L3-USTHB Techniques d’Analyse

La chromatographie
La chromatographie (du grec ancien khrôma, « couleur » et / graphein, « écrire ») est une
méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un
mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse)
L'appareil utilisé pour effectuer certaines chromatographies se nomme chromatographe.
L'image ou le diagramme obtenu par chromatographie est appelé chromatogramme. Lorsqu'on
utilise un chromatographe et un logiciel de chromatographie, le chromatogramme prend
généralement la forme d'un graphique qui traduit la variation d’un paramètre relié à la
concentration du soluté en sortie de colonne, en fonction du temps (ou du volume) d’élution

Le botaniste russe Mikhail Tswett fut, en 1906, le premier à utiliser le

terme« chromatographie ». Tswett utilisait depuis 1903 des colonnes d'adsorption pour
séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à
partir du grec ancien khrôma, « couleur » et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais
cette explication, mais tswett est le mot russe pour « couleur ».
En 1906 un chimiste russe, Tswett, a séparé des pigments végétaux colorés sur une
colonne remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments étaient entraînés avec
de l'éther de pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). Il a observé sur la colonne la
formation de bandes de couleur différente (vert, orange, jaune..). Il a donné à cette
technique le nom de chromatographie (écriture des couleurs). Il a défini également les
termes : chromatogramme, élution, rétention.

Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a purifié par la
méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf.

Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils

obtiennent le prix Nobel en 1952

En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).

En 1968, mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou

HPLC en anglais.

La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile
(ou éluant) à travers une phase stationnaire (ou phase fixe).
La phase stationnaire, fixée soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface
plane, retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon
l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals,
les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase
stationnaire.
Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par
la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase
stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

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Les différents types de chromatographie

• chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ;

• chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV
(chromatographie en phase vapeur) ;
• chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ;
• chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ;

La chromatographie en phase gazeuse

Technique de séparation applicable aux composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés

par élévation de T°. Elle est limitée aux composés thermostables et suffisamment volatils
(MM<300)

➢ Les gels de silice :

C’est la phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie et notamment en C.L.H.P
Le gel de silice est constitué de micro sphères de diamètre sensiblement constant pouvant
varier de 2 à 5 µm.

Les gels de silice sont stables dans une grande gamme de pH mais ils ne supportent pas des
pH trop extrêmes. Il y a des risques de dissolution pour des pH trop acides ou trop basiques,
on se limite donc a la gamme 2 < pH < 12. Des gels spéciaux existent pour une utilisation à
pH extrêmes. La qualité d’un gel dépend de plusieurs paramètres : taille des grains, porosité
ouverte (dimensions et répartition des pores), résistance à l’écrasement, surface spécifique…

Les gels courants pour C.L.H.P ont les caractéristiques suivantes :

diamètre de 2 à 5 µm, résistance à l’écrasement sous 1000 bars, surface spécifique 350 m2/g,
porosité 0,7 mL / g , taille des pores 10 nm.
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CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE: H.P.L.C

La chromatographie liquide haute performance est très utilisée dans tous les domaines de la
chimie analytique. Son succès est du au fait qu’il est possible de modifier la résolution en
jouant sur la composition de la phase mobile. Elle utilise des colonnes remplies d’une phase
stationnaire constituée de particules sphériques de très petites dimensions de diamètre
couramment compris entre 2 et 5 µm ce qui conduit à de grandes efficacité et résolution.
L’inconvénient est que plus les particules sont petites et plus il est difficile de faire s’écouler
le solvant, on doit donc utiliser des pompes spéciales qui poussent le solvant sous des
pressions très élevées. A l’origine le P de H.P.L.C correspondait donc au mot Pression. La
grande efficacité de la technique fait que le P désigne actuellement le mot Performance.

Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes : fournir des pressions élevées jusqu'à
400 bars. Débit stable, et réglable de 0,1 à 10 mL/min. résistance à la corrosion quelque soit le
solvant utilisé
La pression à imposer dépend des facteurs suivants :
- débit de la phase mobile
- viscosité de l’éluant
- taille des grains de la phase stationnaire
- géométrie de la colonne

La phase normale:
La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc
utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont
retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de
silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.

La phase inverse :
La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8
ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant
polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement

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à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la
qualité de la séparation est donc maintenue constante.

Si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;

Si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus
souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en
phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention
des composés.

Comparaison CPG – HPLC

CPG HPLC

- Séparation en phase gazeuse - Séparation en phase liquide

- Composés volatils et non - Indifférent
thermolabiles - Séparation à température ambiante
- Séparation à température élevée - Grande latitude d’ajustement des
- Sélectivité limitée sélectivités
Ces deux Techniques analytiques sont de routine, Travail sur des quantités infimes de
produits. Domaines d’applications variés. Possibilité de coupler la technique avec d’autres
méthodes analytiques (AA, SM, IRTF…)

Chromatographie sur couche mince (CCM)

➢ Définition et appareillage:
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes
d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long
d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de
matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du
solvant.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé
par un couvercle étanche.
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant
est fixée sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté plâtre,
l'amidon ou un polymère organique.
l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser,
déposé en un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant. l'éluant : un solvant pur ou

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un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de

l'échantillon.

➢ Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve fermée,
l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque
composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette
vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la phase
stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent
donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la
phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption.

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Chromatographie en phase gazeuse

I. Introduction

La chromatographie en phase gazeuse ou vapeur est une technique de séparation des

composés gazeux ou susceptible d’être volatilisés par élévation de la température. Elle est
limitée aux composés thermostable et suffisamment volatils.

Grace à cette méthode, on est arrivé à séparer des corps ayant des points d’ébullition très
voisines comme (para xylène : 138.5 ; méta xylène : 139 ; ortho xylène : 144°C).

L’échange de matière se fait entre la phase mobile gazeuse et soit :

➢ Une phase stationnaire solide chromatographie d’adsorption

➢ Une phase stationnaire liquide chromatographie de partage

II. Eléments constituants un chromatographe (Accessoires du chromatographe)

➢ Four c'est une enceinte thermo statée à température réglable entre 20 et 400°C. Il
contient l'injecteur, la colonne et le détecteur. La chambre d'injection et le détecteur sont
généralement portés à une température plus élevée que la colonne pour permettre une
vaporisation rapide et surtout pour empêcher une condensation dans le détecteur. La
température choisie doit être maintenue constante grâce à un système de régulation. Les
appareils plus perfectionnés sont munis d'un ensemble de programmation permettant, à
partir d'un moment donné, d'augmenter régulièrement la température du four, avec un
gradient pouvant varier d'une fraction de degré à plusieurs degrés.

➢ Chambre d’injection ou injecteur est placée immédiatement avant la colonne et est

traversée par le gaz vecteur. Il permet d’introduire et de rendre volatil l’échantillon à

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analyser. La quantité injectée varie entre 0.1 à 5µl. L’injection se fait grâce à des micro
seringues.

Les injecteurs doivent posséder les caractéristiques suivantes :

✓ Assurer une récupération totale sans prendre les légers au dépend des lourds
✓ Avoir une reproductibilité et une justesse pour permettre l’analyse quantitative
✓ Autoriser l’introduction pour n’importe quelle concentration, volatilité et polarité du
soluté
✓ Etre d’une utilisation simple
✓ Avoir un cout le plus bas possible

➢ Colonne c'est l'accessoire fondamental du chromatographe, elle contient la phase

stationnaire, donc c’est à son niveau les différentes molécules de l’échantillon injecté vont
se séparer suivant leurs affinités avec la phase stationnaire.

On distingue deux types de colonne :

Colonnes remplies
Les colonnes les plus répandues sont en acier inox ou en verre, leur longueur standard est de 3
m, leur diamètre intérieur étant compris entre 10 et 4 mm.
Ces colonnes sont remplies d'un support inerte imprégné d'une phase stationnaire. Pour la
CPG gaz-solide, le remplissage se fait avec un support adsorbant (charbon actif, tamis
moléculaire, alumine) et pour la CPG gaz liquide, le remplissage se fait avec un support
inactif (silice, poudre de brique). Le diamètre des particules est entre 100 et 200 mm. Le taux
d'imprégnation des phases stationnaires varie entre 1 et 10% en masse. Pour ce type de
colonne, le tube étant bobiné dans le four. Ces colonnes sont maintenant très peu employées.

Colonnes capillaires
Les colonnes standard sont en quartz fondu (silice très pure) et entourées d'une gaine de
polymère souple, ce qui leur confère une grande résistance à la torsion
Elles ont entre 10 et 100 m de long et leur diamètre intérieur est entre 0,10 ou 0,70 mm. La
phase stationnaire est greffée sur les parois de la colonne, l'épaisseur de phase stationnaire
varie entre 0,10 mm et 5 mm. Les colonnes les plus répandues sont du type WCOT (Wall
Coated upon Tubular Column)
-CPG gaz-liquide : la phase stationnaire répartie sous forme d’un film mince

-CPG gaz-solide : phase stationnaire répartie sous forme d’une forme d’une couche fine
d’adsorbant

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Fig. Différents type de colonnes capillaires

➢ Phase stationnaire est la partie active de la colonne, la séparation a lieu entre celle-ci
et le gaz vecteur (phase mobile). La phase stationnaire est caractérisée par :
• Une inertie chimique
• Une solubilité appréciable vis-à-vis des solutés à analyser et qui sont transporté par le
gaz vecteur.

Les phases stationnaires peuvent être :

-polaires (polyethylène glycol, Carbowax, polystyrène)

-apolaire (silicone, squalane, Carbures saturés)

Il faut que le soluté ou l’échantillon à analyser ait une polarité proche de celle de la phase
stationnaire.

Exemple : phase stationnaire polaire

A B

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A : est le moins retenu donc A est un composé apolaire

B : est le plus retenu donc B est un composé polaire.

➢ Gaz vecteur (phase mobile) Il véhicule le mélange à analyser jusqu’au détecteur, il

doit être inerte à la fois vis-à-vis des solutés et vis-à-vis de la phase stationnaire.

Quatre types de gaz vecteur sont surtout utilisés : hélium (He), dihydrogène (H2), diazote (N2)
et argon (Ar). Ils peuvent être fournis soit par des cylindres de gaz ou produits par des
générateurs. Ces gaz vecteurs doivent être purs, exempts d’eau, de dioxygène et
d’hydrocarbures légers pour éviter toutes réactions avec les solutés et la phase stationnaire.

Si en plus en utilise le détecteur à ionisation de flamme, il faut avoir deux autres bouteilles
une d’Hydrogène et une autre d’air reconstitué.

Mesure du débit du gaz vecteur

Certains chromatographes son équipés d’un système de mesure du débit du gaz vecteur, soit à
l’entrée, soit à la sortie de la colonne, sinon, on mesure le débit du gaz vecteur à la sortie de la
colonne grâce à des débitmètres.

Exemple : débitmètre à film de savon

On mesure le temps que va mettre une bulle de savon

entre deux graduations

Il y a à remarquer qu’il faut débrancher le détecteur de

la colonne pour effectuer la mesure

➢ Détecteur Le détecteur identifie et mesure les constituants du mélange à leur émergence

de la colonne. Il émet un signal d'intensité proportionnelle à la quantité‚ présente de chaque
constituant. Ce signal est repris par un système électronique qui le transforme en une variation
d'intensité de courant électrique inscrit sur un enregistreur sous forme d'un pic, sur le
chromatogramme qui se déroule en temps programmé‚ apparaissent une série de pics dont la
surface, à partir de la ligne de base, est proportionnelle à l'intensité du signal émis par le
détecteur. Certains détecteurs ont été élaborés pour répondre à tous les composés en général
alors que d'autres furent développés pour être sélectifs envers un certain groupe de composés.
Les détecteurs les plus utilisés sont :

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Le catharomètre : détecteur par thermo-conduction (conductibilité thermique):

C’est un détecteur différentiel composé de deux cellules, l’une de référence parcourue par le
gaz vecteur, l’autre de mesure parcourue par le flux sortant de la colonne (gaz vecteur et
produits élués), les deux cellules renferment chacune une résistance de bonne stabilité faisant
partie d’un pont de Wheatstone.
Ce détecteur fonctionne d’après le principe suivant :
Quand les cellules de référence et de mesure sont parcourues uniquement par le gaz vecteur,
le pont est équilibré, mais dès qu’un soluté traverse la cellule de mesure, un deséquilibre du
pont apparait d’où l’enregistrement d’un pic.
Pour ce détecteur, il est important de choisir le gaz vecteur ; exemple : pour l’analyse des
hydrocarbures, il faut choisir l’hélium ou l’hydrogène comme gaz vecteur car l’azote a une
conductibilité thermique voisine de celle des hydrocarbures.

Les avantages de ce détecteur sont : sa simplicité, son large domaine de linéarité, sa réponse
générale aux espèces organiques ou inorganiques (universel) et son caractère non destructif
qui permet de collecter les solutés après leur détection (il ne détruit pas l’échantillon à
analyser).

Détecteur par ionisation de flamme :

C'est le détecteur le plus couramment utilisé. On le considère comme un détecteur non
spécifique car il peut déceler pratiquement tous les composés combustibles c’est-à-dire les
composés organiques. Il n’est pas sensible aux molécules minérales présentant un potentiel
d’ionisation élevé comme l’eau, CO, CO2, SO2, N2 et les NOx, ce qui présente un avantage
lorsque l’on veut analyser des solutions aqueuses ou des composants de l’atmosphère (il ne
répond pas aux composés inorganiques) .
Le principe de ce détecteur consiste à ioniser les molécules organiques en les envoyant dans
une flamme air/H2. Les ions formés sont collectés entre deux électrodes et provoquent un
courant d'ionisation qui, après avoir été amplifié, est envoyé à l'enregistreur.

Les avantages sont : une sensibilité élevée (≈10-13 g de soluté / ml de gaz vecteur). Cette
sensibilité évolue selon les molécules : elle est maximale pour les molécules possédant des
atomes de carbones liés à d’autres atomes de carbone ou des atomes d’hydrogène. La
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sensibilité diminue si le composé possède des groupements fonctionnels tels que : carbonyles,
alcool, halogène et amine. Il présente un domaine étendu de réponse linéaire. Il est robuste et
simple d’utilisation. Il est insensible à la plupart des composés inorganiques (à l'eau en
particulier), donc les solutions aqueuses peuvent être injectées.

Inconvénient : il détruit l’échantillon lors de sa détection.

Il existe d’autres détecteurs spécifiques comme :

-détecteur à captures d’électrons
-détecteur à thermo ionisation
-détecteur à photométrie de flamme ou à émission atomique.

III. Grandeurs de rétention

1. Temps de rétention

I tR

tm t’R

t
0

tR : temps de rétention. C’est le temps que va mettre un composé de l’injection jusqu’à la

sortie de la colonne.

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t’R : temps de rétention réduit= tR- tm, où tm est le temps que va mettre un composé non retenu
de l’injection jusqu’à la sortie de la colonne.

Donc t’R c’est le temps que va mettre un composé dans la phase stationnaire.

Mais pour la CPG il y a des pertes de charge entre l’entrée et la sortie de la colonne, donc le
débit du gaz vecteur à la sortie de la colonne est supérieur à celui de l’entrée.

Donc on définit (t’R)° « temps de rétention absolu » comme étant t’R corrigé et on a

(t’R)° = J t’R

Avec J : facteur de James et Martin J=3/2[((Pe/Ps) 2 -1) / ((Pe/Ps) 3 -1)]

Remarque

Quand l’appareil de chromatographie n’est pas équipé d’un intégrateur, les mesures du temps
de rétention se font sur papier, soit la vitesse de déroulement de papier

tR= dR/v

Le Temps de rétention dépend de :

La température de la colonne
La longueur de la colonne
La nature de la phase stationnaire
Le débit de la phase mobile

2. Volume de rétention

Le volume de rétention Vr correspond au volume de la phase mobile nécessaire pour éluer le

soluté. VR= tR *D avec D: débit du gaz vecteur

De même, on a V’R= t’R* D et de même pour le volume mort VM = tM * D

3. Facteur de résolution

RAB= 2 (tRB – tRA)/(ωB+ωA)

ωB, ωA : largeurs de pics à la base

RAB =0 : aucune séparation

RAB < 1 : mauvaise séparation

ω
1<RAB<1.5 : bonne séparation

RAB˃1.5 : très bonne séparation

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4. Efficacité dune colonne (nombre de plateaux théoriques)

L’efficacité d’une colonne est mesurée pour chaque composé, par le nombre de plateaux
théorique N ainsi que la détermination de H (HEPT) (hauteur équivalente à un plateau
théorique).

H= L/N L est la longueur de la colonne.

N= 16 (tR/ω)² ou 5.54 (tR/δ)² δ est la largeur du pic à mi hauteur

Et ω est la largeur du pic à la base

Avant toute analyse, il faut tracer la courbe de Van Deemter qui change si on change le gaz
vecteur.

5. Coefficient de partage (distribution) K

Les séparations chromatographiques sont basées sur la répartition des solutés dans les deux
phases soluté A (phase mobile) soluté A (phase stationnaire)

La constante d’équilibre de cette réaction est appelée : coefficient de distribution

K = CS/CM

CS : concentration du soluté dans la phase stationnaire et CM : concentration dans la phase

mobile

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6. Le facteur de sélectivité α

Il décrit la position, l’un par rapport à l’autre, de deux pics adjacents.

Le facteur de sélectivité α peut être exprimé à l’aide des paramètres de rétention :

α=t’R2/ t’R1 avec t’R = tR- tM α= K2/K1

IV. Analyse qualitative et analyse quantitative

1. Analyse qualitative

L’analyse qualitative peut se faire par injection des corps purs (méthode des étalons) et
comparer leurs temps de rétention avec celui de l’échantillon inconnu. Il faut compléter cette
analyse par des ajouts des corps purs à l’échantillon de départ (méthode de superposition)

Quand, il s’agit d’un corps dont on connaît la famille (alcanes, alcènes, alcools), on utilise les
formules

- à température constante log (tR’) = a n + b

n est le nombre de carbones, a et b des constantes à déterminer

- à température variable (tR’) = a n + b

De même on peut déterminer l’Indice de rétention de KOVATS par

IX = 100n ((log (tRX’) - log (tRZ’) / (log (tRZ+n’) - log (tRZ’)) + 100 Z

Avec X compris entre Z et Z+n

Pour un alcane linéaire IX = 100* n n est son nombre de carbones

Et on le compare à des indices de KOVATS déterminés pour la même phase stationnaire

Cette formule est applicable quand la température de la colonne est constante

Si la température n’est pas constante, on applique la formule :

IX = 100n (( (tRX’) - (tRZ’) / ( (tRZ+n’) - (tRZ’)) + 100 Z

2. Analyse quantitative

La chromatographie quantitative est basée sur la reproductibilité des séparations et sur la

relation entre deux paramètres suivants :

-La masse du composé injecté dans le chromatographe.

- L’aire du pic correspondant (ou parfois la hauteur du pic lorsqu’il est très étroit).
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2.1. Détermination de la surface d’un pic

L’évaluation de la surface des pics peut être réalisée par différentes méthodes (méthodes
manuelle, géométriques)

- découper le pic et le peser, la précision de cette méthode est liée à l’homogénéité du

papier
- Planimétrie : consiste à suivre le tracé du chromatogramme à l’aide d’un planimètre
(parcourir le périmètre du pic). Le déplacement de la tête de mesure du planimètre est
traduit en unité de surface.
- Déterminer la surface d’un pic par : Ai = hi  (2 )1/2 avec  écart type du pic gaussien

Ces méthodes ont perdu leur importance au profit de système d’intégration automatique qui
permet la détermination des aires des pics. Ces appareils automatiques utilisés visualisent et
affichent les surfaces intégrées.

L’intégration automatique permet :

- L’élimination du facteur humain

- Une excellente approche de l’aire réelle
- Une excellente reproductibilité sur l’évaluation des aires
- Une rapidité d’exécution appréciable

L’aire du pic obtenue est liée à la quantité de soluté ayant traversé le détecteur par la relation
suivante : mi= fi* Ai

L’analyse quantitative va donc se limiter à la détermination de deux grandeurs :

-l’aire d’un pic (A)

- le facteur de proportionnalité relatif à ce pic (f).

Dans des conditions d’analyses contrôlées, ces deux paramètres varient linéairement avec la
concentration du soluté.

2.2. Principales méthodes de détermination des concentrations

2.2.1. Méthode de la normalisation interne

C’est une méthode réservée aux mélanges dont les solutés ont été élués et dont les pics sont
séparés.
% poids = [fi Ai /  fi Ai]*100

On considère que les coefficients de correction sont connus dans les conditions
expérimentales considérées.

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Si les facteurs de correction sont les mêmes pour tous les composés, on a

% poids = Ai /  Ai

Remarque

- Les coefficients de correction doivent être déterminés dans les mêmes conditions d’analyse.

- Tous les composés du mélange doivent être élués avec une bonne résolution

-La méthode ne permet pas l’analyse d’un mélange inconnu

2.2.2. Méthode de l’étalonnage externe

Principe de la méthode
La méthode est basée sur la comparaison de deux chromatogrammes (étalonnage et dosage)
obtenus successivement et dans des conditions chromatographiques strictement identiques
(maintien du coefficient de proportionnalité Fi à une valeur constante).
• Chromatogramme de référence :
On injecte un volume V donné d’une solution de référence contenant le composé M à doser à
une concentration connue CRéf, on mesure l’aire du pic ARéf.
CRéf * V= mRéf= FRéf * ARéf

• Chromatogramme du dosage :
On injecte un volume V rigoureusement identique au précédent de la solution à doser du
composé M de concentration inconnue CEch, on mesure l’aire du pic AEch.

CEch *V=mEch= FEch* AEch

• Calcul de la concentration inconnue :

•
CRéf * V= F* ARéf
CEch *V= F* AEch

D’où: CEch = CRéf * (AEch/ ARéf)

Exigences de la méthode:
- Les concentrations des solutions de référence et de dosage doivent être du même ordre
de grandeur.
- Les conditions chromatographiques doivent rester strictement inchangées entre les
injections (l’irrégularité des volumes injectés peut être minimisée par l’utilisation
d’injecteur à vanne ou injecteur automatique).

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