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Chromatographie

1 – Généralités

Cours TB 2008 - 2009

Introduction

- ensemble de méthodes de séparation des constituants d’un mélange

- très employées (LA méthode de séparation actuelle) parce que :

- séparation possible de n’importe quel constituant

- mise en œuvre possible à l’échelle analytique, préparative et industrielle

- seront envisagés

* des généralités : définitions de la chromatographie et classification des méthodes chromatographiques

* le principe des méthodes

* les méthodologies et applications

Chromatographie (1/2)

1 – Généralités

1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

1 1 1 - Définition

1 1 2 - Caractères généraux

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 1 - Classification selon l’état des phases

1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire

1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire

1 2 4 - Classification selon les

modalités de migration de la phase mobile

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 - Modélisation intuitive

1 3 2 - Volumes de rétention

1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution

1 4 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne

1 5 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne

2 – Principe et utilisation des méthodes de chromatographie

2

2

2

1 – Chromatographie d’adsorption 2 – Chromatographie de partage 3 – Chromatographie par

échange d’ions

2 4 – Chromatographie par gel filtration

5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

6 – Chromatographie par interactions hydrophobes

2

2

chélation (IMAC = Immobilised

metal affinity chromatography »)

2

7 – Chromatographie par

Chromatographie (2/2)

3 Méthodologie et applications

3 1 – Méthodologies

3 1 1 – Chromatographie sur colonne

A - Chromatographie en phase liquide

B - Chromatographie en phase gazeuse

3 1 2 – Chromatographie de surface

A – Méthodologie générale

B – Différence

3 2 – Applications

3 2 1 – Séparation des acides

aminés

3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC

3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC

3 2 4 – Autres applications

Chromatographie

1 – Généralités

1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

1 1 1 - Définition

Chromatographie : ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d’un mélange en utilisant deux phases non miscibles : les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'une phase stationnaire.

Commentaires :

« phase » : toute partie homogène d’un système. trois états physiques d’une phase : liquide, gazeux et solide.

Chromatographie

1 – Généralités

1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

1 1 2 - Caractères généraux

- la séparation de solutés se réalise entre deux phases :

* une phase stationnaire, par définition immobile ; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés ; affinité

quels mécanismes ? cependant, affinité pas trop importante : les solutés doivent pouvoir être

détachés

* une phase mobile qui entraîne les divers solutés

- en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile ; chromatographie = phénomène de partage généralisé

Phase Phase stationnaire mobile
Phase
Phase
stationnaire
mobile
Phase Phase stationnaire mobile
Phase
Phase
stationnaire
mobile

Schématisation

Cmo

Cst

Cst

K = ------- > 1

Cmo

Chromatographie

1 – Généralités

1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

1 1 2 - Caractères généraux

- la séparation est liée à la vitesse propre d’entraînement du soluté par la phase mobile :

* les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus d’affinité pour la phase mobile, * les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins d’affinité.

- les solutés restent ou non dans la phase stationnaire

* initialement, du point de vue historique, les solutés restaient dans la phase stationnaire ; ils étaient colorés et pouvaient être visualisés * vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu commencer à pouvoir mettre en évidence des solutés incolores par colorimétrie (utilisation de la ninhydrine) : il était possible de laisser sortir les solutés de la colonne (chromatographie d’élution).

Chromatographie

1 – Généralités

1 1 – Définition de la chromatographie : principes généraux

1 1 2 - Caractères généraux - la mise en oeuvre est possible :

- Caractères généraux - la mise en oeuvre est possible : •à l’échelle laboratoire •à l’échelle

•à l’échelle laboratoire

•à l’échelle préparative

* à l’échelle industrielle.

Chromatographie

1 – Généralités

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 1 - Classification selon l’état des phases

1 2 2 - Classification selon le principe des

interactions entre soluté et phase stationnaire

1 2 3 - Classification selon le mode

d’immobilisation de la phase stationnaire

1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile

Chromatographie

1 – Généralités

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 1 - Classification selon l’état des phases

Phase

mobile

-

Phase

station.

chromatographie liquide -

Phase mobile - Phase station. chromatographie liquide - chromatographie liquide - chromatographie gaz

chromatographie liquide -

chromatographie gaz

liquide - chromatographie liquide - chromatographie gaz Chromatographiegazsolide 2008-2009 gazeuse dgazeuse

Chromatographiegazsolide

2008-2009

gazeusedgazeuse

Chromatographie

CPL chr. phase liquide

CPG chr. phase

11

Chromatographie

1 – Généralités

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire

- ADS0RPTION : liaisons de faible énergie (liaisons polaires,

solutés à la phase stationnaire - PARTAGE : solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles;

- ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées)

- GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'EXCLUSION DIFFUSION)

- INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospécifiques (enzyme - substrat,

antigène anticorps,

(appliquées aux protéines). - INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines)

- CHELATION : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase

stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines) .

) assurant la fixation des

) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d’un ligand

Chromatographie

1 – Généralités

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 3 - Classification selon le mode d’immobilisation de la phase stationnaire

La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes :

- soit étendue sur une surface plane : chromatographie de surface

* la chromatographie sur papier

* la chromatographie sur couche mince

- soit à l'intérieur d'une colonne : chromatographie sur colonne .

phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au moyen d'un injecteur) détection des solutés (grâce à un détecteur) collection de fractions (collecteur de fractions) .

Chromatographie

1 – Généralités

1 2 - Différents types de chromatographies

1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile

A - Chromatographie par élution

Sortie des solutés de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne. ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mélange) qui réalisent la rupture différentielle des interactions entre phase stationnaire et solutés élution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilisé : force ionique, polarité par exemple soit d'une manière brusque (gradient discontinu) soit d'une manière continue (gradient continu). caractérisation des solutés dans l'éluat .

B - Chromatographie par déplacement

Maintien des solutés dans la phase stationnaire : ils se déplacent dans la phase stationnaire

c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) où on révèle les solutés encore présents dans la phase stationnaire.

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal

1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

- série de barques sans moteur sur une rivière.

- courant est supposé constant, c’est à dire qu’il est identique que l’on soit au bord de la rive ou au milieu.

- les barques transportent des passagers d’une ligne marquée « départ » à une ligne

marquée « arrivée ».

- les barques, au gré des passagers, sont susceptibles de s’arrêter sur la berge durant des temps variables.

Chromatographie

1 – Généralités

Au temps 0,

Elles

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

1 – Modèle de barques sur une rivière :

Au temps zéro

les barques attachées sur la ligne de départ

libérées en même temps, au temps zéro

la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie
la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie

Courant

Départ

Arrivée

la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie
la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie
la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie
la ligne de départ libérées en même temps, au temps zéro Courant Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

- avancée, dans le

courant, à la même vitesse

intuitive - avancée, dans le courant, à la même vitesse - différence de durée du trajet

- différence de

durée du trajet entre les lignes de départ et celle d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs.

2008-2009

Départ

Arrivée

d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs. 2008-2009 Départ Arrivée Départ Arrivée Chromatographie 18
d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs. 2008-2009 Départ Arrivée Départ Arrivée Chromatographie 18
d’arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs. 2008-2009 Départ Arrivée Départ Arrivée Chromatographie 18
Départ Arrivée Chromatographie
Départ
Arrivée
Chromatographie

18

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

Départ Arrivée
Départ
Arrivée

- temps passé à naviguer t O identique pour toutes les barques - temps départ -arrivée t R différents du fait de la durée des arrêts effectués t’ R

t R

=

t O

+

t' R

t R : temps mis par les barques pour atteindre l'arrivée

t O : temps passé à naviguer t’ R : temps des arrêts sur la rive.

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

A – Modélisation intuitive

2 – Retour à la chromatographie

barques = les différents solutés ; berge = la phase stationnaire ; la rivière = la phase mobile. t R

t R

t o

t’ R

(1)

=

+

: temps correspondant à la sortie du soluté de la colonne : temps de

rétention dans la colonne

t o

t’ R : temps passé dans la phase stationnaire.

: temps passé dans la phase mobile = temps mort

De même aucun soluté ne peut sortir avant le temps t o , temps qui correspond au transport dans la phase mobile.

t’ R est le temps de rétention réduit du temps mort, c’est à dire t R

-

t o

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

B – Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941

Liquide appauvri en soluté volatil

: Martin et Synge 1941 Liquide appauvri en soluté volatil 2008-2009 Colonne à plateau Vapeur enrichie

2008-2009

Colonne à plateau

Vapeur enrichie en soluté volatil

Colonne à plateau Vapeur enrichie en soluté volatil À chaque niveau, partage du soluté - entre

À chaque niveau, partage du soluté - entre la phase liquide et la phase gazeuse (distillation) - entre la phase stationnaire et la phase mobile

gazeuse (distillation) - entre la phase stationnaire et la phase mobile Colonne de chromatographie Chromatographie 21

Colonne de chromatographie

Chromatographie

21

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

B – Analogie chromatographie / distillation

Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941

Liquide appauvri en soluté volatil

Vapeur enrichie en soluté volatil

en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus
en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus
en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus
en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus
en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus
en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil Colonne à plateau 2008-2009 Plateaux théoriques • Plus

Colonne à plateau

2008-2009

Plateaux théoriques

Plus une colonne comporte de plateaux

(théoriques), meilleure sera la séparation

• Ou encore, plus la hauteur d’un plateau sera faible, meilleure sera la séparation

Chromatographie

22

2008-2009 Chromatographie 23

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 1 – Modélisations

B – Analogie chromatographie / distillation

Remarque : représentation schématique d’une chromatographie

distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24

2008-2009

C

distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24

0

distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24
distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24

t R

Chromatographie

distillation Remarque : représentation schématique d’une chromatographie 2008-2009 C 0 t R Chromatographie t R 24

t R

24

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal

1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 2 – Le pic de chromatographie idéal

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

séparation caractérisée par le nombre effectif de plateaux théoriques N eff . Plus ce nombre est élevé, meilleure est la séparation. On démontre que :

ou

N eff

H

t R 2

L

=

-------

=

---------

σ 2

H

=

L

/

N

avec L, longueur de la colonne (en cm) H, hauteur équivalente d’un plateau théorique (en cm) (HEPT)

1,2 1 1 Pic gaussien 0,6 σ σ σ / (8 Ln 2 ) 1/2
1,2
1
1
Pic gaussien
0,6
σ
σ
σ
/ (8 Ln 2 ) 1/2
= ϖ 1/2
0,5
ϖ 1/2
t
ϖ
R
t
R

t

2 , variance du pic (en unités de temps)

σ

2008-2009

Chromatographie

26

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

N eff peut également être calculé à partir de t R et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l’intersection des tangentes au point d’inflexion avec la ligne de base.

N eff =

16

t R 2 /

ω 2

Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 µm et une

longueur de 25 cm, on arrive à 15000 - 20000 plateaux théoriques effectifs. Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du pic à mi hauteur ω 1/2 :

Comme σ = ω 1/2

/

(8 ln 2) 1/2

N eff

=

L

---------

H

2

t R = 5,54 . ------------

ω 1/2 2

1,2 1 1 Pic gaussien 0,6 σ σ σ / (8 Ln 2) 1/2 =
1,2
1
1
Pic gaussien
0,6
σ
σ
σ
/ (8 Ln 2) 1/2
= ϖ 1/2
0,5
ϖ 1/2
t
ϖ
R
t
R

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).

H

=

A

+

B

/

H

=

2 . d P

. λ

+

2

.

τ

.

u

D M

/

u

+

+

Η : hauteur d’un plateau théorique λ : régularité du remplissage d p : diamètre des particules

τ : facteur de tortuosité

8

.

C

k’

.

.

e 2

--------------------------- .

2

.

(1

+ k’) 2

.

D S

U

u

D

M : : diffusivité de l’échantillon dans la phase mobile

D

S : : diffusivité de l’échantillon dans la phase stationnaire

k’ : facteur de capacité

e

: épaisseur de la phase stationnaire (grains)

u

: vitesse linéaire de déplacement de la phase mobile

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).

H

=

A

+

B

/

u

H

=

2 . d P

. λ

+

2

.

τ

.

D

Hauteur d’un plateau théorique

M

 

+

C

.

u

 

8

.

k’

.

e 2

/

u

+

--------------------------- .

u

2

.

(1

+ k’) 2

.

D S

Α : diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse :

diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).

H

=

A

+

Α : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente

différents entre les molécules : diffusion turbulente B / u + C B : facteur correspondant

B

/

u

+

C

B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l’analyse :

diffusion longitudinale

du liquide pendant l’analyse : diffusion longitudinale . u C : facteur correspondant à la diffusion

.

u

C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse

à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse 2008-2009 Chromatographie 30

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution

A – Efficacité de la colonne

Calculer de H à partir de l’équation de Van Deemter (CPG initialement).

H

=

A

+

B

/

u

+

C

.

u

Hauteur d’un plateau théorique

Η B/u C.u A
Η
B/u
C.u
A

u

Conclusions :

- existence d’un débit optimum pour obtenir une hauteur minimale d’un plateau théorique (nombre maximal de plateaux théoriques)

- pour éviter la diffusion (élargissement des pics), il faut grains de faible diamètre (mais pertes de charge)

importance du remplissage de la colonne.

Chromatographie

2008-2009

-

31

Chromatographie

1 – Généralités

1 3 - Étude théorique et modélisation

1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution

B – Résolution

La résolution est, pour une colonne, la capacité de

séparation de deux solutés.

V R1

-

V R2

Rs = 2 ---------------------

ω 1

+

ω 2

ϖ1 ϖ2 V R1 V R2 V R
ϖ1
ϖ2
V R1
V R2
V R

Chromatographie

1 – Généralités

1 4 – Divers temps d’une chromatographie sur colonne

- Mise en contact des solutés avec la phase stationnaire (solutés susceptibles d’être fixés et solutés non susceptibles d’être fixés) : charge de la colonne

- passage d’une phase mobile 1 : sortie de la colonne

(élution) des solutés non susceptibles d’être fixés et obtention de l’éluat 1 (filtrat)

- passage d’une phase mobile 2 : éluant vrai qui rompt

les liaisons entre soluté et phase stationnaire (élution vraie) et obtention de l’éluat 2.

V R

Chromatographie

1 – Généralités

1 5 – Divers types de mise en œuvre d’une chromatographie en phase liquide

- basse pression

- moyenne / haute pression ; actuellement

chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC)

V R

Chromatographie

2 – Principes des méthodes de chromatographie

Cours TB 2008 - 2009

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 2 – Chromatographie de partage 2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2 6 – Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 – Chromatographie par chélation

3 Méthodologie et applications

3 1 – Méthodologies

3 1 1 – Chromatographie sur colonne

A - Chromatographie en phase liquide

B - Chromatographie en phase gazeuse

3 1 2 – Chromatographie de surface

A – Méthodologie générale

B – Différence

3 2 – Applications

3 2 1 – Séparation des acides

aminés

3 2 2 – Séparation de médicaments par HPLC

3 2 3 – Séparation des protéines par FPLC

3 2 4 – Autres applications

Chromatographie

2 – Principe et utilisation des méthodes de chromatographie

2

1 – Chromatographie d’adsorption

2

1 1 − Principe : interaction

2

1 2 − Phase stationnaire

2

1 3 − Phase mobile

2

1 4 − Conditions de fixation et d’élution

2

1 5 − Utilisation

2

2 – Chromatographie de partage

2

3 – Chromatographie par échange d’ions

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2

5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2

6 – Chromatographie par interactions hydrophobes

2 7 – Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography »)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 1 1 − Principe

Fixation, en général, par des liaisons liées à la polarité

en général, par des liaisons liées à la polarité δ − Η Ο δ+ Η δ
δ − Η Ο δ+ Η δ − Ο
δ −
Η
Ο
δ+
Η
δ −
Ο

δ+

à la polarité δ − Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption

Support solide Adsorption

Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption Support solide Désorption = remplacement
Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption Support solide Désorption = remplacement
Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption Support solide Désorption = remplacement
Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption Support solide Désorption = remplacement
Η Ο δ+ Η δ − Ο δ+ Support solide Adsorption Support solide Désorption = remplacement

Support solide

Désorption = remplacement par une autre molécule

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 1 2 − Phase stationnaire,

Solide insoluble, finement divisé, "actif " (capable de fixer des solutés)

- polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont à

« activer ».

- non polaire : carbone actif

- sels de calcium : phosphate tricalcique, les protéines

hydroxyapatite pour

2 1 3 − Phase mobile

Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 1 4 − Conditions de fixation et d’élution

- Cas des liaisons polaires :

par ordre d'adsorption croissante,

esters, cétones et aldéhydes, alcools et les amines, acides et les

bases

Utilisation de gradients de solvants organiques polaires

- Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

2 1 5 − Utilisation

- utilisée pour la séparation des molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol -1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire :

* fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gêner telle ou telle méthode analytique. (phase liquide, échelle analytique)

* fixation de substances pyrogènes existant dans une solution destinée à l’usage parentéral. (phase liquide, échelle industrielle) * séparation des acides gras (méthylés) (phase gazeuse, échelle analytique).

-gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utilisés pour la séparation des protéines ; techniques concurencées par la chromatographie d’interactions hydrophobes

-
-

- mise en œuvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 1 – Chromatographie d’adsorption

 

Type

Phase stationnaire

Phase mobile

Conditions d'élution

 

Mise en œuvre et Applications

d'interaction

Fixation de solutés sur un support solide par ADSORPTION

Solide insoluble, finement divisé, "actif " capable de fixer des solutés)

polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine

-

Liquide (CPL)

- Cas des liaisons polaires :

- Sur colonne (CPL, CPG)

ou

par ordre d'adsorption

gazeuse (CPG)

Réalise la

croissante,

on a les

Sur couche mince (CCM)

-

esters, puis les cétones et aldéhydes, puis les alcools et les amines et enfin les acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate

rupture

-

Molécules

-

Liaisons

Ces supports sont à activer

des liaisons

organiques (M < 1000 g.mol -1 )

polaires (le plus souvent)

- non polaire : carbone actif

soluté -

- sels de calcium : phosphate

phase

comme

-

Liaisons non

tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines

stationnaire

 

métabolites,

polaires (cas du carbone

(phénomène de

médicaments

 

désorption)

-

Séparation

actif)

d'hydrocarbures sur carbone actif

-

Protéines :

recherche

   

(ancien)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 1 − Principe

2 2 2 − Supports

2 2 3 − Conditions de fixation et d’élution

2 2 4 − Utilisation

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 1 − Principe

Sol

2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase
2 2 – Chromatographie de partage 2 2 1 − Principe Sol Sol Support solide Phase

Sol

Support

solide

Phase

Phase

stationnaire

mobile

phases

normales

phases

inverses

Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide)

Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide)

Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un support solide

phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

φ

Solubilisation dans une

Liquide polaire : eau, par exemple

Solvants

Gradient de polarité croissante

Sur colonne (CPL, CPG)

-

organiques

n

phase liquide

 

peu polaires

 

-

Sur couche mince

o

(adsorbée sur un

(CCM)

r

support

-

Petites molécules

m

solide)

polaires comme les acides aminés

a

l

 

e

s

φ

Solubilisation dans une

- Liquide apolaire plus ou moins visqueux - Chaînes hydrocarbonées en C 8, C16, C18,

Solvants organiques plus polaires que la phase stationnaire

Gradient de polarité décroissante

-

Sur colonne (CPL,

CLHP)

i

phase liquide adsorbée

phényl, …fixées sur de billes de silice,

-

Petites molécules apolaires, comme des dérivés d'acides aminés

n

sur un support ou

agarose, résine ou verre

v

radicaux hydrophobes

 

e

fixés sur un support

 

r

solide

s

e

s

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 2 − Supports

- terme "support" à préciser : matériau inerte qui sert de fixateur (inerte) à la phase stationnaire liquide. Il permet à cette phase stationnaire d’être en un état physique liquide. =support à bien distinguer ici de la phase stationnaire.

- supports = solides finement divisés qui présentent une très grande surface, ceci afin de retenir dans un petit volume une grande quantité de phase liquide ; rétention énergique de phase stationnaire, sans interaction avec les solutés ; les propriétés d’adsorption doivent être totalement masquées.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 2 − Supports

- utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie d’adsorption sous forme poreuse ou pelliculaire.

gel de silice très souvent employé car peut retenir jusqu’à 70 % de son poids d’eau ; grande capacité et bonne rétention des solvants mais garde certaines propriétés d’adsorption Terre de diatomées, autre support siliceux, naturel (squelette siliceux d’infusoires ou Kieselguhr ou célite) ; peut retenir de grandes quantités de solvant, même polaires.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 2 − Supports

- billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire l’objet de greffage de groupements fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : réalisation d’une « silanation », c’est à dire traitement par des dérivés permettant la fixation de groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses.

- sont également utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du vinylbenzène.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

A - Les phases stationnaires

1 - Chromatographie en phases normales

-phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnées, de méthanol ou d’éthanol - simplement eau, - aussi de substances visqueuses :

étheroxydes rendus très polaires par la présence de groupements hydroxyles ou nitrile :

éthers, glycols, polyéthylène glycols, ββ‘ oxydipropionitrile.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

A - Les phases stationnaires

2 - Chromatographie en phases inverses

- phase stationnaire peu polaire ou apolaire

-chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de silicones, de carbures saturés ;

-
-

chromatographie en phase liquide : chaînes alkyles en C 8 et C 18 greffées sur de la silice

- d’une manière générale, phases stationnaires préparées par imprégnation (par exemple, en présence de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des dérivés halogénés du silane).

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

B - Les phases mobiles

Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles - choix et conditions d’emploi d’une

- choix et conditions d’emploi d’une phase mobile : mêmes considérations générales que celles de la chromatographie d’adsorption. :

- pouvoir solvant et inertie chimique vis à vis des solutés

- compatibilité avec les systèmes de détection

- inertie chimique et insolubilité vis à vis de la phase stationnaire

et insolubilité vis à vis de la phase stationnaire - Attention : une non miscibilité rigoureuse

- Attention : une non miscibilité rigoureuse difficile à obtenir : saturation des phases les unes dans les autres par des contacts préalables :

mélange des solvants dans une ampoule à décanter et séparation ultérieure.ou, en CLHP, passage du solvant dans une précolonne, avant le système d’injection, chargée de phase stationnaire.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 3 − Les phases stationnaires et mobiles

B - Les phases mobiles

Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles - En chromatographie de partage phases

-En chromatographie de partage phases normales, phase stationnaire = eau et

phase mobile

= butanol, d’alcool benzylique, de chloroforme ou de

toluène.

En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionnés de chloroforme), dichlorométhane, tétrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol.

dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol. - En chromatographie en phases inversées , phase mobile

- En chromatographie en phases inversées, phase mobile (plus) polaire = eau, méthanol (CH 3 -OH), acétonitrile (CH 3 -CN) ou mélange de ces solvants.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 2 – Chromatographie de partage

2 2 4 − Utilisation

- utilisée sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse.

- sert à la séparation de molécules organiques de masse moléculaire inférieure à

1000 g.mol -1

- séparation d’antibiotiques, des substances anticancéreuses, des métabolites, de

substances prohibées (drogues, substances « dopantes »,

- Phases normales (composés polaires)ou phases inverses (composés plus hydrophobes)

- Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires d’ions (voir plus loin)

…)

R

R

+ 1
+
1

2

+

−

R 3

paires d’ions (voir plus loin) …) R R + 1 2 + − R 3 R

R

4

R R +− 3 1 R R 4 2
R
R
+−
3
1
R
R
4
2

2008-2009

Échantillon moins hydrophobe Chromatographie

Complexe hydrophobe

54

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 1 − Principe

2 3 2 − Supports

2 3 3 − Conditions de fixation et d’élutions

2 3 4 − Utilisation

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 1 − Principe

- solutés liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques

liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques phase stationnaire = macromolécules échangeuses

phase stationnaire = macromolécules échangeuses d'ions, solide

-phase mobile

= tampon de pH et de force ionique définis :

fait cesser les interactions entre solutés et phase stationnaire

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 1 − Principe

Mélange à séparer

− − − + + − − + + + + + − + +
+ +
+
+ + +
+
+ +
+
+
+ + +
+
+

Support (Su)

Groupement charge ici positiveπορτευρ δε

Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε

(δσορπτιον)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 1 − Principe

− − − + + − − + + + + + − + +
+ +
+
+ + +
+
− + +
+
+
+ +
+ +
+
+ + + − + + + + − + + + + + − −
+ + + − + + + + − + + + + + − −
− − − − − + − − + + + + − − +
+
+ +
+ +
+
+
+
+ + + +
− +
+
+ + − − + + + + − − + − + − − −
+ + − − + + + + − − + − + − − −
+ + − − + + + + − − + − + − − −

Μλανγε ◊ σπαρερ αυ χονταχτ δε λα πηασε στατιονναιρε

Φιξατιον δε λα προτινε

(↔ αδσορπτιον ≈) αυ σενσ

λαργε

αδσορπτιον ≈) αυ σενσ λ α ρ γ ε − − − − − − −
αδσορπτιον ≈) αυ σενσ λ α ρ γ ε − − − − − − −
− − − − − − − − − − −
− −

Λιβρατιον δε λα πηασε σολιδε

(δσορπτιον) par augmentation du pH

Chromatographie

2

– Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs

Selon le type de charge de l’ion échangé, et la charge de l’échangeur, on distingue :

- échangeurs d’anions

- échangeurs de cations.

1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique

Su-A + Ye -

support chargé +

+

Xs -

soluté

Ye - = contre ion

<====>

Su-A + Xe -

soluté fixé

+

Ys -

Chromatographie

2

– Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs

1 -

les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique

Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive :

en général d’amines I, II, III, IV groupements les plus classiques pour les protéines : groupements DEAE et TEAE. - CH 2 - CH 3

DEAE,

Su O- CH 2 - CH 2 - N

- CH 2 - CH 3 (échangeur faible, non ionisé à certains pH, pH acides)

 

- CH 2 - CH 3

pK A = 9,5

- CH 2 - CH 3

Su O- CH 2 - CH 2 - N

- CH 2 - CH 3

+

H+

<=====> S O- CH 2 - CH 2 - N + - H - CH 2 - CH 3

- CH 2 - CH 3 Su O- CH 2 - CH 2 - N + - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 (échangeur fort, ionisé à tous les pH)

TEAE,

2008-2009

Chromatographie

60

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs

2 - Les échangeurs de cations, sous forme anionique

Su-A - Ye +

+

support chargé -

Xs +

soluté

Ye + = contre ion

<==========>

Su-A - Xe +

soluté fixé

+

Ys +

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

ECH

Fixation de solutés par des liaisons ioniques

Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, …), synthétiques

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et de µ donnés variant lors de l'élution

Gradient de pH (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu)

-

Sur colonne (CPL,

ANG

CLHP)

 

E

entre charges opposées (faiblement énergétique)

(polyacrylamide, résines, …) ou minéraux (verre, silice, …) avec greffage de groupements ionisés ou ionisables échangeant des anions ou des cations

-

Séparation d'ions (acides

D'IO

 

aminés, …) et de

NS

macroions (protéines,

 

acides

nucléiques, …)

- Anions : DEAE, AE, …

   

- Cations : CM, SP, …

2008-2009

Chromatographie

62

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs

2 - les échangeurs de cations, sous forme anionique

Exemples de groupements fonctionnels : -SO 3 -, - COO - , SP, CM

SP

: sulfopropyle

Su

- CH 2 - CH 2 - CH 2 -SO 3 -

CM

carboxyméthyle

Su - CH 2 – COO-

Remarque : certains échangeurs avec les 2 types.(en particulier pour la désionisation de l’eau)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 2 − La phase stationnaire : les échangeurs d’ions

B - Les supports

1 - Supports organiques

a - Polymères synthétiques

b - Polymères naturels

α - Dérivés du dextrane

ß - Dérivés de la cellulose γ - Dérivés de l’agarose

δ - Dérivés mixtes

2 - Supports minéraux

Document

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 3 − Conditions de fixation et d’élutions

A - Fixation

- choix de la nature (forme anionique ou cationique) de l’échangeur utilisé

- pH tel que les solutés se fixent

- fixation en présence d’un tampon de faible force ionique

B - Elution

- modification des interactions électrostatiques entre soluté et phase stationnaire :

changement de pH et/ou de force ionique.

- en discontinu ou en continu.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 3 – Chromatographie par échange d’ions

2 3 4 − Utilisation

- utilisée pour la séparation de toutes substances porteuses de charges électriques (acides aminé, protéines, …)

-
-

particulièrement important pour les protéines (supports hydrophiles).

Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006 67
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006
Extraction - purification des enzymes
2005 - 2006

Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations)

Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d’anions)

CM

DEAE

68

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 1 − Principe

2 1 2 − Supports

2 1 3 − Conditions de fixation et d’élutions

2 1 4 − Utilisation

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

- également appelée chromatographie de perméation de gel, chromatographie d'exclusion - diffusion

- origine :

mise sur le marché d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement réticulé, le SEPHADEX TR , suite aux travaux en 1959 par PORATH et FLORKIN.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

 

Type d'interaction

Phase stationnaire

Phase mobile

Conditions d'élution

 

Mise en œuvre et Applications

GEL

ABSENCE d'interactions au sens strict Diffusion plus ou moins grande dans un support poreux : les molécules les plus grosses sont éluées les premières

Liquide contenu dans les billes poreuses dont la matière constitue le support Les supports sont des composés organiques naturels (dextrane, agarose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou des composés minéraux (verre ou silice)

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et µ donnés

Simple percolation de la colonne par un tampon adéquat, sans modification au cours de l'élution (élution isocratique)

Sur colonne (CPL, CLHP)

-

FILT

RAT

- Séparation de macromolécules (ADN, protéines, …) selon leur taille - Détermination de M par

ION

     

la

représentation :

K

av = - log M + b

2008-2009

Chromatographie

71

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 1 − Principe

- pas de liaison entre soluté et phase stationnaire = pas, ici, de "rétention«

- comportement différent des molécules du fait de leur diffusion ou non à

l’intérieur d’une matrice poreuse = tamisage moléculaire inverse dans un gel

= sortie en premier des grosses molécules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les petites qui ont diffusé = SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande

Remarques : .

- séparation selon la taille des molécules d’un type de forme déterminé (en général forme globulaire)

- possibilité de déterminer les masses moléculaires.

2008-2009 Chromatographie 73

v e

v o

v t

v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74
v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 1 − Principe

A - La phase stationnaire

- constituée de grains de gel pourvus de pores de diamètres variables, ceci dans une gamme permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées.

- pores de plus faible diamètre (diamètre minimal)

- pores de plus grand diamètre (diamètre maximal)

- ensemble de pores de diamètres intermédiaires

-
-

un support de gel filtration ne permet la séparation que dans une gamme déterminée de masses moléculaires.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 1 − Principe

B -La phase mobile :

- ne fait pas cesser des interactions entre solutés et phase stationnaire qui n’existent pas

-
-

rôle : simplement à assurer le déplacement linéaire des solutés .

-simple liquide qui passe à travers la phase stationnaire

= liquide qui permet de garder les molécules dans leur état natif, c’est à dire d’un simple tampon dans le cas des protéines

Copie

2008-2009

Chromatographie

76

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 2 − Supports

- par définition, poreux

conditionnés sous forme de billes , pour faciliter le passage de la phase mobile, c’est à dire diminuer les billes, pour faciliter le passage de la phase mobile, c’est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage

peuvent être organiques, minéraux ou mixtes.mobile, c’est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage Documents 2008-2009 Chromatographie

Documents

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de séparation A - Description schématique du phénomène

Supposons le gel immobilisé dans une colonne. Le comportement des solutés se divise en 3 classes de comportements :

1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire

molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Il y a pour chaque gel

Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse moléculaire :

- en dessous duquel il n'y a aucune séparation

- au dessus duquel il n'y a aucune séparation

- la séparation ne se réalise que dans un domaine de masse moléculaire spécifique

du gel considéré (en fait, il correspond au diamètre maximum (moyen) et minimum (moyen) des

pores).

Mélange initial

Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les
Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les
Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les
Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les
CONSTITUANTS NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les

CONSTITUANTS NON SEPARES

1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion :

Seule séparation

molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Seule séparation 2008-2009 Chromatographie 81
molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Seule séparation 2008-2009 Chromatographie 81
molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Seule séparation 2008-2009 Chromatographie 81

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

1 - Les divers volumes

a – Description : définition des divers volumes

α - Vo : volume mort Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel ß - Vt : volume total de la colonne Vt = volume du soluté correspondant à la percolation totale de la colonne (extérieur et intérieur des billes) γ - Ve : volume d'élution ; valeur intermédiaire entre vo et vt

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

1 - Les divers volumes

b – Interprétation de ces divers volumes

Vo : volume entre les grains Ve : volume d'élution de la substance étudiée V T : volume total, c’est à dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg, volume et volume de liquide dans les grains Vs. REMARQUES :

- Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractères généraux) - Vo et VT sont caractéristiques d’une colonne remplie d’une phase stationnaire donnée, percolée avec une phase mobile à un débit donné ; il y a changement de ces divers volumes caractéristiques d'une colonne selon les conditions : débit de phase mobile, pression, phase mobile, température……d’où nécessité de l’utilisation d’un paramètre caractérisant la diffusion d’un soluté indépendamment de ces conditions ce sera K D .

Approche de la valeur de V s à partir de l’expression du volume total de la colonne

V t

= V o

+

V s

+

V g

V s V g Vo
V s
V g
Vo

v e

v o

v t

CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
CONSTITUANTS
NON SEPARES
o v t CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 -

1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion :

Séparation

petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation 2008-2009 Chromatographie 85
petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation 2008-2009 Chromatographie 85
petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation 2008-2009 Chromatographie 85

Chromatographie

2

– Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

2 - Le coefficient de diffusion K D , le coefficient de diffusion accessible : K av

a - Le coefficient de diffusion K D

α - Définition du coefficient de diffusion K D

coefficient de diffusion K D d’un soluté :

rapport du volume de soluté supérieur à V o (soit V e - V o ) sur le volume contenu dans les grains V s .

K D

=

V e

-

V o

----------------

V s

Chromatographie

2

– Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

a - Le coefficient de diffusion K D ß - Propriétés du coefficient de diffusion
a - Le coefficient de diffusion K D
ß - Propriétés du coefficient de diffusion
On démontre que K D
=
ß
-
α
.
log MM ,
d’où
K
D
1
0
Log MM
K D 1 0
K
D
1
0

Log MM

Mais ceci concerne K D et log MM, avec

K D

=

V e

-

V o

----------------

V s

Or, pour déterminer K D , il faut connaître V s . ……… ce qui n’est pas le cas ………

d’où une approche de la valeur de V s , par exemple, à partir de l’expression du volume total de la colonne

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

b - Le coefficient de diffusion accessible K AV

V t

= V o

+

V s

+

V g

d’où V s = V t - V o - V g Or V g est négligeable. On peut donc admettre que

V s = V t - V o

détermination du coefficient de diffusion; alors appelé

coefficient de diffusion accessible

Kav (available = accessible)

K av

=

V e

-

V o

---------------

V t

-

V o

v v o v e v t Log kDa K av -2009 Chromatographie 90 Copie
v
v o
v e
v t
Log kDa
K
av
-2009
Chromatographie
90
Copie

Courbes théoriques Courbes expérimentales

K log MM AV 1 0 log MM et Log MM = -
K
log MM
AV
1
0
log MM
et
Log MM
=
-
0 1 K AV c . + d V e
0
1
K AV
c
.
+
d
V e

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 3 − Conditions de fixation et d’élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires

c - Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration

diverses opérations à réaliser :

- Détermination de V o et V t avec des substances appropriées

- Passage de substances étalons (dans de domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe

- passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe

Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 1/2
Détermination de masse moléculaire par chromatographie
de gel filtration 1/2

1 - Détermination de v o et v t avec des substances appropriées

de v o et v t avec des substances appropriées 2 - Passage de substances étalons
de v o et v t avec des substances appropriées 2 - Passage de substances étalons
de v o et v t avec des substances appropriées 2 - Passage de substances étalons

2 - Passage de substances étalons (dans le domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe

des calculs de K a v ; construction de la courbe K av Calcul des K

K av

Calcul des K av
Calcul des K av
des calculs de K a v ; construction de la courbe K av Calcul des K
des calculs de K a v ; construction de la courbe K av Calcul des K

Copie

2008-2009

Chromatographie

des calculs de K a v ; construction de la courbe K av Calcul des K

Log kDa

93

Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 2 / 2
Détermination de masse moléculaire par chromatographie
de gel filtration 2 / 2

3 - Passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe

à analyser ; calcul de K a v et report sur la courbe Calcul du K
à analyser ; calcul de K a v et report sur la courbe Calcul du K
à analyser ; calcul de K a v et report sur la courbe Calcul du K
Calcul du K av
Calcul du K av

Copie

2008-2009

Chromatographie

K

K

av

av

de K a v et report sur la courbe Calcul du K av Copie 2008-2009 Chromatographie

Log kDa X

Log kDa

94

Expérience de dessalage
Expérience de dessalage
Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006 96

Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006

96

Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006 97

Extraction - purification des enzymes 2005 - 2006

97

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 4 – Chromatographie par gel filtration

2 4 4 − Utilisation

- initialement développée pour la séparation des protéines • séparation • détermination de la masse moléculaire, en concurrence avec l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant

-
-

dessalage des solutions protéiques

- concentration des solutions protéiques (en batch).

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

(chromatographie d’affinité)

2 5 1 − Principe A - Généralités

d’affinité) 2 5 1 − Principe A - Généralités - condition sine qua non : soluté

- condition sine qua non : soluté à séparer (protéine) capable de se fixer réversiblement à un ligand spécifique qui est attaché à une matrice insoluble.

M

Macro-

molécule

+

L

Ligand

attaché à

la matrice

<=====

M L

Complexe

- nécessite une connaissance préliminaire détaillée de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

(chromatographie d’affinité)

2 5 1 − Principe A - Généralités

M

+

K A

=

L

<=====

(M L)

-----------------

.

(M)

(L)

M L

( RL)/(L)

K A n (P)

L) ----------------- . (M) (L) M L ( RL)/(L) K A n (P) n (P) (RL)
L) ----------------- . (M) (L) M L ( RL)/(L) K A n (P) n (P) (RL)
L) ----------------- . (M) (L) M L ( RL)/(L) K A n (P) n (P) (RL)

n (P)

(RL)

- valeurs de K A comprises ici entre 10 5 et 10 8 M -1

- détermination de K A la méthodologie de Scatchard

-

( RL)/(L) =

K A n (P) - K A (RL)

Mélange à séparer au contact de la phase stationnaire Fixation spécifique de la protéine («
Mélange à séparer au contact de la phase stationnaire
Mélange à séparer au
contact de la phase
stationnaire

Fixation spécifique de la protéine

(« adsorption ») au sens large

101
101

Libération de la phase solide (désorption)

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

(chromatographie d’affinité)

Type d'interaction

Phase stationnaire

Phase mobile

Conditions d'élution

Mise en œuvre et Applications

- Fixation des solutés par des interactions spécifiques avec un ligand fixé par covalence sur un support solide

- Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, …), synthétiques (polyacrylamide, résines, …) ou minéraux (verre, silice, …) avec greffage d'un ligand par covalence - Exemples de ligands (classiquement de

Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, …) de pH et µ donnés. Variation au cours de l'élution et / ou tampon contenant une substance à plus forte affinité pour le ligand

- Gradient de pH (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu) - Gradient de ligand de meilleure affinité

- Sur colonne (CPL, CLHP) - Exemples d'application :

interaction enzyme - substrat, antigène - anticorps, hormone - récepteur, … Très efficace lors de la purification des enzymes

- Interactions protéine - ligand caractérisée par la constante de dissociation "K D"

petites molécules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP, arginine, bleu Cibacron, calmoduline, polyU, protéine A, protéine G, …

2008-2009

Chromatographie

102

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2 5 1 − Principe

B – La phase stationnaire

2 5 1 − Principe B – La phase stationnaire - Support (solide) sur lequel est

- Support (solide) sur lequel est fixé un ligand par une liaison solide, une liaison covalente

C – La phase mobile

- Tampon faisant diminuer les interactions entre solutés et phase stationnaire (ligand) ou contenant un ligand ayant davantage d’affinité pour le soluté macromoléculaire.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2 5 2 − La phase stationnaire A – Le support

* propriétés de la matrice idéale pour la chromatographie d’interactions biospécifiques :

- posséder les groupements chimiques permettant la fixation covalente du

ligand et être stable dans les conditions de cette fixation

- interagir faiblement avec les autres macromolécules pour minimiser les adsorptions non spécifiques - posséder de bonnes propriétés de flux.

* En pratique, particules sphériques, uniformes, et rigides :

- les dextranes réticulés (SEPHACRYL S)

- l'agarose (SEPHAROSE, BIO - GEL A)

- les gels de polyacrylamide (BIO - GELS P)

- le polystyrène(BIO - BEADS S)

- la cellulose

- le verre poreux et la silice.

Chromatographie

2 – Principe des méthodes de chromatographie

2 5 – Chromatographie par interactions biospécifiques

2 5 2 − Les supports B – Le ligand

1 - Généralités : choix du ligand

- nature chimique du ligand déterminée par la connaissance préliminaire de la spécificité biologique du composé à purifier.

- fréquemment possible de sélectionner un ligand qui montre une spécificité absolue

- D'un autre coté, possible de sélectionner un ligand qui présente une

sélectivité de groupe : il fixe des composés qui possèdent une spécificité chimique déterminée :

Exemple : AMP 5' qui peut fixer réversiblement beaucoup de deshydrogénases à NAD <