METHODES DE SEPARATION

CHROMATOGRAPHIQUE
I. INTRODUCTION
 Principe de la chromatographie

 Le principe est basé sur les différences d'affinité des composés du mélange

avec la phase stationnaire et la phase mobile.

 Cette méthode d'analyse permet l'identification et le dosage de composés dans

un mélange.
CLASSIFICATION DES METHODES
CHROMATOGRAPHIQUES
 Chromatographie sur couche mince CCM

 Il s’agit d’une technique d’analyse qui s’appuie sur les différences d’affinités de

substances chimiques entre une phase fixe, la plaque, et une phase mobile,
l’éluant.

 Cette différence va permettre la séparation de ces différentes substances sur la

plaque.

 Identification ? Chaque espèce chimique s’élève à une hauteur spécifique, c’est ce

qui permet de l’identifier par comparaison avec l’élévation d’une espèce témoin.
1. Introduire l’éluant jusqu’à une hauteur d’environ 0,5 cm dans la
cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d’éluant vont
alors saturer la cuve.

2. Si les composés à analyser sont sous forme solide, les

dissoudre dans un minimum de
solvant.

3. Préparation de la plaque :
a) à environ 1 cm du bas de la plaque, tracer délicatement une
ligne au crayon à papier ;
b) indiquer sur cette ligne les positions des dépôts que vous allez
effectuer ;
c) effectuer les dépôts souhaités à l’aide de capillaires :

• plonger une extrémité du capillaire dans la solution : quelques

millimètres de solution entrent dans le capillaire,
• sur la position choisie, poser verticalement, très peu de temps
mais plusieurs fois, l’extrémité du capillaire (l’objectif est d’avoir
un dépôt très concentré et peu étalé).
 Identification

À la fin de la CCM, chaque espèce chimique s’est

élevée à une hauteur qui lui est propre. Si on observe
deux taches situées à la même hauteur, il s’agit de la
même substance.

❯ Rapport frontal
Calcul du rapport frontal : Rf​=Hh​

 Exemple :
• Plusieurs taches obtenues à partir du dépôt B : il s’agit
donc d’un mélange.
• La première tache du dépôt B est située à la même
hauteur que la tache témoin donc la substance B
contient l’espèce témoin T.
Section 3 : Technique chromatographique
 1. Chromatographie en phase liquide

On dispose d'un grand nombre de modes de chromatographie.

Certains ont un champ d'application très large, d'autres au contraire correspondent
à des applications très spécialisées.
On distinguera dans ce qui suit :

1 - chromatographie d'adsorption

2 - chromatographie de partage
3 - chromatographie d'échange d'ions (+ chromatographie ionique)
4 - chromatographie de paires d'ions
5 - chromatographie d'exclusion (séparation selon la taille)
6 - chromatographie d'affinité
1 - chromatographie d'adsorption
C'est la première chromatographie réalisée :
séparation des pigments végétaux par adsorption sur de la craie
(Tswett 1906).

Définition : 
Ce mode de chromatographie met en jeu un mécanisme
d'adsorption du soluté sur la phase stationnaire solide et
un mécanisme d'élution (désorption) par la phase mobile liquide
ou gazeuse (éluant).
Principe :

- L'adsorption est la fixation plus ou moins énergique d'un gaz, d'un

liquide ou d'un soluté sur une surface solide; elle met en jeu des
liaisons à faible énergie (liaisons hydrogène, interactions
électrostatiques...). Pour être utilisable à des fins séparatives,
l'adsorption doit être réversible.

- L'élution ou désorption consiste à extraire le soluté adsorbé à

l'aide d'un solvant appelé éluant.
Les différents solutés sont plus ou moins adsorbés sur la phase stationnaire,
et plus ou moins solubles dans la phase mobile; il en résulte une migration
différentielle des solutés en fonction de la résultante entre les deux forces
(de rétention et d'entraînement) et donc une séparation de ces solutés.
Le schéma ci-après résume les interactions entre le soluté, le solide
adsorbant et l'éluant :
Adsorbants :
- Les adsorbants doivent être insolubles dans le solvant et chimiquement inertes vis-à-vis du
solvant et des solutés.
- Leur granulométrie varie entre 5 et 100 µm et leur surface spécifique de 50 à 1000 m2/g,

- L'activité d'un adsorbant dépend de sa nature et de sa teneur en eau.

- N. B. Dans certains cas, on cherche à diminuer l'activité adsorbante, et on fait au contraire une
désactivation.
-La capacité d'adsorption peut être :
- faible (carbonate de calcium...)
- forte (silice, alumine, charbon ...)

-La polarité peut être
- faible (charbon...)

- forte (silice SiO2, utilisée sous forme hydratée : gel de silice, qui présente des fonctions "silanol" : Si-OH ,

alumine Al2O3, n H2O...)

Solvants :On utilise généralement des mélanges de solvants, de polarité voisine de celle des solutés
à séparer (ceux-ci doivent être solubles dans l'éluant !). On classe les différents solvants selon leur
"force éluante" qui traduit leur polarité:
Série éluotrope sur alumine de quelques solvants, classés par
ordre de polarité croissante :
Selon la nature des composés à séparer, on choisit des solvants de force éluante ( ) appropriée.
o

C'est rarement un solvant pur, mais en fait un mélange de 2 à 4 solvants, optimisé par tests

successifs vis-à-vis des composés étudiés, sans que cela obéisse à des règles permettant de

prédire les résultats.

Des abaques permettent de calculer la force éluante d'un mélange binaire :

Dans les mélanges contenant plus de deux solvants, les derniers sont présents dans de très
faibles proportions (< 2%) et correspondent à des solvants de forte polarité (eau, acide) destinés
à améliorer la symétrie des pics.
Le choix du solvant doit obéir à certaines
contraintes :

- miscibilité des composantes élémentaires

- compatibilité avec le système de détection ("cut-off" en UV)*

* N.B. Cette contrainte n'existe pas avec la chromatographie sur couche mince,
pour laquelle le choix des solvants est donc plus étendu.
Applications :

La chromatographie d'adsorption est utilisée pour séparer des molécules organiques de masse molaire 100 à

1000 g/mol et de polarité moyenne;

-les molécules apolaires sont pas ou peu retenues, et sont éluées les premières (= elles migrent au front en CCM).

-Les molécules trop polaires risquent d'être adsorbées de façon irréversible, et ne sont donc pas éluées (= elles resteraient sur la

ligne de dépôt en CCM).

Exemples :
- lipides : stérols et stéroïdes, caroténoïdes, phospholipides...
- pigments, médicaments...
- oses et oligosides, acides aminés et oligopeptides
L'utilisation de ce mode de chromatographie est assez large, en raison de sa facilité d'emploi et du fait que la
transposition depuis la chromatographie sur couche mince est très aisée.
2 - chromatographie de partage
La chromatographie de partage
La chromatographie de partage (ou chromatographie liquide-liquide) met en
jeu un mécanisme de partition entre solvants que constituent
respectivement par la phase stationnaire et la phase mobile. La phase
stationnaire peut être constituée par un film liquide (non miscible avec la phase
mobile bien sûr) imprégné sur un support rigide (silice) ou fixé par liaison
covalente (phases greffées). C'est ce second type qui est utilisé actuellement.
Le greffage est réalisé par établissement de ponts siloxane (Si-O-Si) :

Selon la nature des radicaux R, on distinguera :

- les phases greffées polaires (-diol, -cyanopropyl, aminopropyl,…)
- les phases greffées apolaires (-alkyl, -phényl, …)
 Les premières sont utilisées avec des solvants peu polaires (cf adsorption)
et permettent de réaliser de la chromatograhie en phase
normale ou directe.

 Les secondes s'emploient avec des solvants polaires et l'on a alors de la

chromatographie en phase inverse ou réverse.
En première approximation, l'ordre d'élution des composés est inversé entre
les deux modes, les composés polaires étant élués en premier dans les
systèmes en phase réverse.
LES PHASES GREFFEES POLAIRES
 Elles s'utilisent comme les colonnes de silice précédentes. La présence de
fonctions particulières sur le greffage (-CN, -NH2,…) peut apporter une
sélectivité intéressante.

 De plus, il est possible de travailler avec un gradient de force éluante, donc

d'analyser en une seule fois des mélanges contenant des composés de
polarités très différentes.

 Il n'y a pas de phénomènes d'adsorption irréversible et on peut rincer les

colonnes avec des solvants très éluants comme du méthanol pur.
LES PHASES GREFFEES APOLAIRES

 Ce sont les supports les plus couramment utilisés, principalement avec

un greffage alkyl (octadécylsilane ou -ODS ou -C18).

 Dans ces systèmes, le solvant le plus polaire (l'eau) est le moins éluant
et la force éluante de la phase mobile est augmentée par ajout d'un
solvant organique (méthanol, acétonitrile).

 La phase stationnaire (type de greffage, taux de greffage, porosité) et la

phase mobile (type de solvant organique, pH, température,…)
concourent toutes deux à la sélectivité de l'ensemble et les possibilités
sont innombrables, ce qui explique la popularité de ce mode
chromatographique.
Le contrôle de pH permet de faire varier à volonté le k' des composés
ionisables.
Il convient dans le cas de greffage sur silice de rester dans des
limites compatibles avec la non-dissolution de la colonne ( 2 < pH <8
).
Il existe par ailleurs des phases greffées sur des résines polymérisées
qui n'ont pas cet inconvénient et permettent de travailler dans une
gamme de pH bien plus large (1-13).
Certains greffages comme le greffage -CN ont des propriétés hybrides
qui permettent de les utiliser aussi bien en phase directe qu'en phase
inverse.
 3-La chromatographie d'échange d'ions
 
Dans la chromatographie d'échange d'ions, la phase stationnaire comporte des
groupements ionisés (+ ou -) fixes; des ions mobiles de charge opposée
assurent l'électroneutralité.
Les ions retenus au voisinage des charges fixes sont échangeables avec les
ions présents dans la phase mobile.
La séparation est basée sur cette propriété d'échange d'ions et ne peut donc
s'appliquer qu'à des solutés ionisables.

Les échangeurs d'ions :

Nature :
La phase stationnaire est constituée d'un support insoluble dans l'eau, sur
lequel sont greffés des groupements fonctionnels ionisables.
-Les supports peuvent être :

• minéraux : silice
• organiques : résine polystyrénique, cellulose, dextrane

-Les groupements fonctionnels sont fixés par des liaisons covalentes sur

la matrice; ils sont de deux types :

• les échangeurs de cations portent des groupements chargés (-)

• les échangeurs d'anions portent des groupements chargés (+)
 Les échangeurs forts sont ionisés quel que soit le pH, alors que les
carboxylates ne le sont qu'à pH > 3 et les amines tertiaires ne sont
protonées qu'à pH acide.

 On utilise les échangeurs d'anions forts pour séparer des acides faibles
(ex acides carboxyliques) et les échangeurs faibles pour séparer des
acides forts (ex esters phosphate).

 Le même type de raisonnement s'applique aux échangeurs de cations.

La nature de l'ion échangeable est variable : par exemple une résine
cationique peut être utilisée sous forme acide (liée à H +) ou sous forme
sodique (liée à Na+); il faut donc conditionner la résine sous la forme
ionique adéquate avant son utilisation, et la régénérer après usage.
Caractéristiques :
-Porosité : 
le support est un polymère plus ou moins réticulé ; la porosité
dépend du taux de pontage : un polymère très réticulé a des pores de
petite taille et convient pour des petites molécules.

-Granulométrie : le support est commercialisé sous forme de grains de

diamètre variant de 30 à 800 µm (chromatographie basse pression)
Celui des colonnes HPLC a une granulométrie de 5-10 µm (supports
totalement poreux) ou légèrement supérieure (supports pelliculaires, en
couche de 1 µm sur des billes de verre).
Les échanges sont d'autant plus rapides et efficaces que les grains sont
petits.

-Capacité de rétention : c'est la quantité maximale d'ions que peut

fixer l'échangeur d'ions, exprimée en mEq/g de poids sec ou en mEq/ml
de poids humide. Elle dépend de la densité du support en groupements
fonctionnels et il faut en tenir compte pour ne pas trop charger une
colonne.
*milliéquivalent = poids de la formule = poids atomique ou moléculaire.
L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs
facteurs:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :

- de leur nature (pKa)

- du pH de la solution

• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:

- de la charge de cet ion c'est-à-dire :

- de la nature de l'ion (pKa, pHi)

- du pH de la solution

- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est chargé, ou/et qu'il est petit)

• de la concentration des ions

• de l'accessibilité des groupements fonctionnels ( cf : porosité et granulométrie)

La constante de sélectivité est donnée par la relation :
 Les éluants sont des solutions aqueuses qui contiennent des ions
échangeables avec les
solutés fixés sur l'échangeur :

-solutions contenant un ion de densité de charge plus élevée et (ou) de

concentration plus élevée.

-solutions d'un pH tel qu'il modifie la charge des ions fixés et (ou) des
groupements fonctionnels et provoque leur libération dans l'éluat.

 On peut éluer avec une solution de composition constante (conditions

isocratiques) ou avec un gradient de pH et (ou) de force ionique, pour
décrocher successivement les différents ions fixés sur l'échangeur.
Applications : 

La chromatographie d'échange d'ions est utilisée pour séparer des molécules

ionisables, quelle que soit leur taille : ions minéraux, acides aminés, peptides,

protéines, nucléotides, acides nucléiques, glucides ionisés et lipides ionisés.

4. La chromatographie d'exclusion
 La chromatographie d'exclusion est aussi appelée FILTRATION SUR
GEL ou TAMISAGE MOLECULAIRE.
 Cette technique est apparue en 1959 avec un produit nouveau : le
Sephadex.
 Le Sephadex est un gel de dextrane (polymère de glucose a-1-6
produit par Leuconostoc mesenteroïdes), auquel on fait subir une
réticulation.
 Il se présente sous forme de billes poreuses, dont la porosité dépend du
degré de réticulation.
 Ces billes sont très hydrophiles et gonflent dans l'eau.
Il en existe différents types en fonction de la taille des billes et de leur
porosité.
 Principe de la chromatographie d'exclusion :
1 : Dépôt d'un mélange de deux molécules (des grosses
et des petites) sur une colonne remplie
d'un gel de Sephadex.
2 : Les petites molécules peuvent pénétrer dans les billes
de Sephadex car leur diamètre est inférieur à celui des
pores du gel.
Les grosses molécules ne le peuvent pas en raison de
leur grande taille; elles sont donc exclues du gel (d'où le
nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molécules ont donc un trajet
plus court à parcourir pour arriver en bas de
la colonne; elles sont donc éluées les
premières.
4 : Les petites molécules sont éluées
ensuite car elles ont une plus grande
distance à parcourir pour arriver en bas de
la colonne.
D'une façon plus générale :

-Les molécules de taille supérieure à celle des pores des billes de

Sephadex sont totalement exclues du gel et ne se répartissent que dans le
volume extérieur aux billes, c'est-à-dire dans la phase mobile (éluant). Elles
sortent les premières, à un volume d'élution Vo appelé volume mort de la
colonne.

-Les molécules de taille inférieure à celle des pores des billes de

Sephadex peuvent pénétrer librement dans les billes et se répartissent dans
l'ensemble des liquides de la colonne (volume de liquide à l'intérieur des billes
ou phase stationnaire + volume de liquide à l'extérieur des billes ou phase
mobile). Elles sortent donc les dernières, à un volume d'élution Vt ou volume
total des liquides de la colonne.

-Les molécules de taille intermédiaire pénètrent un peu dans les billes, en

fonction de leur taille et de leur forme; elles pénètrent d'autant moins qu'elles
sont plus grosses, et elles sont éluées dans l'ordre des masses molaires
décroissantes.
Applications de la chromatographie d'exclusion :
-Cette technique est très utilisée pour la séparation ou l'élimination de sels ou
de petites molécules dans les solutions protéiques : DESSALAGE, ECHANGE
de TAMPONS ...
-Cette technique est également appliquée au FRACTIONNEMENT de
MELANGES de MACROMOLECULES et à la DETERMINATION
(approximative) de la MASSE MOLAIRE des protéines. 

Dans ce dernier cas, il faut d'abord étalonner la colonne avec des protéines de
masse molaire connue, tracer la courbe Ve = f(logM), puis effectuer une
détermination graphique.
 Ce qui précède concernant le Sephadex est en fait très général et
s'applique à de nombreux supports, en particulier des supports à base
de silice ou de polymères organiques rigides, qui permettent l'utilisation
de ces supports en HPLC (ce n'est pas le cas du Sephadex).

 Ces colonnes, le plus souvent de taille réduite par rapport aux

précédentes, mais également plus résolutives et donnant des
séparations plus rapides (car autorisant l'emploi de débits linéaires
beaucoup plus élevés) sont utilisées à des fins analytiques :

- avec des phase mobiles aqueuses pour les macromolécules biologiques

(essentiellement protéines) et avec des phases stationnaires conçues pour
minimiser les phénomènes d'adsorption et de dénaturation.
- avec des phases mobiles organiques pour l'analyse des polymères en
chimie organique (ex polystyrènes).
5. La chromatographie d'affinité
 Ce mode de chromatographie connaît depuis 1970 un
développement sans précédent et est appelé à prendre une place
encore plus grande avec l'essor des biotechnologies.

 Le principe consiste à utiliser une phase stationnaire constituée d'un

support (silice, polymère) sur lequel on a greffé une molécule
organique particulière qui présente une affinité sélective pour
certains constituants d'un mélange dont on cherche à les isoler.

 Ceux-ci vont être sélectivement adsorbés ou tout au moins retenus

sur la colonne, tandis que les autres composants sont très
rapidement élués. Un changement de la phase mobile (pH, force
ionique ou ajout d'un compétiteur) permet ensuite d'éluer les
substances intéressantes, avec un facteur de purification pouvant
atteindre 1000.

 La chromatographie d'affinité s'utilise avec des colonnes basse

pression ou des supports à haute performance (HPLC).
 Techniques en basse pression :

- isolement des ARNm polyA+ sur colonne d'oligodT- ou polyU- sepharose

à partir d'un extrait d'ARN total (les ARNm représentent 1% du total)

- purification de récepteurs hormonaux avec des colonnes sur lesquelles

on a fixé des molécules d'hormones à un degré de spécificité très

inférieur, les colonnes sur lesquelles sont greffées des ions boronate ont

une affinité pour les diols cis et permettent de fixer entre autres les sucres.
 Techniques en haute pression (à titre d'exemple) On donnera ici
comme exemple le choix offert par un fabricant (Pierce Eurochemie) :
III. Chromatographie en phase gazeuse
 1. DESCRIPTION  DE L'APPAREILLAGE

Schéma simplifié du chromatographe en phase gazeuse

2- PHASES STATIONNAIRES

Les phases les plus répandues sont les polymères siliconés dérivés du diméthyl polysiloxane

phase stationnaire dérivée du diméthyl polysiloxane.

 Cette phase est greffée sur la colonne en silice par l'intermédiaire une liaison
-O-Si-O-.
 Suivant le pourcentage de groupement R par rapport aux groupes CH3, on peut
modifier la polarité de la colonne et donc ses propriétés en chromatographie
 Si R= CH3 , la colonne est complétement apolaire et sépare les produits suivant leur
point d'ébullition (noms commerciaux : DB-1, OV101, SE-30...)
 Si le % de R= Phényle est égal à 5%, on a la colonne la plus utilisée en CPG,  elle
est répertoriée sous les noms commerciaux suivants: DB5, CPsil5, OV5...
 Si on incorpore un substituant cyanopropyle (R=-CH2-CH2-CH2-CN) la polarité
augmente beaucoup (à cause du fort moment dipolaire du groupe -CN).
 Ces phases à base de silicone présentent deux avantages pour la CPG :
1- une bonne inertie chimique, elles ne réagissent ni avec les phases stationnaires, ni avec les produits
injectés.
2- une très bonne tenue à la température, elles peuvent être chauffées sans dommage jusqu'à 300°C

Il existent d'autres phases beaucoup plus polaires à base de polyethylène glycol.

HO-(-CH2-CH2-O-)n-O-(Silice)

Elles sont greffées sur les parois en silice de la colonne par l'intermédiaire d'une liaison Si-O-C
Les dénominations commerciales de ces phases sont: Carbowax, DB-wax, CP wax 52.
Ces phases sont utilisables entre 20° et 250°C, elles sont moins inertes que les phases siliconées, elles sont
en particulier très sensibles à l'oxygène.
La chromatographie en phase gazeuse
(CPG)
1.    Introduction
 La chromatographie en phase gazeuse (CPG) (gas chromatography, GC, en anglais) est une
technique de séparation d’un mélange de molécules volatiles, appelées ici « analytes ».

 Cette technique a été développée par A.J.P MARTIN et R.L.M. SYNGE, récipiendaires du
Prix Nobel de chimie 1952 pour l’invention de la chromatographie de partage.

 Elle est utilisée dans des domaines très variés, tels que la parfumerie, l’œnologie, l’industrie
pétrolière, la biologie, la chimie fine et l’industrie des matières plastiques.
2.    Principe physico-chimique

 La CPG repose sur l’équilibre de partage des analytes entre une phase stationnaire et
une phase mobile gazeuse.
 La séparation des analytes repose sur la différence d’affinité de ces composés pour la
phase mobile et pour la phase stationnaire.
 Le mélange à analyser est vaporisé puis transporté à travers une colonne renfermant
une substance liquide ou solide qui constitue la phase stationnaire.
 Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé « gaz vecteur », qui constitue la
phase mobile.
 Le partage est un équilibre dynamique entre l’analyte A dans la phase stationnaire A(phase

stationnaire)  et le même analyte dans la phase mobile A(phase mobile) :

 
A(phase stationnaire) ⇄ A(phase mobile).

 Le coefficient de partage K est la constante d’équilibre associée à cet équilibre.

 Plus la molécule a d’affinité pour la phase stationnaire, moins elle est entraînée par le gaz
vecteur et donc plus elle est retenue sur la colonne.

Ainsi, sur colonne polaire, les analytes apolaires sortent en premier, alors que sur colonne
apolaire, les analytes polaires sortent en premier.
 Par ailleurs, plus la température est haute, plus on déplace l’équilibre de partage vers A(phase

mobile) , et donc plus l’analyte A est entraîné par le gaz vecteur.

 Si les analytes d’un échantillon ont des coefficients de partage différents, alors, tous les
autres paramètres étant identiques (débit du gaz vecteur, température), leurs durées de
parcours dans la colonne seront différentes.

 Ainsi, les analytes se séparent puis sortent de la colonne les uns après les autres. La durée
entre la date d’injection et celle de sortie de colonne d’un analyte A est son « temps de
rétention ».
L’analyse conduit à l’obtention d’un chromatogramme, dont un exemple est donné ci-
dessous :

Chaque analyte du mélange d’alcanes est

caractérisé par un temps de rétention bien
précis.
Ici, la séparation des analytes du mélange a
été effectuée de façon optimale.
Chromatogramme d’un mélange d’alcanes (© Sigma-Aldrich)
3.    Appareillage

 L’appareil utilisé pour réaliser une analyse par chromatographie en phase vapeur est appelé
chromatographe.

 Il comporte plusieurs éléments, comme indiqué sur le schéma ci-dessous :

Schéma d’un chromatographe

3.1.    Le gaz vecteur (phase mobile)

 Le gaz vecteur est le gaz qui circule à l’intérieur du chromatographe, entraînant les analytes à
travers la colonne, depuis l’injecteur jusqu’au détecteur.
 Son choix dépend du type de détecteur utilisé ; cela peut être par exemple de l’hélium, de
l’azote, de l’argon ou de l’hydrogène.
 Le débit de ce gaz vecteur est de l’ordre de 30 à 40 mL/min pour les colonnes remplies et de
0,2 à 2 mL/min pour les colonnes capillaires.
 Le débit du gaz vecteur influe sur le pouvoir de résolution du chromatographe.
 Deux phénomènes, la diffusion longitudinale et la résistance au transfert de masse entre les
phases mobile et stationnaire, ont des effets opposés sur le pouvoir de résolution de la colonne.
 L’opérateur choisit donc une valeur du débit afin d’optimiser le pouvoir de résolution du
chromatographe.
La phase mobile est un gaz de faible viscosité, trois gaz sont  exclusivement employés, l'azote,
l'hydrogène et l'hélium.

Courbes de Van Deemter pour l'azote, l'hélium et

l'hydrogène
H = f(u) de la figure précédente montre que la vitesse optimale de l'hydrogène est plus de 3 fois
plus grande que celle de l'azote.

Les analyses employant l'hydrogène pourront donc être effectuées 3 fois plus rapidement que
celles utilisant l'azote (à efficacité constante).

Malheureusement l'hydrogène est un gaz dangereux présentant des risques d'explosion.

Pour ces raisons de sécurité, c'est l'hélium qui en général utilisé.

3.2.    Le système d’injection

 Ce système permet à la fois l’introduction de l’échantillon dans la colonne du chromatographe,

ainsi que la volatilisation des analytes.

 La température de l’injecteur doit être réglée de manière à entraîner la vaporisation de tous les

analytes de l’échantillon : elle est généralement maintenue à 50 °C au-dessus de la température

d’ébullition de l’analyte le moins volatil.

 L’introduction se fait à l’aide d’une microseringue (le volume à injecter est généralement voisin

de 1 µL) à travers un septum (qui assure l’étanchéité) dans un liner (typiquement un tube de

verre rempli d’un petit morceau de coton).

Schéma d’un injecteur

 Si l’échantillon contient des espèces non-volatiles, celles-ci sont retenues sur le coton et donc

non-injectées dans la colonne, ce qui permet de la protéger.

 Les espèces volatiles sont vaporisées et entraînées par le gaz vecteur vers la tête de la colonne.
3.3.    La colonne (phase stationnaire)

 Il existe deux types de colonnes : les colonnes remplies et les colonnes capillaires.

 Les colonnes remplies sont un diamètre de quelques millimètres et une longueur de l’ordre du
mètre.
 Elles sont remplies de granules de support inerte, généralement de la silice, dont la surface est
imprégnée ou greffée avec la phase stationnaire.
 Elles sont aujourd’hui supplantées par les colonnes capillaires, dont le pouvoir de résolution
est bien supérieur.
 Schéma (en coupe) d’une colonne remplie (à gauche) et d’une colonne capillaire (à droite)

 Les colonnes capillaires sont de simples tubes d’acier inoxydable, de verre ou de silice fondue
(matériau inerte vis-à-vis de la phase stationnaire et des échantillons) de diamètre intérieur compris
entre 0,1 et 0,5 mm, et d’une longueur typique de plusieurs dizaines de mètres, pouvant aller jusqu’à
100 m.
 Pour tenir dans l’appareil, la colonne est enroulée, avec des spirales ayant 10 à 30 cm de diamètre.
 La surface interne de ce tube est recouverte d’un film de 0,1 à 5 µm d’épaisseur constitué de la
phase stationnaire.
 Ce film est mis en place par greffage ou simple déposition, le greffage étant généralement préféré
pour des raisons de stabilité thermique.
  

Chromatogrammes de l'huile "d'iris des marais" obtenus (en haut) sur une colonne capillaire de 50 m et (en bas) sur une colonne remplie de 4m.

Comme le montre la figure ci-après le pouvoir de séparation des colonnes capillaires (N=100000)  est beaucoup plus grand que
celui des colonnes remplies (N=4000).
 Calcul du rapport de phase b  des colonnes capillaires

correspond au rapport du volume de la phase mobile sur la

phase stationnaire. Il apparait dans la formule

Le volume de la phase mobile est égal à Vpm = 2pr2L (où L est la longueur de la colonne)

Le volume de la phase stationnaire est égal au volume de la couronne d'épaisseur e soit Vps = 2prLe .
 (1) (2)

(3)

D'après l'eq. 1-2, on peut déduire que le temps d'analyse (tr) augmente si :
- le diamètre intérieur de la colonne capillaire (d) diminue
- l'épaisseur du film de phase stationnaire (e) augmente.
En outre s'il n'y a aucune affinité entre un produit et la phase stationnaire soit K=0, on a tr = tm , ce qui
est le cas de l'air ou en première approximation du méthane.

On peut déduire que :

 - pour bien analyser une substance volatile, il faut augmenter k', donc diminuer le diamètre (d) de la
colonne et (ou) augmenter l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
 - pour bien analyser une substance peu volatile, il faut diminuer k', donc augmenter le diamètre (d) de la
colonne et (ou) diminuer l'épaisseur du film de phase stationnaire (e).
3.4.    Le four

 La colonne est contenue dans un four de type chaleur tournante, dont la température est
précisément ajustable (typiquement entre 20 °C et 350 °C) et programmable.

 Les températures utilisables en pratique dépendent des domaines de stabilité en

température de la colonne utilisée, et de ceux des composés analysés.

 Plus la température du four (et donc de la colonne) est élevée, plus les analytes se
déplacent rapidement dans la colonne, mais moins ils interagissent avec la phase
stationnaire, et donc moins les analytes sont séparés.

 Plus la température du four est basse, meilleure est la séparation des analytes mais plus
longue est l’analyse.
Le choix de la température est donc un compromis entre la durée de l’analyse et le niveau de
séparation désiré.
 Une méthode pour laquelle la température est gardée constante tout au long de l’analyse

est appelée « isotherme ».

 A l’inverse, on peut choisir d’augmenter la température du four au cours de l’analyse :

cette méthode est appelée « gradient ».

 D’une manière générale, une méthode isotherme tend à donner des pics larges pour les

espèces les plus retenues, et donc une moins bonne séparation.

 Ce phénomène est partiellement dû à la diffusion : plus une espèce chimique circule

longuement dans la colonne, plus elle a le temps de diffuser, élargissant ainsi le pic, et

donc diminuant la hauteur des pics par la même occasion.

Chromatogrammes d’un même échantillon
réalisés dans différentes conditions :

(a) avec une méthode isotherme à 45 °C ;

(b) avec une méthode isotherme à 145 °C ;

(c) avec une méthode utilisant un gradient de

température de 30 °C à 180 °C sur 30 minutes.
 APPLICATION
L’analyse CPG des arômes contenus dans une barre chocolatée se fait dans les
conditions suivantes :
  4g "peppermint/chocolate cookie bar "Prélèvement par espace de tête
Colonne CPG: PTE-5; 30m x 0,25mm ID;  0,25µm film
Four: 60°C (1 min) jusqu’à 230°C à 10°C/min
phase mobile: helium, 35cm/sec
Det.: FID, 250°C
Inj.: splitless (split fermé 3 min), 250°C
  Questions
1- Calculer le temps mort de cette analyse
2- Calculer le rapport de phase de la colonne
3- Le menthol sortant à 7,80 mn, calculer sa constante de partition K dans cette
analyse.
Solution
1- le temps mort
tm = L/u = 3000/35 = 85,71 sec = 1,43 mn.

2-  le rapport de phase

b =  d/4e = 0,25/4*0,25*10-3 = 250

3- constante de partition K
K = k’* b = [(tr-tm)/tm]*b = 1113 (donc très supérieur à 1)   et DG° = -RTln(K) est <0,
car le processus de dissolution du soluté dans la phase mobile est spontané.
Les principales caractéristiques des deux méthodes sont rassemblées dans le tableau ci-dessous :
3.5.    Le détecteur

 En sortie de colonne, les analytes rencontrent le détecteur, aujourd’hui généralement couplé

à un enregistreur numérique du signal qui permet son traitement.
 Cet élément mesure en continu une grandeur proportionnelle à la quantité des différents
analytes. Il en existe de nombreux modèles, dont

o Le FID (en anglais flame ionisation detector, en français détecteur à ionisation de flamme),

o Le TCD (en anglais thermal conductivity detector, en français détecteur à conductivité thermique),
ou catharomètre
o Le MS (en anglais mass spectrometer, en français spectromètre de masse),
 •Le FID
La sortie de colonne traverse une flamme maintenue à une tension d’une centaine de volts. La
pyrolyse ionise les composants, provoquant l’apparition d’un courant électrique entre les
électrodes, ensuite amplifié. Typiquement utilisé avec les gaz vecteurs azote, hélium et
hydrogène

•Le TCD
La sortie de colonne arrive sur l’une des résistances d’un pont de Wheatstone ; le passage de
composants fait varier la tension aux bornes du pont. Typiquement utilisé avec les gaz vecteurs
hélium et hydrogène [5].

•Le MS provoque l’ionisation des molécules organiques éluées et analyse ces ions.
Ce couplage GC–MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) permet, au-delà de la simple
détection de présence d’espèces chimiques, d’avoir des informations concernant lesdits composants.
Typiquement utilisé avec les gaz vecteurs azote, hélium et hydrogène 
TD

Exercice 1 : 
 
On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse
moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) :

1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve – Que remarquez-vous?

2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent.

Existe-t-il une autre méthode pour déterminer la MM ?

Chromatographie
en
phase supercritique
 C'est une méthode d'introduction récente, que l'on peut considérer
comme intermédiaire entre la GC et la LC.

 Dans ce mode de chromatographie, la phase mobile est un fluide

"supercritique" qui correspond à un état très particulier que l'on peut
assimiler à un liquide compressible de très faible viscosité.

 Il est obtenu en comprimant à basse température et à très haute

pression (grâce à une pompe de HPLC dont les têtes sont
réfrigérées) un gaz comme le CO2.
Il en résulte un solvant éventuellement modifiable par quelques
% de méthanol, qui sert de phase mobile pour une
chromatographie qui peut s'effectuer aussi bien sur une colonne
de HPLC en acier que sur une colonne capillaire de GLC.

La faible viscosité du solvant autorise des débits élevés qui ne

nuisent pas à l'efficacité des séparations qui sont effectuées en
quelques minutes à quelques dizaines de minutes.
Le système :
 Le système permet l'emploi de très nombreux types de détecteurs, aussi
bien ceux de la GLC (ex. ionisation de flamme) ou de la HPLC (UV,
spectro).
 Les couplages avec la spectrométrie de masse ou la spectrométrie
infrarouge sont également possibles, ce qui offre là des possibilités très
intéressantes.

N.B. Les fluides supercritiques sont également utilisés pour l'extraction de

substances biologiques à partir d'échantillons bruts (ex. poudre de végétal
pour extraire des substances à intérêt pharmacologique - ou procédé de
préparation du café décaféiné).
CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE
PERFORMANCE (HPLC)
 un fluide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne.

 Cette colonne peut contenir des "granulés" poreux (colonne remplie) ou être

recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire).

 Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire.

 A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se

dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne.

 Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés

généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la

colonne.
De ce phénomène appelé rétention, il résulte que les constituants du mélange

injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses

de déplacement sont différentes.

Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les

autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne

couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé

appelé chromatogramme.

En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant

appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ;

au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le

temps à l'enregistrement d'un pic.

 Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention"

(temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté),

caractérise qualitativement une substance.

 L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation

de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans

le mélange injecté.
Appareillage:
Les organes

a) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité

suffisante.
Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont disponibles
pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à
des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse.
b) La pompe :

elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une

programmation de la nature du solvant.

Elle permet de travailler:

- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de

l'analyse.

- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des

constituants du mélange d'éluants.

Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques µl à plusieurs ml/min

c) Vanne d'injection :

c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage.

Il existe des boucles de différents volumes, nous utiliserons une boucle de

20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la

colonne et de la concentration supposée des produits à analyser.

Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté

constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

d) La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux

produits chimiques, souvent en inox ou en verre.

Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des

longueurs généralement de 15 à 30 crn.

Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide

beaucoup trop élevées.

e) La phase stationnaire

La phase normale
La phase inverse

- La phase normale:

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il
faut donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les
produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires
qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps
du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.
- La phase inverse :

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes
linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et
nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H20). Dans ce cas, ce sont les
composés polaires qui seront élués en premier.

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire

au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante.
- La phase mobile : L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase
stationnaire normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention
des solutés.
La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :

 si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;

 si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire
( le plus souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la
chromatographie en phase inverse.
En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des
composés.
Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité.

Avec une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué

avec les phase normales.

Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite qu'un composé

apolaire.

Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement retenus. On réalise des

gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la polarité de l'éluant

(ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en acétonitrile va en

croissant au cours de l'élution).

On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase
mobile.
f) Détecteurs

Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés

• détecteur UV-visible (celui que nous utilisons) : il mesure l'absorption de la lumière

par le produit à la sortie de la colonne. E opère à longueur d'onde constante, celle-ci

ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisé pour des longueurs

d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisé à la

longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit

utilisable, il faut que :

- le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à

l'appareil, et que son coefficient d'absorption ε soit suffisamment grand ;

- la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.
• réfractomètre : il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie

de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la

température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure :

il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les

variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler

qu'en mode isocratique avec ce détecteur.

Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur ou d'une -station

d'acquisition.
1) Analyse des chromatogrammes
Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics
correspondant à chacun des produits.

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible. La composition de la phase

mobile est un paramètre particulier à la HPLC. Il faut donc préciser pour chaque analyse :
- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…
- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, débit, mode
de détection λ en nm.
- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité du
détecteur, etc…
2) Analyse qualitative
Le temps de rétention (tR en min) est une

caractéristique de chaque soluté dans les

conditions opératoires fixées.

On peut comparer le tR de deux solutés en

définissant :

- le facteur de sélectivité α entre les deux solutés :

- l’efficacité d'une colonne qui est mesure en

nombre de plateau théorique : Nombre de

molécule sortant de la colonne en fonction du

temps
HEPT = L/n (L = hauteur de colonne, n nombre de plateaux théoriques)
Résolution de la colonne pour la séparation de deux solutés bien déterminés.
R>1 bonne séparation R
R<1 mauvaise séparation ⇒ donc les paramètres appliqués à la colonne ne sont
pas les bons.
3) Analyse quantitative
Cette analyse est basée sur le fait que l'aire des pics chromatographiques est
proportionnelle à la concentration ou à la quantité de produit analysé.

 Il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante

du produit afin de faire une courbe d'étalonnage
Aire = f(masse ou concentration du produit), pour un
volume injecté constant V.

 L'injection ultérieure du même volume V de

l'échantillon à doser permet, à l'aide de la mesure de
l'aire du pic reportée sur la courbe d'étalonnage, de
connaître la masse ou la concentration recherchée.

 Cette méthode est plus précise que celle qui consiste

à ne faire qu'une mesure avec l'étalon et à utiliser une
règle de trois :
 Méthode des ajouts :

Comme la précédente, cette méthode nécessite de posséder le produit à analyser pur;

après avoir analysé l'échantillon, on ajoute à celui-ci des quantité connues ∆m du
produit avant de le chromatographier à nouveau ( faire au minimum deux ajouts), ce qui
entraîne une variation de l'aire du pic ∆A.

Si m est la masse contenue dans l'échantillon à analyser,

Méthode de l'étalon interne (utilisée essentiellement en CPG) :

 On compare la réponse du ou des produits à analyser à celle d'un étalon interne, donc
introduit dans le mélange à doser et convenablement choisi.
 Une solution étalon est préparée avec le ou les produits que l'on veut doser.
Les masses sont connues m’1 , m’2, et … me pur l'étalon ; à ces masses correspondent
les aires A’1 , A’2, …, A'e , sur le chromatogramme.
 DIFFÉRENCES ENTRE

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
ET

CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE
 La HPLC est la chromatographie liquide à haute performance tandis que la GC est la
chromatographie en phase gazeuse.

 La principale différence entre HPLC et GC est que la HPLC utilise une phase
stationnaire solide et une phase mobile liquide tandis que la GC utilise une phase
stationnaire liquide et une phase mobile gazeuse.

 De plus, une autre différence entre la HPLC et la GC est que la HPLC et la plupart
des autres techniques chromatographiques ne nécessitent pas de stratégies de
contrôle de la température alors que, la GC a besoin que sa colonne soit située à
l'intérieur d'un four pour garder la phase mobile gazeuse telle qu'elle est.

 En dehors de cela, nous pouvons souligner une différence entre HPLC et GC en

fonction de leur application. La HPLC est une technique utile pour la séparation des
fluides tandis que la GC est utile pour séparer les composants dans des mélanges
gazeux.
Les différences principales entre la chromatographie liquide et la chromatographie
gazeuse sont tabulées ci-dessous.
Deux espèces chimiques, A et B sont séparées par chromatographie gazeuse
isotherme, à l’aide d’une colonne de 2,00 m ayant 5000 plateaux théoriques
au débit de 15,0 ml/min.
Le pic de l’air non absorbé apparaît au bout de 30 s ; le pic de A apparaît au
bout de 5 min et celui de B au bout de 12 min.

(a) Calculer le volume mort VM de la colonne, et les volumes de rétention VA et VB ?

(b) Calculer les volumes réduits V’A et V’B ?
(c) Calculer les coefficients de rétention k’A et k’B ?
(d) Quelles sont les largeurs à la base des pics A et B ?
(e) Quelle est la valeur de H pour cette colonne ?
(f) Déterminer la valeur de la sélectivité α de cette séparation ?
(g) Calculer la résolution R de la séparation ?
(h) Commenter brièvement les valeurs de k’ et de R ?
Correction 1
C Volume mort :
Formule Vi = ti . D

VM = 0,5.15 = 7,5 ml,

 
D volumes de rétention V A et V B 
VA = 5.15 = 75 ml, VB = 12.15 = 180 ml

 
 

E volumes réduits V’A et V’B 

Formule V’i = t’i . D soit V’i = Vi – VM

t’A = 5 – 0,5 = 4,5 min, t’B = 12 – 0,5 = 11,5 min

V’A = 4,5.15 = 67,5 ml et V’B = 11,5.15 = 172,5 ml

Ou V’A = 75 – 7,5 = 67,5 ml et V’B = 180 – 7,5 = 172,5 ml

F coefficients de rétention k’A et k’B 
Formule tR = tM(k’+1) ou k’ = t’R/tM

k’A = 4,5/0,5 = 9 et k’B = 23

g sélectivité α
Formule α = t’B/t’A = k’B/k’A

α = 11,5/4,5 = 23/9 = 2,56

 h résolution R
 Formule R = 2 (tB – tA)/(ωB+ωA)

R = 2 (720 – 300)/ (40,8+17,0) = 14,5

 I
Pour k’ les valeurs sont élevées. Composés retenus donc temps de rétention long et surement élargissement
des pics.
Valeur de R très importante. La résolution de la séparation est très bonne, mais le compromis entre le temps
de rétention et la résolution n’est surement pas optimisé. Il est préférable de baisser le temps d’analyse et de
perdre un peu en résolution.
Un mélange de six iodures d’alkyle est séparé par chromatographie gazeuse à l’aide d’une colonne
remplie de poudre de brique réfractaire enrobée d’huile de silicone (longueur L = 365 cm). La colonne est
chauffée de telle sorte que sa température croisse linéairement durant toute l’opération. Le tableau donne
les résultats relevés.

Température Surface
Pic Identité tR (min) ω (min)
(°C) (cm2)

1 Air tM = 0,5 Petite 55 Petite

2 CH3I 6,60 0,55 100 13,0
3 C2H5I 9,82 1,00 127 12,0
4 Iso-C3H7I 11,90 1,04 139 10,0
5 n-C3H7I 13,04 1,08 148 7,2
6 CH2I2 19,10 1,60 193 2,0

(a) Calculer la résolution entre les pics 2-3, 3-4, 4-5, 5-6 ?
(b) la séparation vous convient elle ?
(c) Quelle longueur de colonne aurait il fallu pour que la résolution des pics 4 et 5 ait
été de R’ = 1,5 ?
(a) Formule R = 2 (tB – tA)/(ωB+ωA)

R2-3 = 2 (9,82-6,6)/(0,55+1) = 4,15

R3-4 = 2 (11,9-9,82)/(1+1,04) = 2,04

R4-5 = 2 (13,04-11,9)/(1,04+1,08) = 1,08

R5-6 = 2 (19,1-13,04)/(1,6+1,08) = 4,52

(b) Les pics 4 et 5 sont mal résolus.

(c) Comme R est proportionnel à √L, alors, R’/R = √(L’/L)
Ainsi, (1,5/1,08) = √(L’/365) L’ = 365.(1,5/1,08)2 = 704 cm
Le chromatogramme suivant a été obtenu pour un mélange de chaînes droites
d’hydrocarbures : CnH2n+2. Le pic M est dû à un corps non absorbé ; le pic A est celui de
C3H8 ; le pic F est celui de C20H42. La colonne mesure 120 cm de longueur et est utilisée à
température constante avec un débit de gaz de 50,0 cm3/min. On trouve les données
concernant les temps de rétention et la largeur des pics dans le tableau 12-2.