en cliquant sur Acquisition Stop.

Pourquoi la pression en tte de colonne est diffrente en dbut et en fin danalyse ?

Etape 4 : traitement du chromatogramme et impression : cf procdure en bas de page 31 et en haut de page 32 !

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.39/42

2.3.6.2. Gradient linaire H2O/MeOH 50 60 : Analyse des rsultats


? Le chromatogramme correspondant a t ralis une pression initiale de 2310 psi et une pression finale de 2240 psi, et est tlcharger et imprimer, ladresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

2.3.6.3. Gradient exponentiel H2O/MeOH (courbe -10 et courbe +10) : Analyse des rsultats
? Les 2 chromatogrammes correspondants ont t raliss (pressions sensiblement identiques celles que vous avez obtenus en gradient linaire), et sont tlcharger et imprimer, ladresse suivante : http://ligodin.free.fr/Biophy2.html

Imprimer les 4 chromatogrammes. Comparer les chromatogrammes, (chromatogramme obtenu avec la colonne Phenyl-Hexyl en 50/50 H2O/MeOH en mode isocratique) et ceux obtenus en mode gradient linaire. Rapport Comparer limpact du choix des courbes -10 et +10, en terme de sparation, de temps danalyse, et de bosse (caractristique du systme gradient, au temps du changement de conditions de travail pendant lanalyse). Quel est le meilleur programme de gradient et pourquoi ? Conclure, en indiquant quels sont les avantages et les inconvnients de ce mode de travail ?

2.3.7. Extinction de la chane HPLC


Etape 1 : retrait de la colonne en place : Etape raliser exclusivement par les groupes du jeudi & vendredi aprs-midi
Pour chaque colonne, vous devrez procder comme suit : 1. Sassurer que le dbit est sur 0 mL/min. 2. Desserrer les deux vis (en PEEK ou en inox selon la colonne) qui sont localises aux extrmits de la colonne pour la remplacer par lunion.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.40/42

Etape 2 : circulation du solvant eau/MeOH 50/50 dans les 2 voies A et B pendant 20 minutes : Etape raliser par les groupes du jeudi et du vendredi aprs-midi
1. Cliquer sur longlet Data Acquisition , puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data TP TASS procdures, choisir le fichier : Solvantderepos-voiesAB. Downloader la mthode dans la chane HPLC. 2. Cliquer sur SINGLE START : une fentre apparat, cliquer sur OK.

Etape 3 : circulation du solvant de repos dans les 4 voies pendant 20 minutes : Etape raliser exclusivement par les groupes du jeudi & vendredi aprs-midi
1. Plonger les 4 canalisations des 4 voies dans le mlange de repos H2O/MeOH 80/20. 2. Cliquer sur longlet Data Acquisition , puis dans File, faire Open Method File, dans le dossier Data TP TASS procdures, choisir le fichier : Mthode-Solvantrepos. Downloader la mthode dans la chane HPLC. 3. Cliquer sur SINGLE START : une fentre apparat, cliquer sur OK.

Etape 4 : teindre la chane HPLC : Tous les groupes


1. Linjecteur doit tre sur LOAD. Vider dans la bouteille de rcupration adquate des solvants (sous la hotte) le contenu des bouteilles poubelle (celle de la chane et celle de linjecteur). 2. Eteindre lensemble de lappareillage : dtecteur, contrleur-Pompe, PC, et cran.

2.4. CONCLUSION GENERALE


Conclure sur lensemble des manipulations ralises. Rapport

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.41/42

ANNEXE : PROPRIETES PHYSIQUES DE QUELQUES SOLVANTS


Solvants n-dcane isooctane n-hexane cyclohexane butylther trithylamine isopropylther tolune p-xylne benzne benzylther mthylchlorure thylchlorure butylalcool butanol tetrahydrofurane thylactate propanol-1 propanol-2 chloroforme mthylactate mthylthylctone cyclohexanone nitrobenzne benzonitrile dioxane thanol pyridine nitrothane actone benzylalcool mthoxythanol actonitrile acide actique dimthylforamide dimthylsulfoxyde mthanol formamide eau Indice de polarit (-) -0,3 -0,4 0,0 0,0 1,7 1,8 2,2 2,3 2,4 3,0 3,3 3,4 3,7 3,9 3,9 4,2 4,3 4,3 4,3 4,3 4,4 4,5 4,5 4,5 4,6 4,8 5,2 5,3 5,3 5,4 5,5 5,7 6,2 6,2 6,4 6,5 6,6 7,3 9,0 Viscosit (cPo) 0,92 0,50 0,31 0,98 0,70 0,38 0,33 0,59 0,70 0,65 5,33 0,44 0,79 3,00 3,01 0,55 0,47 2,30 2,35 0,57 0,45 0,43 2,21 2,03 1,22 1,54 1,20 0,94 0,68 0,32 5,80 1,72 0,37 1,26 0,90 2,24 0,60 3,76 1,00 Miscibilit (-) 29 29 29 28 26 26 23 24 21 20 20 15 17 19 15 15 19 15,17 17 28 14,20 15,19 17 14 16 15,17 13 13 11,17 14 12 9 12 3 -

Si la diffrence des miscibilits est suprieure 14, les deux solvants concerns ne sont pas miscibles. 1 cPo = 10-3 Pa.s.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

HPLC 2.42/42

Elments de rponses aux questions de prparation

2.3. MODE OPERATOIRE


2.3.1. Procdure de mise en route de la chane HPLC
Q
Quel est lutilit du dgazeur en ligne ? Quel est son principe de fonctionnement ?

Le dgazeur en ligne permet d'liminer en continu les gaz dissous dans les liquides l'aide d'une membrane spciale en rsine synthtique (Tflon). Grce au raccordement de ce dgazeur la pompe pour la chromatographie liquide haute performance, les gaz dissous dans les solvants de phase mobile peuvent tre dgazs en continu sans entraner de changement dans la composition de la phase mobile. Ceci peut empcher le dgazage et la formation de bulles dans le systme, pouvant provoquer un dysfonctionnement au niveau de la pompe, la formation d'un bruit de fond sur la ligne de base ou des variations importantes de la ligne de base. Le dgazeur en ligne amliore galement la stabilit et la reproductibilit de l'analyse HPLC. Ce dgazeur est muni de trois ou de cinq tubulures indpendantes mais le processus de dgazage et les diffrentes fonctions sont identiques pour chaque tubulure. La figure ci-dessous illustre le principe de fonctionnement du dgazeur.

La phase mobile (liquide) dgazer passe par une membrane spciale en rsine synthtique place dans la chambre vide. Le gaz dissous a une taille molculaire infrieure et une mobilit suprieure celles du liquide ainsi qu'une affinit plus forte pour la membrane en rsine. Il passe travers la membrane dans la chambre vide, est vacu du dgazeur et, par consquent, est limin du solvant.

Quel autre systme peut-on utiliser pour effectuer le mme type dopration ?

On effectue un barbotage dans chaque flacon de solvants laide dHlium de haute puret (4.6), cest--dire 99,996 %.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.1/6

2.3.2. Importance du pourcentage de leau de la phase mobile dans la sparation dun mlange de parabnes
2.3.2.1. Phase mobile : 40/60 H2O/MeOH raliser Q
Daprs vous, quelle est la position et quel est le sens logique de la colonne ?

La colonne doit tre positionne entre linjecteur et le dtecteur dans le sens du flux indiqu par le constructeur de la colonne. Remarque : les colonnes sont remplies et tasses selon un sens bien dtermin par le constructeur.

Selon vous, quel critre peut vous permettre de suspecter une ventuelle fuite de la

phase mobile ? Une chute brutale de la pression nous indiquera une fuite importante.

Quel est le but de lquilibration ?

Le but de lquilibration est la dure ncessaire pour que les quilibres chimiques entre les phases stationnaires et les phases mobiles soient tout fait effectives.

Selon la colonne utilise et les conditions de travail choisies, la pression dans la

colonne peut tre diffrente. votre avis, si cette pression est instable, cest--dire quelle prsente des fluctuations, quels problmes cela traduit-il ? Cela traduit un problme de fuites.

Connaissant les caractristiques gomtriques de la colonne, dterminer son volume

de phase mobile sachant que la phase stationnaire occupe environ 30 % du volume. Connaissant le dbit, faire une estimation du temps de remplissage de la colonne par la phase mobile. On estime quil faut multiplier par un facteur 25 cette dernire valeur pour obtenir la dure dquilibration (ce facteur prend en compte, le temps de passage de la phase mobile dans toutes les canalisations, de la bouteille de solvant jusqu celle de rcupration, ainsi que de la dure mise par les quilibres chimiques entre les deux phases). Dterm iner la dure dquilibration.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.2/6

Les colonnes utilises ont une longueur de 150 mm pour un diamtre intrieur de 3,9 mm. Le volume de la colonne est donc de Vcolonne = 150 x

3,92 = 570 mm3 = 0,57 mL, do le 4

volume de phase mobile : Vphase mobile = 70 % Vcolonne = 0,40 mL. Le dbit utilis est D = 1 mL/min, do la dure de remplissage : tremplissage = Vphase mobile/D = 0,40 min. Finalem ent, on estim e que la dure dquilibration est de 10 m inutes.

Quel est le facteur de conversion entre les bars et les psi ?

Facteurs de conversion : 1 psi = 0,06895 bar et 1 bar = 14,50326 psi. Remarque : Le p.s.i., pour pound per square inch ( livre par pouce carr , lb/in), est une unit de mesure de contrainte et de pression anglo-saxonne.

La solution que vous avez injecte est un mlange de 5 parabnes.

Quelle est la

structure topologique dun parabne ?

Q
-1

Comment procderiez-vous pour prparer 100 mL de ce mlange de 5 parabnes 2

mg.L , partir de solutions individuelles concentres de 20 mg.L-1 ? On prlve 10 mL de chaque solution individuelle que lon place dans une fiole jauge de 100 mL. On complte avec un mlange H2O/MeOH 50/50 jusquau trait de jauge, puis on homognise. On obtient alors 100 mL dun mlange de 5 parabnes 2 mg.L-1.

Pourquoi doit-on prlever un volume 4 5 fois plus important que celui de la boucle

dchantillonnage ? Pour tre certain que la boucle ne dlivrera que le volume indiqu par cette dernire, et donc pour obtenir une bonne reproductibilit de linjection. Cest important, surtout pour les mesures quantitatives.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.3/6

Daprs-vous, quel est lordre logique dlution des 5 parabnes ?

Justifier votre

rponse. tant donn que lon travaille en phase inverse (phase stationnaire plutt apolaire, et phase mobile plutt polaire), ce sont les parabnes les plus polaires qui sortiront en premier, donc ceux qui possdent un radical alkyle R chane carbone la plus courte. Dans le cas de cette tude, on doit luer en premier le mthylparabne, puis lthylparabne, le propylparabne, le butylparabne et enfin le benzylparabne.

2.3.3. Nature du solvant organique utilis


2.3.3.1. Phase mobile : 50/50 H2O/ACN raliser Q
Dfinir la notion de viscosit. Quelle est lunit du systme international de la viscosit dynamique ? Quelle est celle communment employe en HPLC ? La viscosit (du latin viscum, gui) peut tre dfinie comme la rsistance l'coulement uniforme et sans turbulence se produisant dans la masse d'une matire. d'un gradient de vitesse d'coulement dans la matire. Lorsque la viscosit augmente, la capacit du fluide s'couler diminue. La viscosit dynam ique (ou encore (tha)) se mesure en pascal-seconde (Pa.s), cette unit ayant remplac le poiseuille (Pl) qui a la mme valeur. On trouve encore parfois l'ancienne unit du systme CGS, la poise (Po) : 1 Pas = 10 Po. Remarque : La viscosit cinmatique (nu) s'obtient en divisant la viscosit dynamique par la masse volumique . Elle s'exprime en m/s. Dans le systme CGS la viscosit cinmatique tait exprime en La viscosit dynamique (mu) correspond la contrainte de cisaillement qui accompagne l'existence

stokes (St) ou en centistokes (cSt). La conversion est immdiate, puisque 1 St = 1 cm/s = 10-4 m/s et 1 cSt = 1 mm/s = 10-6 m/s.

Quelle est la consquence dune augmentation de la viscosit de la phase mobile ?

Pour une colonne donne et un dbit donn, la pression en tte de colonne est directement proportionnelle la viscosit (daprs la loi de Darcy). Une augmentation de la viscosit entranera ncessairement une augmentation de la pression.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.4/6

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire


2.3.4.2. Utilisation dune colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des rsultats Q
Que signifie la dnomination hexyl-phnyl pour la colonne que vous avez utilise ?

Cela signifie que la colonne possde le greffon :

Quel est le rle du groupement hexyl ?

Le groupement hexyl permet de dsencombrer striquement la phase stationnaire, et elle permet dans le mme temps de diminuer les interactions entre cycles aromatiques, ce qui permet daugmenter la vitesse dlution des composs groupements aromatiques. Dautre part, la phase stationnaire est moins fragile avec lutilisation de ce type de groupement.

2.3.5. Optimisation de sparation : Analyse des rsultats


Q
Daprs vos conclusions, indiquez les conditions de travail et le type de colonne quil faudrait judicieusement choisir pour obtenir une sparation correcte de votre mlange ? Pour obtenir une sparation correcte du mlange de cinq parabnes, nous sommes amens procder selon les conditions suivantes : Travailler en mode isocratique avec un mlange de solvants de phase mobile de 50/50 H2O/MeOH ; Utiliser une colonne type phnyl-hexyl ; Utiliser un dbit de 1 mL/min ;

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.5/6

Utiliser le mlange inconnu des cinq parabnes 2 mg.L-1.

Cependant, il demeure un inconvnient : un temps danalyse beaucoup trop long. En effet, il faut compter environ 30 minutes pour obtenir la sortie correcte du dernier parabne.

Quels paramtres pensez-vous quil est utile de changer (un par un, bien entendu)

pour obtenir la meilleure sparation des cinq parabnes et ce dans un temps danalyse de 10 minutes maximum ? Conditions de travail optimales pour que la rsolution soit acceptable en une dure danalyse infrieure 10 minutes. Ces nouvelles conditions sont les suivantes : Phase mobile de 38/62 eau/MeOH ; Dbit dans la colonne de 1,2 mL/min ; Utiliser une colonne de type phenyl-hexyl ; Pression dans la colonne de lordre de 2500 psi.

2.3.6. Utilisation dun gradient dlution


Q
quels sont les avantages et les inconvnients du mode gradient par rapport au mode isocratique ? Ce mode de travail prsente un avantage important en analyse chromatographique : le gain de temps. Mais les inconvnients sont galement nombreux : drive de la ligne de base ; matriel plus coteux ; surconsommation de solvants (travail en circuit ferm impossible) ; accroissement en volume et en poids du nombre de bouteilles de rejet et/ou rcupration ; sparation plus ou moins acceptable.

Il faut donc noter que, dans certains cas et selon le matriel disposition (comme les colonnes), le mode gradient nest pas la technique la mieux adapte pour sparer correctement tous les mlanges de produits.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.6/6

Comment procderiez-vous pour raliser cette comparaison entre les deux modes de

travail utiliss ? Indiquez vos prvisions de programmation ? En mode isocratique, on arrive gnralement sparer tous les composs avec du temps. Lutilisation dun gradient consiste liminer les trop grandes dures de sparation entre pics afin de diminuer la dure totale danalyse, mais il faut faire attention de ne pas provoquer de colution. On peut donc traiter le chromatogramme par partie en appliquant judicieusement diffrents gradients spars ou pas par des paliers isocratiques.

2.3.6.1. Gradient linaire H2O/MeOH 55 65 raliser Q


Pourquoi la pression en tte de colonne est diffrente en dbut et en fin danalyse ?

Parce que la viscosit du mlange nest pas la mme en dbut et en fin danalyse. En effet la proportion du mlange de solvants varie au cours de llution. .

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Prparation 2.7/6

TP N2 : RAPPORT 2.3. MODE OPERATOIRE


2.3.2. Importance du pourcentage de leau de la phase mobile dans la sparation dun mlange de parabnes
2.3.2.3. Phase mobile : 45/55 et 55/45 H2O/MeOH : Analyse des rsultats
% eau 40 45 50 55 MetPHB EtPHB temps de rtention (min) PropylPHB ButPHB BenzPHB % solvant 60 55 50 45

Quel est limpact du pourcentage deau dans la phase mobile sur les temps de rtention des composs du mlange ? tayer votre affirmation en traant sous Regressi le graphe tR = f(%eau).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.1/6

Conclure sur lordre dlution des parabnes, sur la sparation effective ou pas, et sur la dure de lanalyse. Quel est le chromatogramme fournissant le meilleur compromis ?

2.3.3. Nature du solvant organique utilis


2.3.3.2. Phase mobile : 50/50 H2O/THF : Analyse des rsultats
solvants Mthanol (50 %) Actonitrile (50 %) Ttrahydrofurane (50 %) MetPHB EtPHB temps de rtention (min) PropylPHB ButPHB BenzPHB solvants MeOH ACN THF

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.2/6

Est-ce que les temps de rtention des 5 parabnes suivent le mme ordre de sortie que lordre des coefficients de polarit des 3 solvants organiques tests Comparer la viscosit des solvants utiliss avec la pression releve en tte de colonne. Est-ce conforme avec la loi de variation de Darcy ? Conclure sur limportance de la polarit, de la viscosit des solvants. Conclure sur llution des parabnes (sparation effective ou pas, dure de lanalyse).

2.3.4. Greffage de la phase stationnaire


2.3.4.2. Utilisation d'une colonne C8 avec phase mobile : 50/50 H2O/MeOH : Analyse des rsultats
nombre de Carbone 8 12 18 MetPHB EtPHB temps de rtention (min) PropylPHB ButPHB BenzPHB colonne C8 phenyl C18

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.3/6

Tracer sous Regressi, la courbe tR = f(nombre de C de la colonne). Commenter la courbe.

Que dire de la sparation des deux derniers parabnes : butylparabne et benzylparabne ? Conclure sur llution des parabnes (sparation effective ou pas, dure de lanalyse).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.4/6

2.3.6. Utilisation d'un gradient d'lution


2.3.6.3. Gradient exponentiel H2O/MeOH (courbe -10 et courbe +10) : Analyse des rsultats

Comparer les chromatogrammes, (chromatogramme obtenu avec la colonne Phenyl-Hexyl en 50/50 H2O/MeOH en mode isocratique) et ceux obtenus en mode gradient linaire. Comparer limpact du choix des courbes -10 et +10, en terme de sparation, de temps danalyse, et de bosse (caractristique du systme gradient, au temps du changement de conditions de travail pendant lanalyse).

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.5/6

Quel est le meilleur programme de gradient et pourquoi ? Conclure, en indiquant quels sont les avantages et les inconvnients de ce mode de travail ?

2.4. Conclusion gnrale


Conclure sur lensemble des manipulations ralises. Discuter des difficults ventuellement rencontres.

E.T.S.L. 95, rue du Dessous des Berges 75013 PARIS

Rapport 2.6/6