Techniques dtudes

de la cellule

Dr. Roger OUROUDA

PLAN
Imagerie cellulaire (microscopie)
Isolement et culture des cellules
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

PLAN
Imagerie cellulaire (microscopie)
Isolement et culture des cellules
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe/contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

Microscopes

Imagerie cellulaire Microscopie

Pouvoir de rsolution
Taille relative des cellules et de leurs composants

Petite
mol
molcule

Virus

Bact
Bactrie

Cellule
animale

Cellule
vgtale

microscope lectronique
microscope optique

Limite de rsolution:
Oeil nu: 300m (10-6m)
Microscope optique: 200nm (10-9m)
Microscope lectronique: 100pm (10-12m)

1- Microscopie optique

1- Microscopie optique

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe/contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

1- Microscopie optique : lumire directe/contraste de phase

Cellules vivantes

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe/contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

1- Microscopie optique- Fluorescence

Fluorescence
- Elle peut avoir plusieurs origines :
naturelle : ex: chlorophylle
utilisation de substance fluorescente se fixant
spcifiquement sur une structure (Ex: DAPI sur ADN ;bleu)

DAPI

Cellules CHO

Fluorescence
utilisation de fluorescente substance non spcifique
naturelle, comme la fluorescine ou la rhodamine, fixe
un anticorps spcifique dun antigne. Spcificit due
lanticorps

Fluorescence (cellule vivante)

Protine chimre (ex: GFP) naturellement fluorescente

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe
contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
balayage (MEB)
transmission (MET)

1- Microscopie optique- microscopie confocale

1- Microscopie optique- microscopie confocale

Microscopie optique
Profondeur de la
collecte de la lumiere

Microscopie confocal
Profondeur de la
collecte de la lumiere

Profondeur du foyer

Surface

Observation
au microscope optique

Surface

Observation
au microscope confocal

Microscopie confocale

Z4

Z3

Z2

Z1

Z4
Z3
Z2
Z1

Microscope confocal

Microscopie confocale

Microscopie fluorescence

1- Microscopie optique - Microscopie confocale fluorescence

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe
contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe
contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

Imagerie cellulaire - Microscopie

1- Microscope optique
lumire directe
contraste de phase
fluorescence
confocal fluorescence

2- Microscope lectronique
transmission (MET)
balayage (MEB)

1- Microscopie lectronique

1- Microscopie lectronique

http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html

www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.

http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html

en.wikipedia.org/wiki/Immune_system.

www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.

Microscopie

Rsum
Microscopie optique Microscopie lectronique
Faisceau de lumire

Faisceau lectronique

Lentilles optiques

Lentilles lectromagntiques

Rsolution 0,2m

Rsolution 0,2nm

Traditionnel
Cellules vivantes
ou non vivantes

Fluorescence

lectronique
transmission
(MET)

lectronique
balayage
(MEB)

Protines
fluorescentes

Cellules
vivantes

Cellules
non vivantes

Cellules non vivantes

PLAN
Imagerie cellulaire (microscopie)
Isolement et culture des cellules
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

ISOLEMENT ET CULTURE
DES CELLULES
Isolement partir dun tissu
Isolement partir de sang
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

Culture cellulaire
Fragment
tissulaire
Les cellules sont mises dans
un flacon rempli de milieu nutritif

Suspension de cellules
CULTURE PRIMAIRE
Prolifration des cellules
jusqu confluence

Cellules rcoltes et
transfres dans un nouveau flacon

Passage
CULTURE SECONDAIRE

1. Isolement et culture cellulaire

partir d un tissu
Collag nase H

Tampon cordon

Cordon ombilical

HUVECs Passage 0 (P0):

culture primaire

Canules

HUVECs Passage 1 (P1): culture secondaire)

Cellules endoth liales

Cellules HeLa (Henrietta Lacks)

(cellules immortalises drives de cellules dun cancer cervical)
Contraste de phase

www.microscopyu.com

ISOLEMENT ET CULTURE
DES CELLULES
Isolement partir dun tissu
Isolement partir de sang
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

Isolement partir de sang

Sang hparin
Centrifugation
Surnageant = plasma

Culot = cellules

Remise en suspension

Sparation

PLAN
Imagerie cellulaire (microscopie)
Isolement et culture des cellules
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

Cytomtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux
(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)

Cytomtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux
(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)

Cytomtrie en flux

BD biosciences

Cytomtrie en flux

Cytomtrie en flux

Detecteur Forward scatter

(FS)

Detecteur Side scatter

(SC)

Source
de lumire

Detecteur Side scatter

(SC)

9 Forward Scatter (FS) est proportionnel la taille de la cellule

9 Side Scatter (SC) est proportionnel la complexit de la cellule (granulosit)
biology.berkeley.edu

Cytomtrie en flux

Sang total lys

Neutrophiles
Monocytes

(FS)

Lymphocytes

(SC)

Cytomtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux
(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)

Cytofluorimtrie en flux

Antignes

PE

FITC

Anticorps spcifiques

Cytofluorimtrie en flux
Histogramme 2 Paramtres

-+

++

Population
positive
(PE+)

PE FL

Population
doublement
positive
(FITC+, PE+)

-- +-

Population
Ngative

Population
positive (FITC+)

FITC FL

Cytofluorimtrie en flux - Application

Etude du cycle cellulaire

M
G1
Contenu en ADN

G2
S

4n

2n

G2+M

G1

G1

Iodide de propidium sintercale entre les

paires de bases et se lie lADN double brin

http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cylchred.png

Cytomtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux
(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)

Tri cellulaire par

Cytofluorimtrie en flux

Cytomtrie en flux

Tri cellulaire par

cytofluorimtrie en flux

Tri cellulaire par

Cytofluorimtrie en flux

Domaines utilisant la cytomtrie en flux

- Diagnostic in vitro
- Transplantation/Transfusion
- Qualit contrle pour thrapie cellulaire

- Fonction immune
- Cancer
- Biologie molculaire

Recherche

Clinique

Pharmacologie

Industrie

- Identification et validation de composs

- Etude de safety de mdicaments
- Dcouverte de biomarqueurs

- Environnement
- Agriculture

PLAN
Imagerie cellulaire (microscopie)
Isolement et culture des cellules
Cytomtrie en flux
Exploration molculaire

Exploration molculaire

Fractionnement subcellulaire
Techniques danalyse de lADN, des ARN
et des protines

Cellule eucaryotique

Sparation des organites

Par centrifugation diffrentielle

Par gradient de densit

Sparation des organites: Centrifugation diffrentielle

Sparation des organites

Gradient de densit

Exploration molculaire

Fractionnement subcellulaire
Techniques danalyse de lADN, des ARN
et des protines

La chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

1
2
3
4

:
:
:
:

Dpt d'un mlange de deux molcules

Les petites molcules
Les grosses molcules
Les petites molcules sont lues

La chromatographie d'affinit
Prsence de groupements d'atomes
formant des sites particuliers : Ac-Ag, Enz-substrat

La chromatographie de paires d'ions

La chromatographie : Types

Charge lectrique
changeuse danions(+)

changeuse de cations(-)

Ex: Amine tertiaire,

Ex : Carboxyle coo-,
DEAE (dithylaminothyle) Phosphate Po4-