Université Ferhat Abbas Sétif -1 Année Universitaire : 2019-2020

Faculté des sciences de la nature et de la vie Module : Analyse instrumentale

Département de Biologie et Ecologie végétales Biotechnologie végétale et Amélioration (L3)

La chromatographie en phase gazeuse (CPG)

1. Introduction
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) (gas chromatography, GC, en anglais) est une technique
qui permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature et de
volatilité très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être
vaporisés par chauffage sans décomposition. C’est également le seul type de chromatographie qui
utilise un gaz comme phase mobile, ce qui nécessite un appareil spécial, appelé communément le
chromatographe à gaz.( La phase mobile est un gaz vecteur).

selon la phase stationnaire , Il existe deux types de chromatographies en phase gazeuse:

 Chromatographie gaz-solide (CGS) : C’est une chromatographie d’adsorption : la phase sta-

tionnaire est un solide poreux, réservé à l’analyse de mélanges de gaz ou de liquides à bas
points d’ébullition.

 Chromatographie gaz-liquide (CGL) : C’est une chromatographie de partage : la phase sta-

tionnaire est un liquide immobilisé sur un support solide par imprégnation ou par greffage.

2. Appareillage et matériaux

La phase mobile est un gaz vecteur

1
 Quel que soit le chromatographe à gaz, on retrouve toujours les principales composantes sui-
vantes :

a. Phase mobile

La phase mobile entraînant les composés dans la colonne est un gaz de préférence chimique-
ment inerte appelé gaz vecteur (il ne doit pas réagir avec les constituants du mélange à sépa-
rer). Les principaux sont l’hélium He, l’argon Ar, l’azote N2 et le dioxyde de carbone CO2.
Ils sont livrés dans des bonbonnes surmontées d’un régulateur de pression. Ces gaz doivent
être de pureté analytique, car les impuretés sont responsables des bruits de fond sur le chro-
matogramme. Le choix du gaz vecteur dépend principalement du type de détecteur de l’ap-
pareil.

b. Injecteur

Il sert à l’introduction du mélange à analyser dans la colonne.

Cette opération est faite:

- à l’aide d’une micro seringue pour les liquides et les solutions.

- à l’aide d’une vanne à boucles pour les mélanges gazeux.

2
 En règle générale, la chambre d’injection doit être à une température plus élevée que celle

de la colonne pour faciliter l’évaporation des échantillons.

Le choix de l’injecteur est dicté par le type de colonne utilisée (remplie ou capillaire) et par

la nature des produits à séparer (leur résistance à la décomposition lorsqu’ils sont soumis

à de hautes températures).

Il y’à plusieurs mode d’injections :

 Injection par vaporisation directe

l'introduction du mélange se fait par l'intermédiaire d'une micro seringue dont le volume varie

généralement de 1 à 10 µL et dont l’aiguille a un diamètre de l’ordre de 0,15 mm à travers un

diaphragme, ou septum, en élastomère dans une chambre à vaporisation instantanée située au

sommet de la colonne. La chambre d’injection est habituellement maintenue à environ 50°C

au-dessus du point d’ébullition du constituant le moins volatil de l’échantillon. Ce système

est conçu pour les colonnes remplies.

 Injection « split/splitless »

Il s’agit d’injecteurs pouvant fonctionner suivant deux modes, avec ou sans division (encore

appelés split ou splitless). Ce système est conçu pour les colonnes capillaires.

o En mode split (avec diviseur de flux), le gaz vecteur arrive avec un grand débit dans la
chambre de vaporisation ; une vanne de fuite sépare le courant gazeux en deux parties dont la
plus petite est la seule à pénétrer dans la colonne. Seulement 1% de l’échantillon injecté passe
réellement sur la colonne. L’autre partie (99%) s’échappe par un système de fuite. L'injection
Split est nécessaire pour les échantillons très concentrés

3
 Le mode splitless (sans diviseur de flux): si l'on dispose d'un produit très minori-

taire ou très dilué dans un solvant, on peut choisir de l'injecter en mode "splitless",

dans ce cas tout le produit injecté se retrouve dans la colonne. Il faut dans ce cas baisser

la température du four vers 20-30°C sous la température d'ébullition du solvant.

4
c. Colonnes

Ils existent 2 catégories de colonnes en CPG, les colonnes remplies et les colonnes capillaires.

 Colonnes remplies (à garnissage) (les plus anciennes) : Les colonnes remplies

sont un diamètre de quelques millimètres et une longueur de l’ordre du mètre. Elles
sont remplies de granules de support poreux,inerte [généralement Le support le plus
utilisé est la terre de diatomées (silicates fossiles) ], dont la surface est imprégnée ou
greffée avec la phase stationnaire.

 Colonnes capillaires : Les colonnes standard sont en quartz fondu (silice très pure) et
entourées d'une gaine de polymère souple, ce qui leur confère une grande résistance à
la torsion. Elles ont entre 10 et 100 m de long et leur diamètre intérieur est entre 0,10
ou 0,70 mm. La phase stationnaire est greffée sur les parois de la colonne, l'épaisseur
de phase stationnaire varie entre 0,10 mm et 5 mm.

5
 d. Choix des phases stationnaires :
Ce choix se fait en fonction de la nature des substances à séparer.

Composition Phases stationnaires (Colonnes)

non-polaires (liaisons C-H et C-C)
(exp: n-alcanes)
Polaires
liaisons C-H et C-C
liaisons C-Cl, -Br, -F
liaisons C-N, -O, -P, S
(exp: alcools, éthers, thiols, amines, acides
carboxyliques, esters et cétones)
polarisables (exp : alcènes aromatiques)
liaisons C-H et C=C et acétyléniques
SPB-octyl
poly(méthylsiloxane), SE-30
SPB-5, PTE-5, SE-54
poly(méthylphénylsiloxane)
poly(cyanopropylméthylsiloxane)
PEG, Carbowax 10, 20M
poly(cyanopropylsiloxane)
poly(cyanopropylphénylsiloxane)
TCEP

e. four
La colonne est contenue dans un four de type chaleur tournante, dont la température est
précisément ajustable (typiquement entre 20 °C et 350 °C) et programmable. Les températures
utilisables en pratique dépendent des domaines de stabilité en température de la colonne
utilisée, et de ceux des composés analysés.

Une méthode pour laquelle la température est gardée constante tout au long de l’analyse est
appelée « isotherme ». A l’inverse, on peut choisir d’augmenter la température du four au
cours de l’analyse : cette méthode est appelée « gradient ».

f. Principaux détecteurs

En sortie de colonne, les analytes rencontrent le détecteur, aujourd’hui généralement couplé

à un enregistreur numérique du signal qui permet son traitement. Cet élément mesure en
continu une grandeur proportionnelle à la quantité des différents analytes. Il en existe de
nombreux modèles, dont

 Un détecteur à thermo-conduction ou catharomètre, basé sur le principe du pont

de Wheatstone : le passage des composants va faire varier la tension, cette variation
est due à la différence de conductibilité de chaque composant.

Caractéristiques: - Volume de 20 µL à 10 µL
- Répond en concentration.

6
 - Contrôle de température est très important .

 Un détecteur à ionisation de flamme (FID) : Un FID utilise une flamme

hydrogène / air dans laquelle l'échantillon est passé pour oxyder les molécules
organiques et produire des ions. Les ions sont collectés et produisent un signal
électrique qui est ensuite mesuré. C`est le plus utilisé.

Caractéristiques: - Universels
- Non sélectif
- Destructif
- Linéaire (réponce)
7
  Détection par spectromètrie de masse: La chromatographie en phase gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse (en anglais Gas chromatography-mass

spectrometry ou GC-MS) est une technique d'analyse qui combine les performances

de la chromatographie en phase gazeuse, pour la séparation des composés d'un

échantillon, et de la spectrométrie de masse, pour la détection et l’identification des

composés en fonction de leur rapport masse sur charge.

Autres détecteurs:
 Le détecteur azote-phosphore connu aussi sous le nom de détecteur thermoïonique
spécifique ou DTS, permet d'analyser les composés organiques contenant de l'azote ou du
phosphore. Il est couramment utilisé dans les secteurs de la pharmacie, de l'agroalimentaire
et de l'environnement.

 Le détecteur d'émission atomique est utilisée dans l'analyse de l'essence, du diesel, du

pétrole, des polluants de l'environnement dans le sol, l'eau et les effluents et les composés
organiques volatils dans l'eau.

 Le détecteur à capture d'électrons est une technique utilisée pour analyser les composés
halogénés ; elle est utilisée principalement dans les marchés de l'environnement, de
l'investigation medico-légale et de la pharmacie.

 Le détecteur à photométrie de flamme est une technique utilisée pour analyser les composés
contenant du soufre ou du phosphore et les métaux .

 Le détecteur à photo-ionisation est une technique utilisée pour analyser de nombreux

hydrocarbures aromatiques et autres composés organiques.

3. Analyse des composants

Le contenu de chaque composant est analysé en utilisant trois techniques: analyse qualitative
(évaluation numérique des espèces connues), temps de rétention (comparaison des espèces
inconnues) et indice de rétention de Kovats (échelle logarithmique sur lequel ajusté temps de
rétention sont comparés avec les alcanes linéaires).
Pour Calculer l'indice de Kovats, Compte tenu de la complexité de cette procédure, il est
préférable d'utiliser le système logiciel existant conçu pour calculer les indices
8
 automatiquement. Dionex, Chrom Parfait et Agilent Technologies offrent des logiciels qui
prennent en charge la chromatographie en phase gazeuse et fournit les indices appropriés pour
l'analyse.
Les résultats sont exprimés en pourcentages et en concentrations.

4. En pratique

Mode opératoire pour réaliser une analyse CPG:

 Vérifier qu’une colonne (ou plusieurs) est/sont déjà en place dans le chromatographe.

 Programmer le four

o Une méthode de type gradient est souvent suffisante. Balayer une grande plage de
température, par exemple de 50 à 250 °C sur 10 min.

o Si une méthode isotherme est désirée, commencer par le même gradient, puis resserrer
les valeurs extrémales par itération pour obtenir le pic correspondant à l’analyte
d’intérêt au temps de rétention jugé adéquat.

 Préparer une solution d’échantillon à une concentration environ égale à 1 mg.mL –1, dans un
solvant volatil .

 Choisir la colonne. Par défaut, une colonne apolaire est suffisante. On réserve généralement
l’utilisation de colonnes polaires aux cas où les volatilités des analytes à séparer sont très
proches.

 Injecter environ 1 µL dans l’injecteur. Par défaut, on peut choisir comme température de
l’injecteur la plus haute température atteinte dans le four pendant l’analyse.

 Afin de nettoyer la colonne, on peut la laisser quelques minutes à la température maximale

d’utilisation. Ceci permet de débarrasser la colonne des analytes les moins volatiles qui ne
sont pas sortis de la colonne à la fin de l’analyse, et risquent de sortir lors d’une injection
ultérieure.

9
Université Ferhat Abbas Sétif -1 Année Universitaire : 2019-2020
Faculté des sciences de la nature et de la vie Module : Analyse instrumentale

Département de Biologie et Ecologie végétales Biotechnologie végétale et Amélioration (L3)

Chromatographie liquide à haute performance CLHP

(HPLC en anglais)
1. Introduction

La chromatographie liquide haute performance est une technique instrumentale qui permet de

séparer les composants d’un mélange non volatile, de polarité élevée afin de les identifier et les

quantifier. Elle met en œuvre, selon la nature de la phase stationnaire, des phénomènes de partage,

d’adsorption, d’échange d’ions ou d’exclusion.

2. Appareillage

Un appareil CLHP (Fig.1 ) comporte différents modules: un réservoir contenant la phase mobile, un

système de pompage, un injecteur, une colonne, un détecteur à travers lesquels un liquide entraîne

les substances d’un mélange à séparer .

Fig.1 Les composants d’un chromatographe liquide à haute performance

1
 a. Réservoir de solvants

Pour l’éluant on emploi un vase clos pour éviter l’évaporation. Le solvant utilisé doit né-
cessairement :
• Maintenir la stabilité de la colonne

• Etre compatible avec le détecteur

• Solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.

Il est recommandé de toujours employer des solvants traités spécifiquement pour CLHP. Ils
doivent être dégazé et filtré avant usage.

b. Dispositif de dégazage

Tout solvant en contact avec l’atmosphère va dissoudre des gaz (dont l’oxygène) jusqu’à atteindre

le point d’équilibre entre les deux phases. Les gaz, ainsi dissous, sont susceptibles de perturber le

mélange de deux solvants en générant, à haute pression, des microbulles qui peuvent perturber

l’analyse (rétention et/ou détection). En outre, la présence d’oxygène peut entrainer une oxydation

des capillaires métalliques et de la phase stationnaire de la colonne.

Il est donc important en chromatographie de s’assurer que les solvants ne contiennent plus (ou peu)

de gaz dissous au moment de leur mélange pour éviter l’apparition de microbulles. Pour cela deux

solutions :

• l’appareil est équipé d’un dégazeur en ligne sous vide. Le dégazeur est

généralement placé entre les bouteilles de solvants et les pompes.

• Par barbotage ou bain à ultrasons. Le barbotage sert à remplacer les gaz dissous

par un gaz inerte pour éviter l’oxydation, tandis que le bain à ultrasons permet la

volatilisation des gaz dissous.

c. Pompe

lle est muni d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du

solvant. Elle permet de travailler:

• en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.
2
 • en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du

mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min.

Les pompes les plus utilisées sont les pompes de types piston avec lesquelles les débits sont

constants, la pression peut atteindre environ 500 bars.

d. Injecteur

Le type d’injecteur le plus courant consiste en une Vanne à boucles d'échantillonnage. On introduit

d’abord l’échantillon dans une boucle de volume connu; après rotation de la vanne, la phase mobile

entraîne l’échantillon en tête de la colonne. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un

volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

3
 e. Colonne

Les colonnes CLHP sont généralement courtes et droites en acier inoxydable se caractérise

par leur géométrie (diamètre intérieur de 4 mm et une longueur de 5 à 30 cm) et par la na-

ture des phases qu’elles contiennent (Figure 2). Elles doivent capables de résister aux fortes

pressions. Le débit de la phase mobile ne peut dépasser quelques ml/min. Ces colonnes ont

l’avantage de la rapidité de l’analyse, consomment moins de solvant et conduisent à une

meilleure résolution de l’analyse. Dans la plupart des analyses une pré- colonne ou colonne

de garde qui ne diffère de la colonne analytique que par sa très faible longueur (1 à 2 cm

pour une colonne de 25 cm) permet de protéger la colonne et d’en augmenter la durée de

fonctionnement.

Fig. 2 Colonnes CLHP

f. La phase stationnaire

• La phase normale

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un

éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la

colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.

L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce

qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.

4
 • La phase inverse

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes linéaires de 8 ou

18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire

(ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du

temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante.

g. La phase mobile

L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire normale ou à
polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés. La polarité de la phase
stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :

- si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la chromatographie
est dite en phase normale .

- si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus souvent

des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase

inverse.

h. Détecteurs

Ces systèmes de détection sont des éléments indispensables au système chromatographique CLHP.

Ils permettent de suivre en continu la séparation et de mesurer la concentration instantanée des

différents solutés d’un mélange à analyser.

Il est impératif de connaître exactement le type d’analyses à effectuer pour choisir le détecteur

adapté.

Cependant, depuis quelques années, de nouveaux modes de détection sont apparus. Le plus

couramment utilisé est le couplage de la CLHP avec un spectromètre de masse constituant alors un

détecteur universel et un puissant moyen d’identification.

Les principaux détecteurs utilisés en HPLC sont :

5
• Photomètre UV-Visible : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la

colonne.

• Réfractomètre différentiel : il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la

sortie de la colonne.

• Détecteur fluorimétrique: Il mesure l’énergie de fluorescence d’un soluté excité par une

radiation ultraviolette. Ce procédé sert pour les composés fluorescents ou les dérivés

fluorescents de certains composés.

• Détecteur électrochimique: Cette méthode de détection ne s’adresse qu’à la détection de

molécule douée de propriétés oxydoréduction.

• Détecteur par spectroscopie de masse: La chromatographie liquide couplée à la

spectroscopie de masse (LC-MS) est une technique d’analyse qui permet d’identifier

clairement un composé grâce à son rapport masse molaire/charge (m/z).

i. L’enregistreur

Il s’agit en fait d’un petit ordinateur qui récupère toutes les données issues des

détecteurs, trace les chromatogrammes et intègre la surface des pics. Il imprime un

rapport d’analyse donnant les temps de rétentions et les surfaces de chaque pic.

6
 3. Le chromatogramme : Le chromatogramme est une courbe qui traduit la

variation au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration instantanée du

soluté en sortie de colonne.

 Le temps (ou le volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de détection

en ordonnée.

 La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué.

 La séparation est complète quand le chromatogramme présente autant de pics chromatogra-

phiques revenant à la ligne de base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser.

 Notion de temps

a. Temps mort tm (t0) Temps mis par un composé non retenu par la phase

stationnaire de la colonne, pour parcourir le trajet entre l'entrée et la sortie de

la colonne  temps passé dans la phase mobile.

7
 b. Temps de rétention tr Temps mis par les molécules d'un composé à analy-

ser (soluté) pour parcourir le trajet entre l'entrée et la sortie de la colonne 

C'est le temps total passé dans la colonne.

 Le temps de rétention, est caractéristique du constituant, pour des conditions d'analyse don-

nées.

 La surface d'un pic est fonction de la quantité de constituant dont il est la trace.

 Aucun soluté ne peut sortir avant le temps t 0, temps qui correspond au transport dans la

phase mobile.

c. Temps de rétention réduit t'r

La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par le temps de rétention

réduit  représente le temps passé dans la phase stationnaire  t’r = tr - t0.