Les différentes techniques de Chromatographie

1. Historique

La chromatographie, méthode d'analyse physico-chimique, sépare les constituants d'un

mélange (les solutés) par entraînement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le
long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la (ré)partition sélective des
solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention
(exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).
La première chromatographie a été réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tswett et
consistait à séparer les pigments (en grec : "chromato") d'une feuille d'épinard. Tswett avait
observé la séparation des colorants végétaux, dont les chlorophylles, lorsqu'il filtrait leur
solution dans l'éther de pétrole, sur une colonne de carbonate de calcium. Dans ces
conditions, en effet, des zones colorées vertes et jaunes se forment. Tswett constatait : "Tout
comme les rayons lumineux d'un spectre, les différentes composantes d'un mélange de
colorants se déploient sur la colonne de carbonate de calcium selon une loi et peuvent être
analysées qualitativement.

2. Classification des chromatographies

Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe
et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge
électrique, la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les
différents types de chromatographie résultent du fait que l'on a privilégié l'effet de l'un de ces
facteurs, mais l'exclusivité d'un mécanisme n'est jamais totale au cours d'une séparation
chromatographique.

3. Différents types de Chromatographie

3.1 Chromatographies en phase liquide (CPL) :

La phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on
distingue :

3.1.1 les chromatographies de PARTAGE

- La chromatographie de partage : c'est une chromatographie liquide-liquide. La

phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte. Cette chromatographie est
ainsi appelée car elle est basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides.

- La chromatographie d'exclusion : elle est encore appelée chromatographie

d'exclusion-diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration, perméation de gel. La phase
stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe,
en revanche les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel.

3.1.2 les chromatographies d'ADSORPTION :

-La chromatographie d'adsorption : c’est une chromatographie liquide-solide. La

phase stationnaire est un adsorbant solide polaire.
- La chromatographie d'adsorption en phase inverse : c’est une chromatographie
liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire.

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 - La chromatographie sur échangeurs d'ions : la phase stationnaire est un échangeur
d'ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou
positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques
du milieu.
- La chromatographie d'affinité : la phase stationnaire est un support macromoléculaire
chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique
(bio-affinité) pour un soluté de l'échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-
récepteur, antigène-anticorps).
3.2 Chromatographies en phase gazeuse (CPG) : La phase mobile est un gaz
vecteur. On distingue dans ce cas :

- La chromatographie gaz-liquide : c’est une chromatographie de partage. La phase

stationnaire est un liquide fixé par imbibition d'un support.

La chromatographie gaz-solide : c'est une chromatographie d'adsorption. La phase

stationnaire est un solide adsorbant.

Chromatographie en phase gazeuse : Gas Chromatography

1. Introduction

La principale différence entre la chromatographie en phase gazeuse (CPG) et les

autres techniques chromatographiques réside dans l'utilisation d'un gaz comme phase
mobile. Chronologiquement la GPC est apparue après la chromatographie en phase liquide.
Dans les premières méthodes proposées, la phase stationnaire est un adsorbant solide: c'est
la chromatographie d'adsorption gaz-solide (GSC) encore parfois utilisée. En 1952 Martin et
James proposent pour la première fois l'emploi d'une phase stationnaire liquide déposée
sous la forme d'un film à la surface d'un support solide: c'est la chromatographie de partage
gaz-liquide (GLC) qui a pris rapidement une extension considérable et qui est actuellement
beaucoup plus utilisée que la GSC.

2. Appareillage

Il comprend essentiellement 2 parties

Schéma simplifié d’un chromatographe en phase gazeuse

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 -La première réalisant la chromatographie proprement dite comporte:
un ensemble constitué par une réserve de gaz vecteur et des dispositifs permettant d'en
régler la pression et le débit. Une chambre d'injection destinée à l'introduction d'un
échantillon du mélange analysé. Une colonne contenant la phase stationnaire, placée dans
un four.
- La seconde réalisant la détection et le tracé du chromatogramme comporte:
un détecteur et un enregistreur.

a) Gaz vecteur: La phase mobile est un gaz de faible viscosité qui doit être pur et inerte,
trois gaz sont  exclusivement employés, l'azote, l'hydrogène et l'hélium. Les analyses
employant l'hydrogène pourront donc être effectuées 3 fois plus rapidement que celles
utilisant l'azote (à efficacité constante). Malheureusement l'hydrogène est un gaz dangereux
présentant des risques d'explosion et qui n’est pas toujours inerte vis à vis des substances
chromatographiées. Pour ces raisons de sécurité, c'est l'hélium qui en général utilisé.

b) Chambre d'injection:

La chambre d'injection ou injecteur est placée immédiatement avant la colonne et est

traversée par le gaz vecteur. L'injecteur standard (95% des appareil en sont équipés) d'un
chromatographe avec colonne capillaire est du type "split/splitless". C'est à dire que l'on peut
ajuster la quantité de produit passant dans la colonne par rapport à la quantité injectée dans
le chromatographe. Cet ajustement se fait à l'aide d'une vanne. Si on injecte un microlitre de
produit (1 µl) et que seulement 0,01 μl rentre dans la colonne, on a un "split" de 100 et 0,99
μl de la solution a été évacué à l'extérieur via la vanne de "split".
En revanche, si l'on dispose d'un produit très minoritaire ou très dilué dans un solvant, on
peut choisir de l'injecter en mode "splitless", dans ce cas tout le produit injecté se retrouve
dans la colonne. Il faut dans ce cas baisser la température du four vers 20-30°C sous la
température d'ébullition du solvant et dans certain cas couper ou déconnecter le détecteur
pendant l'élution du solvant. Les gaz sont injectés au moyen d'une seringue étanche ou alors
à travers une chambre de gaz de volume constant.

Principe d'un injecteur "split-splitless"

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c) Colonne: c’est l'accessoire fondamental de la CPG, on distingue:

 - Les colonnes à remplissage ou remplies classiques
- et les colonnes creuses ou capillaires de Golay._

Colonnes remplies.

Les colonnes les plus répandues sont en acier inox ou en verre, leur longueur standard est
de 3 m, leur diamètre intérieur étant compris entre 10 et 4 mm.
Ces colonnes sont remplies d'un support inerte imprégné d'une phase stationnaire, le
diamètre des particules est entre 100 et 200 mm. Le taux d'imprégnation des phases
stationnaires varie entre 1 et 10% en masse. Ces colonnes sont maintenant très peu
employées.

Colonnes capillaires

Les colonnes standard sont en quartz fondu (silice très pure) et entourées d'une gaine de
polymère souple,  ce qui leur confère une grande résistance à la torsion
Elles ont entre 10 et 100 m de long et leur diamètre intérieur est entre 0,10 ou 0,70 mm. La
phase stationnaire est greffée sur les parois de la colonne, l'épaisseur de phase stationnaire
varie entre 0,10 mm et 5 mm. Les colonnes les plus répandues sont du type WCOT  (Wall
Coated upon Tubular Column)

Figure 4-3 Différents type de colonnes capillaires

Comme le montre la figure ci-après le pouvoir de séparation des colonnes capillaires

(N=100000)  est beaucoup plus grand que celui des colonnes remplies (N=4000).

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 Figure 4-4.  Chromatogrammes de l'huile "d'iris " obtenus (en haut) sur une colonne
capillaire de 50 m et (en bas) sur une colonne remplie de 4m.

d) Four: c'est une enceinte thermo statée à température réglable entre 20 et 400°C. Il
contient l'injecteur, la colonne et le détecteur. La chambre d'injection et le détecteur sont
généralement portés à une température plus élevée que la colonne pour permettre une
vaporisation rapide et surtout pour empêcher une condensation dans le détecteur. La
température choisie doit être maintenue constante grâce à un système de régulation. Les
appareils plus perfectionnés sont munis d'un ensemble de programmation permettant, à
partir d'un moment donné, d'augmenter régulièrement la température du four, avec un
gradient pouvant varier d'une fraction de degré à plusieurs degrés.

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e) Détecteurs et Enregistreur:
 Le détecteur identifie et mesure les constituants du mélange à leur émergence de la
colonne. Il émet un signal d'intensité proportionnelle à la quantité‚ présente de chaque
constituant. Ce signal est repris par un système électronique qui le transforme en une
variation d'intensité de courant électrique inscrit sur un enregistreur sous forme d'un pic, sur
le chromatogramme qui se déroule en temps programmé‚ apparaissent une série de pics
dont la surface, à partir de la ligne de base, est proportionnelle à l'intensité du signal émit par
le détecteur. Certains détecteurs ont été élaborés pour répondre à tous les composés en
général alors que d'autres ont été développés pour être sélectifs envers un certain groupe de
composés. Les détecteurs les plus utilisés sont:

Détecteur par thermo-conduction (conductibilité thermique):

Le principe de détection repose sur le fait que la température prise par un fil fin chauffé
électriquement, dépend de la nature du gaz qui l'entoure. Les filaments métalliques se
trouvant à l'intérieur d'une cellule de conductibilité thermique forment un pont de
Wheatstone qui mesure la différence entre la conductibilité thermique du gaz vecteur pur et
celle du gaz vecteur contenant les substances chromatographiées. Les molécules
possédant une masse moléculaire élevée sont de moins bons conducteurs que les
molécules du gaz vecteur (hydrogène, hélium); donc le filament parcouru par un courant
électrique s'échauffe davantage et sa résistance augmente lorsque le gaz vecteur contient
une substance. C'est cette variation de conductibilité‚ thermique qui est transformée en
variation de résistance et cette dernière est mesurée grâce au pont de Wheatstone. Ce
détecteur est le moins sensible de tous les détecteurs.

Détecteur par ionisation de flamme:

C’est le détecteur le plus couramment utilisé. Le principe de ce détecteur consiste à ioniser
les molécules organiques en les envoyant dans une flamme air/H2. Les ions formés sont
collectés entre deux électrodes et provoquent un courant d'ionisation qui, après avoir été
amplifié, est envoyé à l'enregistreur. La réponse est linéaire dans un domaine plus ou moins
grand de concentration, qui dépend de la nature de la substance organique. Ce détecteur a
une excellente sensibilité‚ permettant de doser des composés de l'ordre du ppb. Il est
insensible à la plupart des composés inorganiques (à l'eau en particulier), donc les solutions
aqueuses peuvent être injectées.

Détecteur par capture d'électrons:

Ce détecteur a une sensibilité extraordinaire pour les composés qu'il peut détecter. La
propriété‚ utilisée est la possibilité‚ pour une molécule présentant un caractère électrophile
de capter des électrons libres en donnant, des ions négatifs. Le gaz vecteur est ionisé‚ en
sortie de la colonne, par exemple en présence d'une source de tritium; un flux d'électrons
lent constitue un courant stable de base. Lorsqu'une substance électrophile ou réductible se
trouve dans la phase mobile, celle ci capte et absorbe les électrons de ce flux, d'où une
chute de courant de base proportionnelle à la quantité‚ des molécules captantes.
Cette technique est particulièrement utile pour la détection de composés organiques
halogénés: tels que le chloroforme présent dans les eaux traitées au chlore, les insecticides
et les pesticides.

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D'autres détecteurs ont été mis au point, mais ils sont spécifiques, c'est à dire qu'ils ont une
très grande sensibilité pour des catégories de produits.

Type du détecteur (abréviation anglaise) Sélectivité, produits détectés

Ionisation à flamme (FID) La plupart des produits organiques

Conductibilité thermique (TCD) Universel

Capture d'électrons (ECD) Produits halogénés, organométalliques

Thermo-ionisation (TID) Produits azotés ou phosphorés

Photo-ionisation (PID) Produits oxygénés, soufrés, organométalliques…

Photométrique (FPD) Soufrés, phosphorés, organométalliques…

Spectromètre de masse  (GC-MS) Universel

Le détecteur à conductibilité thermique est linéaire et non discriminant mais moins sensible
que le détecteur à ionisation de flamme. Un spectromètre de masse équipe 30% des
chromatographes en phase gazeuse, cette proportion croît à cause de l'extrême sensibilité
de ce détecteur et au fait que l'obtention du spectre de masse permet l’identification des
produits.

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