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12/11/2014

Chromatographie et lctrophorse

Cours de chromatographie de www.chimie-sup.fr


chapitre I

Notions fondamentales

I.1

Paramtres fondamentaux

I.2

Efficacit des colonnes

I.3

Analyse quantitative

chapitre II

CPG

II.1

Cintique de sparation

II.2

Appareillage

II.2.1
II.2.2
II.2.3

II.3

Les colonnes remplies


Les colonnes capillaires
Les colonnes semi-capillaires

Dtecteurs

II.3.1
II.3.2
II.3.3
II.3.4
II.3.5
II.3.6
II.3.7
II.3.8

II.4

Caractristiques dun dtecteur


Dfinition
Catharomtre
Dtecteur ionisation de flamme (FID)
Dtecteur capture dlectrons
Dtecteur photomtrie de flamme (FPD)
Dtecteur thermoionique (NPD)
Dtecteur photoionisation

Classification des phases stationnaire

II.4.1
II.4.2

II.5

Indice de Kovats et droite de Kovats


Constantes de phases stationnaires

Optimisation de sparation

chapitre III

Chromatographie en phase liquide

III.1

Comparaison chromatographie phase liquide et phase gaz

III.2

Loi de Darcy

III.3

Solvants utiliss en HPLC

III.3.1
III.3.2
III.3.3

III.4
III.4.1
III.4.2
III.4.3
III.4.4
III.4.5

III.5
III.5.1
III.5.2
III.5.3

Interactions molculaires entre phase mobile et soluts


Force luante et polarit
Polarit selon Snyder

Appareillage
Dispersion hors colonne
Rservoirs de solvants
Dispositif de pompage
Dispositif dinjection
Colonnes

Dtecteurs
Photomtre UV-visible
Rfractomtre
Dtecteur fluorimtrique

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Chromatographie et lctrophorse

III.5.4
III.5.5
III.5.6

Dtecteur lectrochimique
Conductimtre
Diffusion de lumire

chapitre IV

Chromatographie de partage

IV.1

Introduction

IV.2

Phases normales

IV.3

Phases inverses

chapitre V

Chromatographie dadsorption

V.1

Phase stationnaire

V.2

Phase mobile

V.3

Mcanisme de rtention

V.3.1
V.3.2

En CCM
Thorie de Snyder

chapitre VI

Chromatographie ionique

VI.1

Introduction

VI.2

Chromatographie dchange dions

VI.3

Appariement dions

VI.3.1

chapitre VII

Influence de divers paramtres

Electrophorse capillaire

VII.1

Introduction

VII.2

Dfinitions

VII.2.1
VII.2.2
VII.2.3
VII.2.4

VII.3
VII.3.1
VII.3.2

Proprits des lectrolytes


Mobilit lectrophoretique ep
Mobilit lectroosmotique eo
Mobilit apparente

Analyse quantitative
Injection
Dtection

I - Notions fondamentales
I.1

Paramtres fondamentaux :

- Coefficient de distribution KA :
Temps de rtention tR, volume de rtention VR
Temps de rtention tR, volume de rtention rduit VR
tR=tR+t0
t0 : temps mis par la phase mobile pour aller de linjecteur au dtecteur.

- Facteur de capacit k :
Rqe : k ne dpend que de la nature des phases.

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Chromatographie et lctrophorse

- Slectivit :
Les pics sont spars si >1,1.
Rqe : ne dpend que de la nature des phases stationnaire et mobile.
- Rsolution Rs :
Les pics sont rsolus si Rs>1,5.
Rqe : Rs dpend des conditions opratoires.

Si 1 = 2 ,

; En effet si 1 = 2 alors 1+2 = 22 do

or tR1 = t0(k1+1) et tR2 = t0(k2+1) do


de plus

I.2

, or

ainsi

soit

Efficacit des colonnes :

- Nombre de plateaux N :
H : hauteur quivalente un plateau thorique, 100<N<500000.
Rq : Si on augmente la longueur de la colonne, k nest pas modifie ; le nombre de plateaux ne dpend pas de la
nature des phases.
- Nombre de plateaux thoriques :
N traduit la finesse des pics, il a un effet sur Rs mais pas sur .
- Dispersion :
Elle est due :
la diffusion turbulente (anisotropie dcoulement), mouvement du solut entrane par la phase mobile
sans interaction avec la phase stationnaire. A
la diffusion longitudinale assimile au mouvement brownien, mouvement du solut avec la phase mobile
immobile sans interaction avec la phase stationnaire. B/u (dpend de la vitesse de la phase mobile)
la rsistance au transfert de masse. C.u
Thorie de Van Deemter :
H=A+B/u+C.u, approximation car A et C ne sont pas compltement indpendants.
Thorie de Knox :
H=A.u1/3+B/u+C.u

I.3

Analyse quantitative

- Etalonnage externe :
Prparation de solutions de titres connus. Trac de Signal=f(C)
- Etalonnage interne :
1. Prparation de solutions talons A1 de titre x1, A2 de titre x2, A3 de titre x3. 2. Prparation dune solution
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dtalonnage interne (EI). 3. Mlange dun volume constant de A et dun volume constant dEI.
V1=VA1+VEI
V2=VA2+VEI
V3=VA3+VEI
Trac de AA/AEI=f(CA)
Choix de ltalon interne :
Inerte chimiquement vis--vis du solut
tre spar des autres analytes
Comportement physico-chimique proche du solut
Concentration de ltalon interne du mme ordre de grandeur que lanalyte
- Mthode des ajouts doss :
On saffranchit du volume inject et de lajout dun compos non prsent.
On introduit lchantillon contenant A et B, et on ajoute des quantits connues mA de A dans lchantillon.
V1=VAB+VA
V2=VAB+2*VA
V3=VAB+3*VA
Trac de AA/AB=f(mA)

II - CPG
I.4

Cintique de sparation

Interactions :
Solut Phase Stationnaire
Gaz vecteur : H2, He, N2, Ar, CO2 ; le choix du gaz est conditionn par le dtecteur.

I.5

Appareillage

- Linjecteur amne en tte de colonne lchantillon sous forme gazeuse avec une dispersion faible, on peut
injecter des liquides, des gaz et dans certains cas des solides.
- Mode dinjection :
Par vaporisation directe
Split/Splitless : en mode split, permet de limiter les quantits dchantillon inject dans la colonne pour les
colonnes capillaires. On dfinit un rapport de Split comme la fraction dchantillon inject.
On-column froid : lchantillon est dpos faible temprature et entran aprs vaporisation rapide en
tte de colonne.
Autre type : vaporisation programm, vanne dinjection, headspace.
I.5.1

Les colonnes remplies

La phase stationnaire est un solide et met en jeu un quilibre dadsorption.


Matriau : acier, tflon, verre.
Diamtre interne du tube 1/16 .
Longueur : 2 3 mtres.
Le tube est rempli dun support :
o Noir de carbone, graphite (carbopack B) spare les composs en fonction de la taille.
o Tamis molculaire au carbone (carbox en 1000) analyse les gaz et les hydrocarbures lgers (surface
spcifique>1200 m2.g-1).
o Polymres.
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o Terre de diatomes (Chromsorb P).


o Silice-Alumine-Zolithes.
Dbit : 10 40 mL.min-1.
Diamtre des particules : 3 5 mm.
Porosit : fraction de vide dans la colonne
V0 : volume de vide, D : diamtre du tube, L : longueur du tube.
La porosit totale est gale la somme de la porosit intergranulaire (entre les grains) et intragranulaire (dans les
grains).
I.5.2

Les colonnes capillaires

Si la phase stationnaire est un liquide immobilis sur un solide, elle met en jeu une constante de partage
gaz/phase liquide.
Si la phase stationnaire est une espce organique lie chimiquement une surface solide, elle met en jeu une
constante de partage gaz/phase greffe.
Exemples de phases stationnaires : hydrocarbures ramifis (squalane), polydialkylsiloxanes (silicones SE30,
OV17, CPSIL5) greffs ou non, polythers (Carbowax) et polyesters (DEGS).
Les colonnes sont constitues dun tube de silice fondue de diamtre externe 0,25 2 mm lintrieur duquel est
dpose une phase stationnaire de diamtre interne 0,05 0,35 mm.
WCOT (wall coated open tubular) porosit = 1
PLOT (porous layer open tubular) porosit 1
Le volume inject dans PLOT est plus lev.
Matriau : silice fondue.
Diamtre interne : 0,05 0.35 mm.
Longueur : 10 100 m.
Support : greffage sur la silice fondue.
Phase stationnaire immobilise par rticulation, polymrisation ou greffage chimique.
Dbit : 0,1 5 mL.min-1.
I.5.3

Les colonnes semi-capillaires


Matriau : silice fondue.
Diamtre interne : 0.53 mm.
Longueur : 5 50 m.
Support : greffage sur la silice fondue.
Phase stationnaire immobilise par rticulation, polymrisation ou greffage chimique.
Dbit : 1 15 mL.min-1.

I.6
I.6.1

Dtecteurs
Caractristiques dun dtecteur
Bonne sensibilit.
Bonne stabilit et reproductibilit.
Rponse linaire sur plusieurs dcades de concentrations.
Domaine de temprature de fonctionnement compris entre la temprature ambiante et au moins 400C.
Temps de rponse rapide et indpendant de la vitesse dcoulement.
Grande fiabilit et facilit dutilisation.
Rponse uniforme ou slective pour diffrents soluts.
Conservation de lintgrit de lchantillon.

I.6.2

Dfinition

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Limite de dtection (LD) : cest la quantit de solut requise pour avoir un rapport signal bruit au moins
gal 3.
Limite de quantification (LQ) : cest la quantit de solut requise pour avoir un rapport signal bruit au
moins gal 10.
Domaine de linarit (LL) : domaine dans lequel la rponse du dtecteur est directement proportionnelle
la concentration.
Slectivit : proprit du dtecteur ne pas
rpondre de la mme manire toutes les
espces x, capacit analyser des molcules
spcifiques.

Sensibilit : capacit dun dtecteur rpondre de faibles variations de C ou de m.


I.6.3

Catharomtre

Dtecteur conductibilit thermique quasi universel comprenant un montage diffrentiel (pont de Wheastone) dont
les rsistances compensent le dsquilibre de conductivit par une perte de chaleur.
Le gaz vecteur doit avoir une bonne conductibilit thermique tel que H2 ou He et possder une conductivit
diffrente de celle des soluts.
Caractristiques :
LD : 10-9 g.mL-1
Linarit faible : 3 4 dcades (10 10000).
Volume de 20 L 140 L.
Rpond en concentration
Contrle de temprature est trs important.
I.6.4

Dtecteur ionisation de flamme (FID)

Dtecteur le plus utilis et spcifique aux composs carbons sauf HCHO et HCOOH.
Principe :
Les composs sont brls dans une flamme air-H2.
On forme des radicaux CH, CH2, CH3.
Ionisation CHCHO+ +e- en prsence dO2.
Amplification du signal lectrique.
Caractristiques :
LD : 2.10-12 nC.g-1.
Linarit : 7 dcades.
Rpond en masse.
Bonne sensibilit.
Ncessite 2 bouteilles pour la flamme.
Le courant produit est quasi proportionnel au nombre datomes de carbone.
I.6.5

Dtecteur capture dlectrons

Dtecteur spcifique aux drivs halogns. Llectron est form partir dun gaz par des particules - provenant
du 63Ni ou du tritium. N2N2+ +eMcanisme :

M+e-M- //

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M-+N2+ M+N2
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Chromatographie et lctrophorse

On mesure la variation de courant lectrique entre I (en labsence de molcules) et I (courant rsiduel en
prsence de solut). I=Ie-kC , dtecteur non linaire.
Caractristiques :
Trs spcifique des composs halogns.
LD : 5.10-4 g.s-1 de Lindone.
Linarit : 104.
Rpond en masse.
I.6.6

Dtecteur photomtrie de flamme (FPD)

Dtecteur spcifique du phosphore et du soufre qui met respectivement 526 nm et 394 nm.
On utilise une flamme qui brle les molcules et excite les atomes mettant un rayonnement.
Caractristiques :
Llment analys dpend du choix du filtre.
LD : 2.10-11 g.s-1 pour S.
3.10-13 g.s-1 pour P.
Linarit : 5 dcades pour P
La racine carr de la rponse est proportionnelle la quantit injecte.
Rpond en masse.
I.6.7

Dtecteur thermoionique (NPD)

Dtecteur spcifique aux molcules azotes et phosphores.


Caractristiques :
LD : 2.10-14 g.s-1.
Spcificit : N/C 106.
N/P >102.
Linarit comparable au FID : 7 dcades.
Gaz vecteurs : Ar, Ne, He.
I.6.8

Dtecteur photoionisation

Les composs analyser sont ioniss par un faisceau UV intense au Xe ou Ar dnergie respective 8,3 eV et 11,7
eV ; des lectrodes collectent les ions forms.
Applications :
Les drivs aromatiques et les composs insaturs.
Lindustrie ptrolire.

I.7
I.7.1

Classification des phases stationnaire


Indice de Kovats et droite de Kovats

Lobjectif est de caractriser la rtention de diffrents soluts sur une phase stationnaire.
Pour un alcane linaire : I = 100n, avec n : le nombre datomes de carbones.
La droite de Kovats est tablie sur une srie dhomologues et dans des conditions opratoires fixes en rgime
isotherme et isobare. Log tR = an+b
Pour un compos X : IX = 100, avec le nombre fictif datomes de carbones de lalcane linaire quivalent o

Il existe des tables de IX afin didentifier un compos inconnu.


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I.7.2

Chromatographie et lctrophorse

Constantes de phases stationnaires


Constante de Rohrchneider (1959). 5 molcules tudies sur une phase stationnaire de rfrence, la
squalane, et une phase stationnaire tudier.

Constante de Mac Reynolds. 10 molcules tmoins. Polarit = cstes de Mac Reynolds.

I.8

Optimisation de sparation

Paramtres :
Temprature de linjecteur est dtermine partir de la temprature des soluts.
La temprature de la colonne suit la loi de Vant Hoff :
et par suite
On peut aussi appliquer un gradient de temprature la colonne.
Dbit du gaz vecteur.
Choix du dtecteur : TCD, FID, ECD, FPD, NPD, photoionisation.
Nature du gaz vecteur impos par le dtecteur, fonction de lefficacit souhaite, cot/scurit.
Le dbit moyen de gaz est donn par : Dm=0,47 u d
Avec u, vitesse linaire moyenne du gaz vecteur en cm.s-1 et d : le diamtre interne de la colonne.
Relation entre Dm et Rs :
Injecteur : choisi par ltat physique du solut, de la quantit introduite, de la concentration en solut.
Phase stationnaire (nature et gomtrie) en utilisant les constantes de Mac Reynolds.

III - Chromatographie en phase liquide


I.9

Comparaison chromatographie phase liquide et phase gaz

Interactions :
Solut Phase Stationnaire
Solut Phase Mobile

Avantage CL/CG
Temprature peu importante.
Dbit constant de phase mobile dans la colonne.
Grand choix de phases mobile et stationnaire.

Inconvnient CL/CG
Coefficient de diffusion dans la phase mobile important.
La vitesse dchange entre le solut et la phase mobile liquide est plus lente quentre le solut et la phase
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stationnaire ; le temps danalyse est plus long.


La pression dans la colonne est leve en HPLC (la viscosit est 100 fois plus faible pour un gaz).

I.10 Loi de Darcy

avec
P : perte de charge dans la colonne
: facteur de remplissage de la colonne
: viscosit dynamique (Pa.s ou Cp)
(eau) = 0,89 Cp, (MeOH) = 0,54 Cp, (ACN) = 0,34 Cp
u : vitesse linaire moyenne de la phase mobile
dp : diamtre des particules de la phase stationnaire
En HPLC la pression normale est 200 bars ; on peut jouer sur la vitesse u et la viscosit du fluide afin de ne pas
dgrader la colonne avec des pressions trop leves.

I.11 Solvants utiliss en HPLC


Proportions : Tous les solvants existants > solvants chimiquement compatibles avec lHPLC > solvants faisant des
interactions avec les soluts > solvants qui vont permettre une bonne sparation.
Diffrents paramtres sont prendre en compte :
La puret du solvant
La volatilit, Tb faible gnralement, entrane un risque de formation de bulles et une modification de la
composition de la phase mobile par vaporation de lun des solvants.
La viscosit
La compatibilit avec le solut et lappareillage
La miscibilit des solvants entre eux
La toxicit
I.11.1 Interactions molculaires entre phase mobile et soluts
Interactions dilectriques
Liaisons H
Forces de VdW
I.11.2 Force luante et polarit
Pour les composs polaires : + la phase mobile sera polaire, + elle va entraner les soluts.
+ la phase mobile sera apolaire, - elle va entraner les soluts.
Pour les composs peu polaires : + la phase mobile sera polaire, - elle va entraner les soluts et inversement
I.11.3 Polarit selon Snyder
On mesure le coefficient de distribution entre le solvant tudi et diffrentes phases stationnaires
Ex : thanol : donneur de protons, dioxane : accepteur de protons, nitromthane : moment dipolaire lev.
La polarit globale dun mlange de trois solvants sera : P = logK1+logK2+logK3
En normant : x1+x2+x3 = 1
Alors x1 = logK1/P
Paramtres de solubilits dHidelbrand

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avec Es : lnergie molculaire de cohsion et Vs : le volume molaire de solvant


Paramtres de solubilits partielles :
d : interactions de dispersion du nuage lectronique, interactions dilectriques
o : interactions dorientation, diples permanents
i : interactions diples induits
a, b : interactions acide/base, par transfert de liaisons H
tot2 = d2+o2+2oi+ab
Phase mobile/solut
Dispersion
Orientation
Induction
Acide/base

Non polaire/non polaire


+
-

Polaire/non polaire
+
-

Polaire/polaire
+
+
+
+

I.12 Appareillage

I.12.1 Dispersion hors colonne


Cause un largissement des pics autre que dans la colonne
Lefficacit observe est : lefficacit de la colonne et la dispersion des soluts hors de la colonne (les tubes de
liaisons, volume injecteur, dtecteur)
La dispersion due aux tubulures :
On dfinit L : longueur utilisable pour ne pas augmenter la largeur des pics de 5%

avec :
Dm : diffusivit du solut (cm2.g-1)
D : dbit dluant (mL.s-1)
d : diamtre du tube (cm)
N : nombre de plateaux thoriques
Vr : volume de rtention (mL)
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Estimation de la dispersion hors colonne : on enlve la colonne et on injecte les soluts, on obtient ainsi (hors
colonne) = 4(hors colonne)
tot2 = colonne2+ hors colonne2
I.12.2 Rservoirs de solvants
Flacons en verre, on utilise une crpine pour liminer les poussires et les bulles.
1. filtration des solvants
2. dgazages aux ultrasons
I.12.3 Dispositif de pompage
Dbits utiliss : 0,1-2 mL.min-1
Utilisation de pompes alternative : faible volume interne et utilisable avec des gradients dlution
I.12.4 Dispositif dinjection
On dpose lchantillon en tte de colonne.
P en HPLC est de lordre de qqs dizaines 100-250 bars.
Vanne dinjection :
6 voies pour les solvants
2 positions load et inject
Remplissage de la boucle dinjection avec V fix (5-500 L). Prsence dun circuit avec la phase mobile et
dun circuit avec lchantillon.
Envoi de lchantillon sur la colonne avec le circuit (pompe, boucle, colonne). Le volume inject est
constant, cela permet donc de travailler en talonnage externe pour une analyse quantitative.
I.12.5 Colonnes
Tubes en inox de longueur L = 10 25 cm
dtube = 4,6 mm le plus courant
dp = 3 10 m
N = 40000 60000 plateaux/m
On utilise aussi des micros colonnes
Avec L = 3 7,5 cm
Dp = 3 5 m
On limite ainsi la consommation de solvants.
On place souvent des pr-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp suprieur et protgent la colonne des
impurets.

I.13 Dtecteurs
I.13.1 Photomtre UV-visible
Il mesure l'absorption de la lumire par le produit la sortie de la colonne. E opre longueur d'onde
constante, celle-ci ayant t fixe par l'oprateur. La lampe Deuterium est utilis pour des longueurs d'ondes
variant de 190-350 nm et la lampe vapeur de mercure est utilis la longueur d'onde non variable de 254 nm.
Pour que ce type de dtecteur soit utilisable, il faut que :
le produit dtecter absorbe la lumire une longueur d'onde accessible l'appareil, et que son
coefficient d'absorption e soit suffisamment grand
la phase mobile n'absorbe pas la lumire la longueur d'onde choisie par l'oprateur.
Les transitions possibles sont :

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* : systmes conjugus
* : non visible en UV
n* : carbonyles
n* : alcools

Choix de la longueur donde de mesure en fonction du solut et de la phase mobile qui doit peu absorber cette
longueur donde.
Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de concentration C et de trajet
optique gal l. Si I0 est l'intensit du rayon lumineux l'entre de la solution et I son intensit la sortie, alors :
A = D.O = log (I0 / I) = e l C
o A est l'absorbance, D.O la densit optique, Io l'intensit lumineuse incidente, I l'intensit lumineuse
transmise, e le coefficient d'extinction molaire caractristique de la substance tudie une longueur d'onde
donne en L mol-1 cm-1, l l'paisseur traverse en cm et C la concentration en mol.L-1.
Plusieurs types de dtecteurs :
Dtecteur fixe : vapeur de Hg (254 nm)
Dtecteur variable
Dtecteur barrettes de diodes (1,2 nm/photodiode), gamme de 190 800 nm
Sur le spectre de solut :
On choisit un max pour chaque solut
On mesure labsorbance avec 2 pour 1 solut, alors
Il permet de vrifier la spcificit

doit tre constant

I.13.2 Rfractomtre
Il mesure la variation de l'indice de rfraction du liquide la sortie de la colonne. Cette mesure,
extrmement prcise, dpend nanmoins de la temprature du liquide. On compare cet indice avec celui de la
phase mobile pure : il y a donc une rfrence d'o le terme de variation de l'indice. Ce dtecteur exclut les
variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec
ce dtecteur.
Contrle de la temprature indispensable 0,1 C
Non utilisable en gradient dlution
I.13.3 Dtecteur fluorimtrique
Aprs excitation de lchantillon dans la gamme UV, on mesure la fluorescence restitue.
Mthode trs sensible, qui permet de dtecter 1 seule molcule.
I.13.4 Dtecteur lectrochimique
Ractions doxydorductions qui produisent un courant proportionnel la concentration du solut. Applications :
drogues, polluants, produits naturels.
I.13.5 Conductimtre
I.13.6 Diffusion de lumire
Aprs nbulisation, vaporation, on envoie un faisceau de lumire - Dtecteur universel Il faut des diffrences de diffusivit entre le solut et la phase mobile.

IV - Chromatographie de partage
I.14 Introduction
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Interactions :
Solut Phase Stationnaire
&
Solut Phase Mobile
La phase stationnaire est soit un liquide immobilis sur un support par adsorption, soit greffe par liaisons
chimiques qui augmente la dure de vie.
Chromatographie de partage polarit de phases normales : Phase stationnaire polaire, Phase mobile peu
polaire.
Chromatographie de partage polarit de phases inverses : Phase stationnaire apolaire, Phase mobile polaire.

I.15 Phases normales


On utilise des ph. stationnaires polaires : phases greffes (aminopropyl +polaire que cyanopropyl) et des phases
mobiles apolaires pour sparer des composs polaires et moyennement polaires.
Le pouvoir luant dune phase mobile est la somme des polarits de chacun des solvants.

I.16 Phases inverses


On utilise des phases stationnaires apolaires : phases C8 ou C18 et des phases mobiles polaires (eau) pour sparer
des composs peu polaires (hydrophobes) et moyennement polaires.
La phase mobile est constitue dun fort pourcentage deau.
Attention la miscibilit de tous les solvants ex : MeOH, ACN, THF, CH2Cl2.
Coefficient de partage octanol/eau :
Poe = Kow =
Log Kow = fi+cste

Avec, fi les cstes de Rekker, Log k = a log Poe + b, k facteur de capacit et a et b cste dpendant de la phase
mobile.
Phases isoluantes : phases qui conduisent des k voisins mais les
interactions mises en jeu peuvent tre diffrentes.
2 phases isoluantes pour un couple de soluts ne le seront pas pour un autre
couple.
loi gnrale : log k = A12+B 2+C
avec 1 composition du solvant 1 dans la phase mobile
Pour un mlange binaire : log k = log k0 mc
k0 : facteur de capacit avec pour ph. mobile (eau)
m : force de solvant
c : % de solvant
Pour un mlange ternaire (eau, solv1, solv2) :
A1 12+A2 2+B1 A12+B1 1+B2 2+C+D12

Pour une famille dhomologues : log k = An+B

V - Chromatographie dadsorption
I.17 Phase stationnaire
Silice : adsorbant trs polaire
La capacit dadsorption et la polarit varient en fonction du taux dhydratation.
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Chromatographie et lctrophorse

I.18 Phase mobile


Mlange de solvant
Avec 0 force luante
Si 0 = 0, pas dadsorption de phase mobile sur phase stationnaire
Si 0 augmente alors le pouvoir luant augmente aussi et les molcules de phase mobile prennent la place
des molcules de solut.

I.19 Mcanisme de rtention


I.19.1 En CCM
La phase stationnaire est immobilise et la migration se fait par capillarit.

La vitesse de migration du solvant est

et celle du solut

o tM est le temps de migration.

Do
Sur la colonne

et

do

Les vitesses tant gales en CCM et en HPLC :


I.19.2 Thorie de Snyder

Loi de rtention :
Loi de Snyder :
* tant le taux dactivit de la silice : si = 1 silice dshydrate, si = 0 silice dsactive.
Le domaine dapplication se situe dans la sparation disomres.

VI - Chromatographie ionique
I.20 Introduction
Elle spare les soluts ioniques (sels) ou ionisables (molcules organiques) et tend tre remplace par
llectrophorse capillaire.
3 types :
change dions
Appariement dions
Exclusions dions

I.21 Chromatographie dchange dions


La phase stationnaire est ionique :
Soit cationique/anionique forte (ne varie pas en fonction du pH)
Soit cationique/anionique faible (varie en fonction du pH)
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Chromatographie et lctrophorse

Une phase stationnaire anionique permet de sparer des cations


La phase mobile est un lectrolyte, la rtention dpend du pH, de la force ionique
Si I augmente, k diminue, il y a rtention de la phase mobile sur la phase stationnaire.
Dtection : Conductimtrie : on mesure la conductance de la solution et on place des suppresseurs dions pour
augmenter la sensibilit.

I.22 Appariement dions


On ajoute dans la phase mobile un agent dappariement dions (AAI) = un tensioactif.
La phase stationnaire est similaire la chromatographie de partage en phase inverse.
I.22.1 Influence de divers paramtres
Longueur de la chane Cn de lAAI : log(k-kA) = n a
Concentration de lAAI : k = [AAI] a
Ajout dun solvant organique, si sa concentration augmente, la rtention diminue ; on lutilise pour
solubiliser les espces.

VII - Electrophorse capillaire


I.23 Introduction
Mthode qui permet la sparation despces en milieu biologique (protines) difficilement spare par lHPLC.
Llectrophorse de zone : migration des espces charges dans un champ lectrique, et en solution dans
llectrolyte.

I.24 Dfinitions
I.24.1 Proprits des lectrolytes
Ions, molcules ou particules charges soumises un champ lectrique subissent une force :
Force de friction :
Do la vitesse de la particule
I.24.2 Mobilit lectrophoretique ep
Mobilit de lespce charge dans un lectrolyte suppos immobile :
Si lespce est positive ep>0
Si lespce est ngative ep<0
Et
I.24.3 Mobilit lectroosmotique eo
Mobilit de llectrolyte
Une espce neutre se dplace la vitesse
I.24.4 Mobilit apparente
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Chromatographie et lctrophorse

Soit la tension applique V dans un champ E, avec L, la longueur du capillaire :


Soit le temps de migration, avec l, la longueur de migration :

Alors

I.25 Analyse quantitative


I.25.1 Injection

Soit qi la quantit de produit dtecte ; alors quelque soit le mode de dtection :


concentration de produit i dans llectrolyte et tMi son temps de migration.

, avec Ai la

En injection hydrodynamique : la composition de lchantillon nest pas modifie.


Alors
En injection lectrocintique : linjection se fait via un champ lectrique donc les compositions de lchantillon
inject et de lchantillon dans llectrolyte sont diffrentes.
Alors
I.25.2 Dtection
En E.C. les soluts traversent la cellule de dtection leur vitesse propre, ce qui fait quon dtecte une quantit q
de produit dans un volume V de concentration C pendant dt.
Avec un dtecteur linaire la rponse est proportionnelle la concentration.
Quantit de produit dtect q :

S : section du capillaire
v : vitesse du produit dans le capillaire
V : volume de produit de concentration C
K : cte

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