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Chromatographie et lctrophorse
Notions fondamentales
I.1
Paramtres fondamentaux
I.2
I.3
Analyse quantitative
chapitre II
CPG
II.1
Cintique de sparation
II.2
Appareillage
II.2.1
II.2.2
II.2.3
II.3
Dtecteurs
II.3.1
II.3.2
II.3.3
II.3.4
II.3.5
II.3.6
II.3.7
II.3.8
II.4
II.4.1
II.4.2
II.5
Optimisation de sparation
chapitre III
III.1
III.2
Loi de Darcy
III.3
III.3.1
III.3.2
III.3.3
III.4
III.4.1
III.4.2
III.4.3
III.4.4
III.4.5
III.5
III.5.1
III.5.2
III.5.3
Appareillage
Dispersion hors colonne
Rservoirs de solvants
Dispositif de pompage
Dispositif dinjection
Colonnes
Dtecteurs
Photomtre UV-visible
Rfractomtre
Dtecteur fluorimtrique
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Chromatographie et lctrophorse
III.5.4
III.5.5
III.5.6
Dtecteur lectrochimique
Conductimtre
Diffusion de lumire
chapitre IV
Chromatographie de partage
IV.1
Introduction
IV.2
Phases normales
IV.3
Phases inverses
chapitre V
Chromatographie dadsorption
V.1
Phase stationnaire
V.2
Phase mobile
V.3
Mcanisme de rtention
V.3.1
V.3.2
En CCM
Thorie de Snyder
chapitre VI
Chromatographie ionique
VI.1
Introduction
VI.2
VI.3
Appariement dions
VI.3.1
chapitre VII
Electrophorse capillaire
VII.1
Introduction
VII.2
Dfinitions
VII.2.1
VII.2.2
VII.2.3
VII.2.4
VII.3
VII.3.1
VII.3.2
Analyse quantitative
Injection
Dtection
I - Notions fondamentales
I.1
Paramtres fondamentaux :
- Coefficient de distribution KA :
Temps de rtention tR, volume de rtention VR
Temps de rtention tR, volume de rtention rduit VR
tR=tR+t0
t0 : temps mis par la phase mobile pour aller de linjecteur au dtecteur.
- Facteur de capacit k :
Rqe : k ne dpend que de la nature des phases.
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Chromatographie et lctrophorse
- Slectivit :
Les pics sont spars si >1,1.
Rqe : ne dpend que de la nature des phases stationnaire et mobile.
- Rsolution Rs :
Les pics sont rsolus si Rs>1,5.
Rqe : Rs dpend des conditions opratoires.
Si 1 = 2 ,
I.2
, or
ainsi
soit
- Nombre de plateaux N :
H : hauteur quivalente un plateau thorique, 100<N<500000.
Rq : Si on augmente la longueur de la colonne, k nest pas modifie ; le nombre de plateaux ne dpend pas de la
nature des phases.
- Nombre de plateaux thoriques :
N traduit la finesse des pics, il a un effet sur Rs mais pas sur .
- Dispersion :
Elle est due :
la diffusion turbulente (anisotropie dcoulement), mouvement du solut entrane par la phase mobile
sans interaction avec la phase stationnaire. A
la diffusion longitudinale assimile au mouvement brownien, mouvement du solut avec la phase mobile
immobile sans interaction avec la phase stationnaire. B/u (dpend de la vitesse de la phase mobile)
la rsistance au transfert de masse. C.u
Thorie de Van Deemter :
H=A+B/u+C.u, approximation car A et C ne sont pas compltement indpendants.
Thorie de Knox :
H=A.u1/3+B/u+C.u
I.3
Analyse quantitative
- Etalonnage externe :
Prparation de solutions de titres connus. Trac de Signal=f(C)
- Etalonnage interne :
1. Prparation de solutions talons A1 de titre x1, A2 de titre x2, A3 de titre x3. 2. Prparation dune solution
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dtalonnage interne (EI). 3. Mlange dun volume constant de A et dun volume constant dEI.
V1=VA1+VEI
V2=VA2+VEI
V3=VA3+VEI
Trac de AA/AEI=f(CA)
Choix de ltalon interne :
Inerte chimiquement vis--vis du solut
tre spar des autres analytes
Comportement physico-chimique proche du solut
Concentration de ltalon interne du mme ordre de grandeur que lanalyte
- Mthode des ajouts doss :
On saffranchit du volume inject et de lajout dun compos non prsent.
On introduit lchantillon contenant A et B, et on ajoute des quantits connues mA de A dans lchantillon.
V1=VAB+VA
V2=VAB+2*VA
V3=VAB+3*VA
Trac de AA/AB=f(mA)
II - CPG
I.4
Cintique de sparation
Interactions :
Solut Phase Stationnaire
Gaz vecteur : H2, He, N2, Ar, CO2 ; le choix du gaz est conditionn par le dtecteur.
I.5
Appareillage
- Linjecteur amne en tte de colonne lchantillon sous forme gazeuse avec une dispersion faible, on peut
injecter des liquides, des gaz et dans certains cas des solides.
- Mode dinjection :
Par vaporisation directe
Split/Splitless : en mode split, permet de limiter les quantits dchantillon inject dans la colonne pour les
colonnes capillaires. On dfinit un rapport de Split comme la fraction dchantillon inject.
On-column froid : lchantillon est dpos faible temprature et entran aprs vaporisation rapide en
tte de colonne.
Autre type : vaporisation programm, vanne dinjection, headspace.
I.5.1
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Chromatographie et lctrophorse
Si la phase stationnaire est un liquide immobilis sur un solide, elle met en jeu une constante de partage
gaz/phase liquide.
Si la phase stationnaire est une espce organique lie chimiquement une surface solide, elle met en jeu une
constante de partage gaz/phase greffe.
Exemples de phases stationnaires : hydrocarbures ramifis (squalane), polydialkylsiloxanes (silicones SE30,
OV17, CPSIL5) greffs ou non, polythers (Carbowax) et polyesters (DEGS).
Les colonnes sont constitues dun tube de silice fondue de diamtre externe 0,25 2 mm lintrieur duquel est
dpose une phase stationnaire de diamtre interne 0,05 0,35 mm.
WCOT (wall coated open tubular) porosit = 1
PLOT (porous layer open tubular) porosit 1
Le volume inject dans PLOT est plus lev.
Matriau : silice fondue.
Diamtre interne : 0,05 0.35 mm.
Longueur : 10 100 m.
Support : greffage sur la silice fondue.
Phase stationnaire immobilise par rticulation, polymrisation ou greffage chimique.
Dbit : 0,1 5 mL.min-1.
I.5.3
I.6
I.6.1
Dtecteurs
Caractristiques dun dtecteur
Bonne sensibilit.
Bonne stabilit et reproductibilit.
Rponse linaire sur plusieurs dcades de concentrations.
Domaine de temprature de fonctionnement compris entre la temprature ambiante et au moins 400C.
Temps de rponse rapide et indpendant de la vitesse dcoulement.
Grande fiabilit et facilit dutilisation.
Rponse uniforme ou slective pour diffrents soluts.
Conservation de lintgrit de lchantillon.
I.6.2
Dfinition
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Chromatographie et lctrophorse
Limite de dtection (LD) : cest la quantit de solut requise pour avoir un rapport signal bruit au moins
gal 3.
Limite de quantification (LQ) : cest la quantit de solut requise pour avoir un rapport signal bruit au
moins gal 10.
Domaine de linarit (LL) : domaine dans lequel la rponse du dtecteur est directement proportionnelle
la concentration.
Slectivit : proprit du dtecteur ne pas
rpondre de la mme manire toutes les
espces x, capacit analyser des molcules
spcifiques.
Catharomtre
Dtecteur conductibilit thermique quasi universel comprenant un montage diffrentiel (pont de Wheastone) dont
les rsistances compensent le dsquilibre de conductivit par une perte de chaleur.
Le gaz vecteur doit avoir une bonne conductibilit thermique tel que H2 ou He et possder une conductivit
diffrente de celle des soluts.
Caractristiques :
LD : 10-9 g.mL-1
Linarit faible : 3 4 dcades (10 10000).
Volume de 20 L 140 L.
Rpond en concentration
Contrle de temprature est trs important.
I.6.4
Dtecteur le plus utilis et spcifique aux composs carbons sauf HCHO et HCOOH.
Principe :
Les composs sont brls dans une flamme air-H2.
On forme des radicaux CH, CH2, CH3.
Ionisation CHCHO+ +e- en prsence dO2.
Amplification du signal lectrique.
Caractristiques :
LD : 2.10-12 nC.g-1.
Linarit : 7 dcades.
Rpond en masse.
Bonne sensibilit.
Ncessite 2 bouteilles pour la flamme.
Le courant produit est quasi proportionnel au nombre datomes de carbone.
I.6.5
Dtecteur spcifique aux drivs halogns. Llectron est form partir dun gaz par des particules - provenant
du 63Ni ou du tritium. N2N2+ +eMcanisme :
M+e-M- //
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M-+N2+ M+N2
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Chromatographie et lctrophorse
On mesure la variation de courant lectrique entre I (en labsence de molcules) et I (courant rsiduel en
prsence de solut). I=Ie-kC , dtecteur non linaire.
Caractristiques :
Trs spcifique des composs halogns.
LD : 5.10-4 g.s-1 de Lindone.
Linarit : 104.
Rpond en masse.
I.6.6
Dtecteur spcifique du phosphore et du soufre qui met respectivement 526 nm et 394 nm.
On utilise une flamme qui brle les molcules et excite les atomes mettant un rayonnement.
Caractristiques :
Llment analys dpend du choix du filtre.
LD : 2.10-11 g.s-1 pour S.
3.10-13 g.s-1 pour P.
Linarit : 5 dcades pour P
La racine carr de la rponse est proportionnelle la quantit injecte.
Rpond en masse.
I.6.7
Dtecteur photoionisation
Les composs analyser sont ioniss par un faisceau UV intense au Xe ou Ar dnergie respective 8,3 eV et 11,7
eV ; des lectrodes collectent les ions forms.
Applications :
Les drivs aromatiques et les composs insaturs.
Lindustrie ptrolire.
I.7
I.7.1
Lobjectif est de caractriser la rtention de diffrents soluts sur une phase stationnaire.
Pour un alcane linaire : I = 100n, avec n : le nombre datomes de carbones.
La droite de Kovats est tablie sur une srie dhomologues et dans des conditions opratoires fixes en rgime
isotherme et isobare. Log tR = an+b
Pour un compos X : IX = 100, avec le nombre fictif datomes de carbones de lalcane linaire quivalent o
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I.7.2
Chromatographie et lctrophorse
I.8
Optimisation de sparation
Paramtres :
Temprature de linjecteur est dtermine partir de la temprature des soluts.
La temprature de la colonne suit la loi de Vant Hoff :
et par suite
On peut aussi appliquer un gradient de temprature la colonne.
Dbit du gaz vecteur.
Choix du dtecteur : TCD, FID, ECD, FPD, NPD, photoionisation.
Nature du gaz vecteur impos par le dtecteur, fonction de lefficacit souhaite, cot/scurit.
Le dbit moyen de gaz est donn par : Dm=0,47 u d
Avec u, vitesse linaire moyenne du gaz vecteur en cm.s-1 et d : le diamtre interne de la colonne.
Relation entre Dm et Rs :
Injecteur : choisi par ltat physique du solut, de la quantit introduite, de la concentration en solut.
Phase stationnaire (nature et gomtrie) en utilisant les constantes de Mac Reynolds.
Interactions :
Solut Phase Stationnaire
Solut Phase Mobile
Avantage CL/CG
Temprature peu importante.
Dbit constant de phase mobile dans la colonne.
Grand choix de phases mobile et stationnaire.
Inconvnient CL/CG
Coefficient de diffusion dans la phase mobile important.
La vitesse dchange entre le solut et la phase mobile liquide est plus lente quentre le solut et la phase
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Chromatographie et lctrophorse
avec
P : perte de charge dans la colonne
: facteur de remplissage de la colonne
: viscosit dynamique (Pa.s ou Cp)
(eau) = 0,89 Cp, (MeOH) = 0,54 Cp, (ACN) = 0,34 Cp
u : vitesse linaire moyenne de la phase mobile
dp : diamtre des particules de la phase stationnaire
En HPLC la pression normale est 200 bars ; on peut jouer sur la vitesse u et la viscosit du fluide afin de ne pas
dgrader la colonne avec des pressions trop leves.
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Chromatographie et lctrophorse
Polaire/non polaire
+
-
Polaire/polaire
+
+
+
+
I.12 Appareillage
avec :
Dm : diffusivit du solut (cm2.g-1)
D : dbit dluant (mL.s-1)
d : diamtre du tube (cm)
N : nombre de plateaux thoriques
Vr : volume de rtention (mL)
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Chromatographie et lctrophorse
Estimation de la dispersion hors colonne : on enlve la colonne et on injecte les soluts, on obtient ainsi (hors
colonne) = 4(hors colonne)
tot2 = colonne2+ hors colonne2
I.12.2 Rservoirs de solvants
Flacons en verre, on utilise une crpine pour liminer les poussires et les bulles.
1. filtration des solvants
2. dgazages aux ultrasons
I.12.3 Dispositif de pompage
Dbits utiliss : 0,1-2 mL.min-1
Utilisation de pompes alternative : faible volume interne et utilisable avec des gradients dlution
I.12.4 Dispositif dinjection
On dpose lchantillon en tte de colonne.
P en HPLC est de lordre de qqs dizaines 100-250 bars.
Vanne dinjection :
6 voies pour les solvants
2 positions load et inject
Remplissage de la boucle dinjection avec V fix (5-500 L). Prsence dun circuit avec la phase mobile et
dun circuit avec lchantillon.
Envoi de lchantillon sur la colonne avec le circuit (pompe, boucle, colonne). Le volume inject est
constant, cela permet donc de travailler en talonnage externe pour une analyse quantitative.
I.12.5 Colonnes
Tubes en inox de longueur L = 10 25 cm
dtube = 4,6 mm le plus courant
dp = 3 10 m
N = 40000 60000 plateaux/m
On utilise aussi des micros colonnes
Avec L = 3 7,5 cm
Dp = 3 5 m
On limite ainsi la consommation de solvants.
On place souvent des pr-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp suprieur et protgent la colonne des
impurets.
I.13 Dtecteurs
I.13.1 Photomtre UV-visible
Il mesure l'absorption de la lumire par le produit la sortie de la colonne. E opre longueur d'onde
constante, celle-ci ayant t fixe par l'oprateur. La lampe Deuterium est utilis pour des longueurs d'ondes
variant de 190-350 nm et la lampe vapeur de mercure est utilis la longueur d'onde non variable de 254 nm.
Pour que ce type de dtecteur soit utilisable, il faut que :
le produit dtecter absorbe la lumire une longueur d'onde accessible l'appareil, et que son
coefficient d'absorption e soit suffisamment grand
la phase mobile n'absorbe pas la lumire la longueur d'onde choisie par l'oprateur.
Les transitions possibles sont :
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Chromatographie et lctrophorse
* : systmes conjugus
* : non visible en UV
n* : carbonyles
n* : alcools
Choix de la longueur donde de mesure en fonction du solut et de la phase mobile qui doit peu absorber cette
longueur donde.
Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de concentration C et de trajet
optique gal l. Si I0 est l'intensit du rayon lumineux l'entre de la solution et I son intensit la sortie, alors :
A = D.O = log (I0 / I) = e l C
o A est l'absorbance, D.O la densit optique, Io l'intensit lumineuse incidente, I l'intensit lumineuse
transmise, e le coefficient d'extinction molaire caractristique de la substance tudie une longueur d'onde
donne en L mol-1 cm-1, l l'paisseur traverse en cm et C la concentration en mol.L-1.
Plusieurs types de dtecteurs :
Dtecteur fixe : vapeur de Hg (254 nm)
Dtecteur variable
Dtecteur barrettes de diodes (1,2 nm/photodiode), gamme de 190 800 nm
Sur le spectre de solut :
On choisit un max pour chaque solut
On mesure labsorbance avec 2 pour 1 solut, alors
Il permet de vrifier la spcificit
I.13.2 Rfractomtre
Il mesure la variation de l'indice de rfraction du liquide la sortie de la colonne. Cette mesure,
extrmement prcise, dpend nanmoins de la temprature du liquide. On compare cet indice avec celui de la
phase mobile pure : il y a donc une rfrence d'o le terme de variation de l'indice. Ce dtecteur exclut les
variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec
ce dtecteur.
Contrle de la temprature indispensable 0,1 C
Non utilisable en gradient dlution
I.13.3 Dtecteur fluorimtrique
Aprs excitation de lchantillon dans la gamme UV, on mesure la fluorescence restitue.
Mthode trs sensible, qui permet de dtecter 1 seule molcule.
I.13.4 Dtecteur lectrochimique
Ractions doxydorductions qui produisent un courant proportionnel la concentration du solut. Applications :
drogues, polluants, produits naturels.
I.13.5 Conductimtre
I.13.6 Diffusion de lumire
Aprs nbulisation, vaporation, on envoie un faisceau de lumire - Dtecteur universel Il faut des diffrences de diffusivit entre le solut et la phase mobile.
IV - Chromatographie de partage
I.14 Introduction
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Chromatographie et lctrophorse
Interactions :
Solut Phase Stationnaire
&
Solut Phase Mobile
La phase stationnaire est soit un liquide immobilis sur un support par adsorption, soit greffe par liaisons
chimiques qui augmente la dure de vie.
Chromatographie de partage polarit de phases normales : Phase stationnaire polaire, Phase mobile peu
polaire.
Chromatographie de partage polarit de phases inverses : Phase stationnaire apolaire, Phase mobile polaire.
Avec, fi les cstes de Rekker, Log k = a log Poe + b, k facteur de capacit et a et b cste dpendant de la phase
mobile.
Phases isoluantes : phases qui conduisent des k voisins mais les
interactions mises en jeu peuvent tre diffrentes.
2 phases isoluantes pour un couple de soluts ne le seront pas pour un autre
couple.
loi gnrale : log k = A12+B 2+C
avec 1 composition du solvant 1 dans la phase mobile
Pour un mlange binaire : log k = log k0 mc
k0 : facteur de capacit avec pour ph. mobile (eau)
m : force de solvant
c : % de solvant
Pour un mlange ternaire (eau, solv1, solv2) :
A1 12+A2 2+B1 A12+B1 1+B2 2+C+D12
V - Chromatographie dadsorption
I.17 Phase stationnaire
Silice : adsorbant trs polaire
La capacit dadsorption et la polarit varient en fonction du taux dhydratation.
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Chromatographie et lctrophorse
et celle du solut
Do
Sur la colonne
et
do
Loi de rtention :
Loi de Snyder :
* tant le taux dactivit de la silice : si = 1 silice dshydrate, si = 0 silice dsactive.
Le domaine dapplication se situe dans la sparation disomres.
VI - Chromatographie ionique
I.20 Introduction
Elle spare les soluts ioniques (sels) ou ionisables (molcules organiques) et tend tre remplace par
llectrophorse capillaire.
3 types :
change dions
Appariement dions
Exclusions dions
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Chromatographie et lctrophorse
I.24 Dfinitions
I.24.1 Proprits des lectrolytes
Ions, molcules ou particules charges soumises un champ lectrique subissent une force :
Force de friction :
Do la vitesse de la particule
I.24.2 Mobilit lectrophoretique ep
Mobilit de lespce charge dans un lectrolyte suppos immobile :
Si lespce est positive ep>0
Si lespce est ngative ep<0
Et
I.24.3 Mobilit lectroosmotique eo
Mobilit de llectrolyte
Une espce neutre se dplace la vitesse
I.24.4 Mobilit apparente
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Chromatographie et lctrophorse
Alors
, avec Ai la
S : section du capillaire
v : vitesse du produit dans le capillaire
V : volume de produit de concentration C
K : cte
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